一种用于木质纤维素解聚作用的组合物及其解聚方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及木质纤维素降解技术领域，特别涉及一种用于木质纤维素解聚作用的 组合物及其解聚方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，在深入研究纤维素酶主要组分的基础上，发现一些非水解酶活性的纤维 素降解因子已经成为当前研究热点。在自然界对纤维素的生物降解过程中，除了主要的酶 解机制外是否存在其他新型的纤维素酶协同降解因子？早在半个世纪前，Reese等巧eese et al. ,1950)提出应该存在破坏结晶纤维素的氨键酶，至今还未在微生物中得到很好的证 实（高培基，2003)。肖伯旭等人在对拟康氏木霉和紫微青霉的CBH I的C抓区进行研究时 发现C抓吸附于纤维素后会导致其超分子结构的破坏，同时不产生还原糖，即纤维素内的 糖巧键未被水解（Yan and Sun，1997)。2002年Saloheimo等人在瑞氏木霉的胞外分泌蛋 白组分中发现了 Swollenin蛋白，该蛋白类似于植物中的Expansin蛋白，命名为膨胀因子 (Swollenin) (Saloheimo et al.，1997)DSwollenin蛋白作用于滤纸和棉纤维素后，用光学 显微镜观察到类似于超声波处理后的纤维结构破坏的现象，同时并没有还原糖的产生。虽 然该蛋白分泌量极小，但是能够破坏纤维结晶结构，使纤维结构更无序，更膨胀，有利于纤 维素酶和纤维素的结合，从而提高了纤维素酶水解木质纤维素的能力，但是Swollenin和 纤维素酶协同作用程度有限（Yao et al. ,2008)。在陆生梭抱菌（Thielavia.terrestris) 的胞外粗酶液中发现了 G册1家族蛋白。在水解玉米枯杆的实验中，加入不到总酶量5% 的GH61家族蛋白，可W使水解作用所需纤维素酶的用量减少到原来的1/2。使用表达了 T. terrestris G册1B蛋白的里氏木霉菌株，可W在减少酶用量1.4倍的情况下于12化内 将90%纤维素转化为葡萄糖。G册1蛋白本身对酸处理玉米枯杆或者其它木质纤维素底物 没有明显的可察觉的水解酶活性。送说明水解作用的提高不是由于G册1蛋白质本身具有 内切或者外切葡聚糖酶的活性引起的。G册1的作用机理现在被推测为其可作为多糖单加氧 酶，为纤维素酶解过程提供电子，发生氧化还原反应值imarogona et al，2012)DSwollenin 蛋白只存在于里氏木霉中，对其他高产纤维素酶真菌酶系改造指导意义不大。并且现已经 发现纤维素酶降解因子与商业纤维素酶协同作用不太明显，作用机理还不透彻。所W亟待 发现新型的纤维素酶协同降解因子，更加透彻解析木质纤维素降解机理。
【发明内容】
[0003] 本发明目的之一在于提供一种用于木质纤维素解聚作用的组合物。在相同纤维素 酶含量存在的情况下，很大程度上提高木质纤维素的降解效率。
[0004] 本发明目的之二在于提供利用所述组合物解聚木质纤维素的方法，本发明申请人 经过大量的试验，旨在为实际生产确定降解木质纤维素的比较适宜的组合物中脱氨酶和纤 维素酶用量W及反应条件，最大程度充分利用组合物，提高木质纤维降解反应获得糖的产 量，降低生产成本。
[0005] 该用于木质纤维素解聚作用的组合物在提高木质纤维素水解产糖量，降低生物 质-糖的转化成本中的应用。
[0006] 本发明提供的技术方案为：
[0007] -种用于木质纤维素解聚作用的组合物，其特征在于，所述组合物包括脱氨酶和 纤维素酶。
[0008] 优选的是，所述脱氨酶包含：
[0009] (a)组合物氨基酸序列；SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列；
[0010] 化）在（a)限定的所述组合物中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与（a) 所述多肤具有相同生物学功能的由（a)衍生的氨基酸序列。
[0011] 优选的是，所述纤维素酶包括内切酶、外切酶W及目-葡萄糖巧酶。
[0012] 一种利用组合物解聚木质纤维素的方法，其特征在于，包括W下步骤：
[0013] 将所述组合物中的纤维素酶和脱氨酶添加入木质纤维素中进行降解反应，其中， Ig所述底物添加10FPU的所述纤维素酶W及Ig所述底物添加80-120 μ g脱氨酶。
[0014] 优选的是，Ig所述底物添加110 μ g脱氨酶。
[001引优选的是，所述降解反应所需温度为45~55。°C W及抑为4. 4~5. 2。
[0016] 优选的是，所述降解反应所需温度为5(TC W及抑为4. 8。
[0017] 优选的是，所述降解反应的产物是糖。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 脱氨酶本身并没有水解活性，由于分子量较小，可W透过木质纤维素的较小的间 隙进入内部，同时通过其产生的自由基册?可W攻击木素和氨键网络，使无定形的纤维素 无序化，结构变得松散。有利于纤维素酶等酶蛋白和底物结合，快速地发生降解反应。自 由基的作用是无选择性的，具有广泛的作用位点。一方面自由基可W破坏纤维素的目-1,4 糖巧键，生成葡萄糖。另一方面脱氨酶产生的自由基具有强氧化性，当自由基进入木质纤维 素内部后，靠居基结合的氨键结构消失，链间的作用力变小，使木质纤维素结晶区趋于无定 形化，大大降低了木质纤维素抗降解的屏障，为进一步酶解提供有利条件，所W脱氨酶与纤 维素酶之间存在强烈的协同作用，是用于木质纤维素解聚作用效果比较好的组合物。本发 明人经过试验证明，在纤维素酶中添加一定量的脱氨酶后可W显著提高木质纤维的降解效 率。并且，本发明的组合物解聚木质纤维素的方法，为实际生产确定降解木质纤维素的比较 适宜的组合物中脱氨酶和纤维素酶用量W及反应条件，最大程度充分利用组合物，提高木 质纤维降解反应获得糖的产量，降低生产成本。
