一种d-乳酸脱氢酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学和生物工程制备领域，尤其设及一种D-乳酸脱氨酶突变体 及其应用，具体设及一种D-乳酸脱氨酶的改造及利用休止细胞法高效转化苯丙酬酸合成D- 苯乳酸的方法。
【背景技术】
[0002] 苯乳酸是一种小分子化合物，其第二个碳原子是手性碳，因此有两种对映异构体 即D-苯乳酸和心苯乳酸。苯乳酸被证明能抑制培养基、牛奶和奶酪中的李斯特菌，还能抑制 一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，如大肠杆菌。苯乳酸被认为是乳酸菌化actobacillus) 产生的第Ξ代可用于食品体系中的新型抑菌物质，普遍认为D-苯乳酸在抑菌中发挥主要作 用。另外，苯乳酸被用于畜牧业，取代抗生素的饲料添加剂，还是丹参素的一种衍生物，用于 扩张冠状动脉。
[0003] 苯乳酸的合成方法有化学合成法和生物合成法，由于化学合成法技术复杂，反应 条件苛刻，对环境污染较严重，而且副产物多，所W近几年逐渐将方向转移至生物合成法 上。生物合成法中的微生物发酵法利用许多种乳酸菌合成苯乳酸，虽然有原料成本低，工艺 简单，操作方便等优点，但是副产物多的缺点导致后期的分离纯化较复杂。而休止细胞反应 不仅底物专一性强，转化率高，不易染菌，而且副产物少，分离纯化较简单，在工业化的实现 上有广阔的前景。
[0004] NADH依赖的D-乳酸脱氨酶化-LDH，EC1.1.1.27)可W催化苯丙酬酸(PPA)生成D-苯 乳酸(D-PLA)，但是相比较于丙酬酸，天然的D-LDH对于PPA表现出较少的底物特异性，但是 底物特异性可W通过酶的修饰来提高。Tokuda(2003)根据来自L.pentosus的D-LDH蛋白Ξ 维结构，将距离底物PPA分子C3端较近的氨基酸Tyr52替换成了Leu,运个突变体D-LDH (Y52L)比野生型D-LDH表现出了对PPA更高的底物特异性和催化效率。IsWkura(2005)也证 明将Tyr52替换成小的疏水氨基酸可W提高L.pentosus对PPA的亲和力和催化效率。Zheng (2013)将来自L.bulgaricus ATCC11842的D-LDH的氨基酸Ty巧巧日化6299组合突变成Y5化/ F299Y突变体，对PPA的酶活是野生型的83.9倍。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是:针对现有技术生物合成法中的微生物发酵法利用 许多种乳酸菌合成苯乳酸副产物多的缺点导致后期的分离纯化较复杂的不足，提供一种改 造后的D-乳酸脱氨酶高效转化苯丙酬酸合成D-苯乳酸的方法。
[0006] 本发明提供了一种D-乳酸脱氨酶突变体。
[0007] 本发明提供的蛋白，为D-乳酸脱氨酶突变体，是如下1)或2):
[000引1)序列A所不的蛋白质；
[0009] 2)将序列A所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能由序列A衍生的蛋白质；
[0010] 所述序列A为将序列表中序列2第307位Met突变为Leu得到的序列。
[0011 ]编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
[001 ^ 上述DNA分子是如下1) -3)中任一种的DNA分子：
[001引1)编码区为序列B所示的DNA分子；
[0014] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子； [001引 3)与1)限定的DNA序列至少具有70 %、至少具有75 %、至少具有80 %、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98%或至少具 有99 %同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
[0016] 所述序列B为将序列表中序列1第919位A突变为C得到的序列。
[0017] 上述严格条件可为在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用2 X SSC， 0.1 % SDS和 1 X SSC，0.1 % SDS各洗膜一次。
[0018] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的 范围。
[0019] 上述重组载体M30化为将D-乳酸脱氨酶突变体M30化的编码基因插入祀T-2&1载体 的Hind III和BamH I位点。
[0020] 上述重组菌为将上述DNA分子通过重组载体导入目的菌中表达上述蛋白质的菌。
[0021] 上述蛋白在作为D-乳酸脱氨酶中的应用也是本发明保护的范围。
[0022] 上述蛋白或上述DNA分子或上述重组菌在催化苯丙酬酸生成D-苯乳酸中的应用中 的应用也是本发明保护的范围。
[0023] 上述蛋白或上述DNA分子或上述重组菌在生产苯乳酸或提高苯乳酸中的应用也是 本发明保护的范围。
[0024] 本发明另一个目的是提供一种催化苯丙酬酸生成D-苯乳酸的方法。
[0025] 本发明提供的方法，包括如下步骤:将上述重组菌、苯丙酬酸和葡萄糖在反应体系 中反应，得到苯乳酸。
[00%]上述方法中，所述反应体系的pH值为7.5;
[0027]所述反应体系中葡萄糖的含量为5g/L。
[002引本发明的实验证明，本发明选择了来自Sporolactobacillus inulinus的D- LDH744进行突变获得D-乳酸脱氨酶突变体M307L该突变体具有高的D-乳酸脱氨酶活性，且 比未突变的D-乳酸脱氨酶相比，提高D-LDHWPPA(盐酸苯丙醇胺)为底物时的酶活。将该突 变体在大肠杆菌中表达，优化休止细胞反应催化合成D-PLA的条件，使产物PLA (苯乳酸)产 量得到提高。从源头上改变生物合成法中的微生物发酵法利用许多种乳酸菌合成苯乳酸的 技术现状，有助于推动和扩大苯乳酸组分的开发与利用。
