基中加入琼脂，12rC高压灭菌20min，冷却至6(TC左右，用吸 管准确吸取15mL培养基加入无菌培养皿中（下层），待其凝固。另取100 μ L试验菌株的菌 液（菌浓度1. 5Χ 105C即/血）和lOmL该培养基（冷却至5(TC左右）充分混匀，加到已凝固 的培养基上（上层），然后用无菌綴子将无菌牛津杯轻轻放入培养皿中，待其凝固。然后在 牛津杯中加入待测酶液50 μ以37°C培养24h，测量抑菌圈直径。
[0106] 按照同样方法，测定购买的某品牌人源溶菌酶的抑菌圈直径，作为阳性对照；用无 菌生理盐水作为阴性对照。
[0107] 3. 4. 3微量肉汤稀释法检测的MIC及MBC
[0108] 采用96孔板，利用微量肉汤稀释法测定h-LYZ对9种检测菌株的MIC和MBC，并W 某品牌人源溶菌酶作标准对照。
[0109] 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度（128、64、32、16、8、4、2、1、0. 5、0. 25、0. 125μ g/ mL)的h-L^溶液分别加到灭菌的96孔聚苯己帰板中，第1至第11孔加药液，每孔10 μ L ; 第12孔不加 h-LYZ溶液，作为生长对照。用ΜΗ液体培养基稀释待测菌至浓度为0. 5麦氏 比浊，即1.5X10?FU/mレ经MH肉汤l:1000 稀释后，向每孔中加100μL。37°C培养18~ 2地。用同样方法测定某品牌人源溶菌酶的MIC和MBC，W此作为对照。实验平行重复Η次。
[0110] MIC判定；96孔板中出现弥散浑浊、底部有沉淀的为细菌生长指标，肉眼可见细菌 生长的最低质量浓度为h-LYZ的最小抑菌浓度MIC。
[01U] MBC判定；先测出MIC,再依次将未见细菌生长的孔中吸出培养液100 μ L涂布到 普通琼脂平板中，37Γ培养18~24h后计数菌落，平板上菌落数巧个的培养孔质量浓度即 为的最小杀菌浓度MBC。
[0112] 实施例1发酵液中h-LYZ的分离纯化结果
[0113] 含重组人源C-型溶菌酶的发酵液进行离必、过滤等前处理后，经过Bestarose MMC Diamond柱一步纯化，人源溶菌酶产品即可达到电泳纯（图4)。Bestarose MMC Diamond洗 脱样品经过缓冲液置换后，使用SP Bestarose FF柱进行浓缩，最终样品浓度约为27mg/血。 纯化过程中，每一步骤11寸￥2的收率分别为92.67%、91.9%和94.68%(表3.1)，目的蛋白 总收率为80. 63%，纯化倍数达15倍。
[0114] 表3. 1纯化过程中h-LYZ的收率 [011 引
[0116] SDS-PAGE凝胶电泳和HPLC进行纯度鉴定结果，反相C8色谱柱采用己氯梯度，结果 为单一峰（图5)，SDS-PAGE凝胶电泳经激光灰度扫描仪测定纯度大于99%。对浓缩后的 人源溶菌酶样品进行冻干（图6)，冻干后的h-LYZ活性为120, OOOU/mg，每瓶含量lOOmg。
[0117] 实施例2Km值测定结果
[0118] 反应初速率与微球菌底物浓度按照Lineweaver-Burk双倒数法作图，结果见图7。 将直线延长，得到-(1/Km) = -43,根据Km值的定义，当酶促反应达到最大速度Vm -半时的 底物浓度，得到Km = 0. 0233g/mL。
[0119] 实施例3酶的最适抑值
[0120] 当磯酸缓冲体系的抑值大于7. 0时显著影响人源溶菌酶的活性，酶活大大降低， 抑值在5. 8~6. 4之间时，酶活相对稳定；当抑在6. 0时，酶活性最高为93000U/mg。
[012。 实施例4抑稳定性
[012引从图9可W看出，本产品的耐酸性较强，抑在5. 8~6. 4之间，37°C赔育一小时后 仍保持着80% W上的活力，说明该酶在偏酸性范围内的稳定性较好。
[0123] 实施例4酶的最适温度
[0124] 在15°C~65°C条件下，人源溶菌酶酶活随温度的升高先增加后减少，在45°C时人 源溶菌酶的酶活达到峰值，活性102000U/mg，说明45°C是该酶最适作用温度。
[0125] 实施例5热稳定性
[0126] 如图11所示，该人源溶菌酶在不同的温度下耐热性有所不同，3(TC~6(TC赔育一 小时后，酶活下降趋势不明显，酶活下降20 %左右；7(TC条件下，人源溶菌酶活力仅存30 %; 但是9(TC赔育1小时后，酶活仍有60 %，10(TC赔育1小时后，仍有20 %的原酶活性，实验结 果说明了本工程人源溶菌酶具有很好的耐热性能。
[0127] 实施例6金属离子对酶活力的影响
[012引如图12所示，配制一系列不同种类的金属离子溶液，终浓度为0.0 lmol/L时测定 酶活力，结果表明，Na\ Mn2\化2\ Mg2\ Κ\ Ca2+离子不同程度促进h-L^的活性，促进程度： 化+ > Mg2+ > Fe2+ > r > Mn2+ > Ca2+ 抽2\ Ba2\ CiA c02+ 抑制 h-LYZ 的活性，抑制程度： 化2+ > 化2+ > 8日2+ > c02+。
[0129] 实施例7添加剂对酶活力的影响
[0130] 配制不同的添加剂溶液，终浓度为0.0 lmol/L时测定酶活力，结果如图13所示，除 了邸TA能够促进h-LYZ活性外，其余均对其活性产生抑制作用。
[0131] 实施例8本发明与目前溶菌酶纯化工艺比较
[0132] 目前主要关于人源溶菌酶的分离纯化方法及其优缺点如下表所示：
[0133]
[0134] 本发明建立了用复合型阳离子交换介质分离纯化发酵液中人源溶菌酶的新工艺。 发酵液经离必、过滤处理后无需稀释可直接上柱纯化，经一步纯化目的蛋白即达到电泳纯， HPLC检测终产品为单一峰。整个工艺周期短、收率高，易于线性放大至生产规模。