[0020] 本发明所涉及到的术语定义
[0021] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者 类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
[0022] 术语"氨基酸"意指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使 它的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酶，两个 或两个W上的氨基酸化学聚合成肤，一个蛋白质的原始片段，是蛋白质生成的前体，氨基酸 广义上是指既含有一个碱性氨基又含有一个酸性駿基的有机化合物，正如它的名字所说的 郝样。但一般的氨基酸，则是指构成蛋白质的结构单位。在生物界中，构成天然蛋白质的氨 基酸具有其特定的结构特点，即其氨基直接连接在α-碳原子上，送种氨基酸被称为α-氨 基酸。在自然界中共有300多种氨基酸，其中α-氨基酸21种。α-氨基酸是肤和蛋白质 的构件分子，也是构成生命大厦的基本砖石之一。
[0023] 术语"缺失"意指一个正常染色体断裂后丢失了一个片段，送片段上的基因也随之 失去，在本发明中意指氨基酸序列除了为SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列之外，还包括氨基 酸序列中丢失一个或几个氨基酸的不影响其功能的新的氨基酸序列。
[0024] 术语"插入"意指利用基因操作技术把一段DNA接入另一段DNA中或克隆载体中 去，在本发明中意指氨基酸序列除了为SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列之外，还包括氨基酸 序列中插入一个或几个氨基酸的不影响其功能的新的氨基酸序列。
[0025] 术语"置换"意指一种基因重组载体，一般利用同源重组将基因组中的某段基因替 换，而达到基因敲除的目的，在本发明中意指氨基酸序列除了为SEQ ID No. 1所示的氨基酸 序列之外，还包括氨基酸序列中一个或几个氨基酸被其他种类的氨基酸置换后的不影响其 功能的新的氨基酸序列。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中分离自检状青霉胞外脱 氨酶的SDS-PAGE图。
[0027] 图2为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中分离自检状青霉胞外脱 氨酶蛋白与不同纤维素酶之间的协同作用的比较图。
[0028] 图3为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的所述脱氨酶单独处理 生物质时居基自由基生成检测。
[0029] 图4为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的脱氨酶单独水解木质 纤维素后产物生成情况的分光光度法检测图。
[0030] 图5为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的脱氨酶单独水解木质 纤维素后产物生成情况的HPLC检测图。
[0031] 图6为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的利用脱氨酶单独处理 微晶纤维素前后结构的差异的FTIR分析图。
[0032] 图7为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的利用脱氨酶单独处理 玉米枯杆前后结构的差异的FTIR分析图。
[0033] 图8为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的利用脱氨酶单独处理 將苔前后结构的差异的FTIR分析图。
[0034] 图9为本发明所述用于木质纤维素解聚作用的组合物中的利用脱氨酶单独处理 巨藻前后结构的差异的FTIR分析图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，W令本领域技术人员参照说明书文 字能够据W实施。
[0036] 实施例1
[0037] 从检状青霉的胞外酶液中分离提纯本发明组合物中的脱氨酶：
[003引 检状青霉（Penicillium piceum)H16,保藏号；CGMCC No. 8339,保藏单位中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中必khina general microbiological州hure collection center)。
[0039] 针对检状青霉，最适的培养基条件如下；3. 3 % microciTstalline cellulose, 1.7%co;rncob ste 巧 liquor'O.S% (畑4)25〇4,0.6%皿2口〇4,〇. l%MgS〇4,0.25% 化 C〇3，and 0. 2% Tween-80.发酵使用的玻璃容器一般选择300血的H角瓶，培养50血的培养液，于 28度培养箱，水平震荡18化pm, 5天。
[0040] 脱氨酶分离纯化使用的仪器AKTA purifier (GE，Sweden)。使用抑值为4. 8~5. 0 的物质的量浓度为18~22mM的醋