【附图说明】
[0029] 图1为SDS-PAGE检测蛋白表达。
[0030] 图2为野生型与突变体酶活比较。
[0031 ]图3为全细胞转化最适条件优化。
[0032]图4为全细胞转化最适条件下PPA转换为PLA的产量。
【具体实施方式】
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] 在本申请文本中所使用的氨基酸Ξ字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨 基酸代码化ur.J.Biochem. ,138:9-37,1984)
[0036] 下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。
[0037] 实施例1、D-乳酸脱氨酶突变体的制备
[0038] 根据模拟的含有底物PPA和NADH的化DH744蛋白Ξ维空间结构，分别将离PPA底物 C3端很近的谷氨酷胺(Q)突变成较小的疏水氨基酸丙氨酸(A)，鄉氨酸(V)，亮氨酸化），101 位的酪氨酸(Y)突变成苯丙氨酸(F)，298位的苯丙氨酸(F)突变成酪氨酸(Υ)，307位的甲硫 氨酸(Μ)突变成亮氨酸化），构建了 D-乳酸脱氨酶突变体Q51V，Q51L，Q51A，Y101F，F298Y， M30化突变体。
[0039] 野生型D-乳酸脱氨酶的氨基酸序列为序列2,其编码基因的核巧酸序列为序列1。
[0040] D-乳酸脱氨酶突变体Q51V的氨基酸序列为将序列2第51位Gin突变为化1得到的序 列;D-乳酸脱氨酶突变体Q51V的编码基因的核巧酸序列为将序列1第151-152位CA突变为GT 得到的序列；
[0041 ] D-乳酸脱氨酶突变体Q51L的氨基酸序列为将序列2第51位Gin突变为Leu得到的序 列;D-乳酸脱氨酶突变体Q51L的编码基因的核巧酸序列为将序列1第152位A突变为T得到的 序列；
[0042] D-乳酸脱氨酶突变体Q51A的氨基酸序列为将序列2第51位Gin突变为Ala得到的序 列;D-乳酸脱氨酶突变体Q51A的编码基因的核巧酸序列为将序列1第151-153位CAG突变为 GCA；
[0043] D-乳酸脱氨酶突变体Y101L的氨基酸序列为将序列2第101位Tyr突变为Leu得到的 序列;D-乳酸脱氨酶突变体Y101L的编码基因的核巧酸序列为将序列1第301-303位TAT突变 为CTG得到的序列；
[0044] D-乳酸脱氨酶突变体F298Y的氨基酸序列为将序列2第298位化e突变为Tyr得到的 序列;D-乳酸脱氨酶突变体F298Y的编码基因的核巧酸序列为将序列1第893-894位TC突变 为AT得到的序列。
[0045] D-乳酸脱氨酶突变体M30化的氨基酸序列为将序列2第307位Met突变为Leu得到的 序列;D-乳酸脱氨酶突变体M30化的编码基因的核巧酸序列为将序列1第919位A突变为C得 到的序列。
[0046] 上述突变体通过原核表达制备，具体如下：
[0047] 1、重组载体
[004引来源于5口01'01日(：1:06日(3；[11113；[]1111;[]1113的0-乳酸脱氨酶的编码基因插入口61'-28曰 载体(优宝生物，VT1207)的化nd III和BamH I位点，得到表达D-乳酸脱氨酶的重组载体 744-28曰，其中D-乳酸脱氨酶的氨基酸序列为序列2，D-乳酸脱氨酶的编码基因的核巧酸序 列为序列表中序列1。
[0049] W744-28a为模板，分别用表1所示的引物进行扩增，得到相应的点突变重组质粒 951￥、95比、95心、￥10化少298￥、13071^，各自点突变重组质粒表达不同的0-乳酸脱氨酶突变 体。
[0050]点突变重组质粒Q51V为将D-乳酸脱氨酶突变体Q51V的编码基因插入祀T-28a载体 的化nd III和BamH I位点;D-乳酸脱氨酶突变体Q51V的氨基酸序列为将序列2第51位Gin突 变为化1得到的序列;D-乳酸脱氨酶突变体Q51V的编码基因的核巧酸序列为将序列1第151- 152位CA突变为GT得到的序列；
[0051 ]点突变重组质粒Q51L为将D-乳酸脱氨酶突变体Q51L的编码基因插入祀T-2&1载体 的化nd III和BamH I位点;D-乳酸脱氨酶突变体Q51L的氨基酸序列为将序列2第51位Gin突 变为Leu得到的序列;D-乳酸脱氨酶突变体Q51L的编码基因的核巧酸序列为将序列1第152 位A突变为T得到的序列；
[0052] 点突变重组质粒Q51A为将D-乳酸脱氨酶突变体Q51A的编码基因插入祀T-28a载体 的化nd III和BamH I位点;D-乳酸脱氨酶突变体Q51A的氨基酸序列为将序列2第51位Gin突 变为Ala得到的序列;D-乳酸脱氨酶突变体Q51A的编码基因的核巧酸序列为将序列1第151- 153位CAG突变为GCA;
[0053] 点突变重组质粒Y101L为将D-乳酸脱氨酶突变体Y101L的编码基因插入祀T-2姑载 体的化nd III和BamH I位点;D-乳酸脱氨酶突变体Y101L的氨基酸序列为将序列2第101位 Tyr突变为Leu得到的序列;D-乳酸脱氨酶突变体Y101L的编码基因的核巧酸序列为将序列1 第301-303位TAT突变为CTG得到的序列；
[0054] 点突变重组质粒F298Y为将D-乳酸脱氨酶突变体F298Y的编码基因插入祀T-2姑载 体的化nd III和BamH I位点;D-乳酸脱氨酶突变体F298Y的氨基酸序列为将序列2第298位 Phe突变为Tyr得到的序列;D-乳酸脱氨酶突变体F298Y的编码基因的核巧酸序列为将序列1 第893-894位TC突变为AT得到的序列。
[0055]