[0135] 实施例9本发明的人源C-型溶菌酶蛋白与某品牌人源溶菌酶的比较
[0136] 本实验表达的人源C-型溶菌酶蛋白的表达量最高为1.65g/l，比活最高为 160, OOOU/mg，产品纯度>99%。蛋白的产量和产品的纯度均为最高。
[0137] 下表是市场上销售的某品牌人源溶菌酶与本产品的比较结果。
[013 引
【主权项】
1. 一种人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，该人源溶菌酶蛋白纯化方法包括以下 步骤： 1) 发酵液的前处理； 2. Bestarose MMC Diamond 捕获； 3. BeStdex G-25缓冲液置换； 4) 浓缩目的蛋白。2. 如权利要求1所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，发酵液的前处理包括 去除人溶菌酶溶液中的固体杂质和调整酸碱度。3. 如权利要求2所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，去除杂质时，先将溶液 离心，收集上清，然后使用中空纤维超滤膜处理上清液，进一步除去样品中的小颗粒物质。4. 如权利要求2所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，调节pH值时，将含重组 人源溶菌酶的发酵液调pH至6. 5。5. 如权利要求1所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，Bestarose MMC Diamond捕获是指：加入Bestarose MMC Diamond缓冲液B，调节样品电导使其与缓冲液A 电导一致，即为Bestarose MMC Diamond柱上样原样。6. 如权利要求1所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，Bestarose MMC Diamond捕获需要根据目标产品的理化性质，选择合适的色谱条件。7. 如权利要求1所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，用阳离子交换介质作 为人溶菌酶的纯化介质。8. 如权利要求1所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，Bestdex G-25缓冲液 置换的步骤是：平衡缓冲液平衡5个柱体积，至层析柱流出液的pH、电导与平衡缓冲液一 致，将上述处理后样品以30mL/min流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗3~5个柱体 积直到基线稳定，即所有未结合的物质都被冲洗出分离柱；然后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋 白，根据UV280洗脱峰收集样品。9. 如权利要求1所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，浓缩目的蛋白采用SP Bestarose FF柱进行样品浓缩。10. 如权利要求1所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，采用SP Bestarose FF柱进行样品浓缩的步骤包括：平衡缓冲液平衡3~5个柱体积，至层析柱流出液的pH、电 导与平衡缓冲液一致，将置换过缓冲液的样品以20mL/min流速上样，上样结束后用平衡缓 冲液清洗3~5个柱体积直到基线稳定，即所有未结合的物质都被冲洗出分离柱；然后用洗 脱缓冲液洗脱目的蛋白，根据UV280洗脱峰收集样品。11. 如权利要求1所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，采用SP Bestarose FF浓缩目的蛋白的层析柱条件如下： 层析柱：BXK 50/30, Vt = 280ml。12. 如权利要求1或者11所述的人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，采用SP Bestarose FF浓缩目的蛋白的平衡缓冲液的条件如下： 平衡缓冲液：20mM醋酸钠 ，pH 4. 75。13. 如权利要求1、11或者12中的任意一种人源溶菌酶蛋白纯化方法，其特征在于，采 用SP Bestarose FF浓缩目的蛋白的洗脱缓冲液的条件如下：
【专利摘要】本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及一种纯化人源溶菌酶蛋白的方法。本发明还涉及该生产方法的应用。本发明提供了一种人源溶菌酶蛋白纯化方法，该人源溶菌酶蛋白纯化方法包括：发酵液的前处理；Bestarose？MMC？Diamond捕获；Bestdex？G-25缓冲液置换；浓缩目的蛋白。本发明建立了复合型阳离子交换介质分离纯化发酵液中人源溶菌酶的新工艺，步骤少、成本低，能得到较高的蛋白投入产出比，为人溶菌酶蛋白的工业化生产提供了一个高效的生产工艺。
【IPC分类】C12N9/36
【公开号】CN105586327
【申请号】CN201410562496
【发明人】江松敏, 余龙, 余文博, 于颖, 曹立环, 陶建军, 唐丽莎, 杨鲜梅, 赛音
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年10月21日...