一种酯酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明克隆表达了一种醋酶，并公开了其核巧酸序列和氨基酸序列及酶学性质和 应用，属于工业微生物领域。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸醋酶(Feruloyl esterases，FAEs)又称肉桂酸醋酶，它是一种簇酸醋酶，是 能水解阿魏酸甲醋、低聚糖醋酶和多糖阿魏酸醋中的醋键，释放游离阿魏酸的酶。它能切断 细胞壁中多糖-多糖、多糖-木质素间的交联，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的 释放，因此在食品、饲料和造纸工业具有广阔的应用前景。在食品工业中，利用醋酶来降解 植物细胞壁中的阿魏酸醋键，可W得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。而植物性原 材料通过醋酶的处理细胞壁变得疏松，作为饲料工业的原料更容易被禽畜消化利用，作为 制浆造纸工业的原料可W减少制浆工序化化学药品的使用，减少污染，并有利于后续工序 的进行。
[0003] 1987年，阿魏酸醋酶在Str邱tomyces olivoc虹omogenes中被第一次发现。研究表 明真菌、细菌、酵母都能分泌醋酶，目前发现的产酶微生物有黑曲霉（Aaspergillus niger)，链霉菌（Streptomyces avermitilis)，梭菌（Clostridium thermocellum)，乳酉《杆 菌(Xactobacilli sp.)，假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)等。当前克隆表达的细菌阿 魏阿酸醋酶，主要来源于乳酸菌（Purification and characterization of a feruloyl esterase from the intestinal bacterium Lactobacillus acidophilus.Applied and Environmental Microbiology 2004,70(4):2367-2372；Biochemical Properties of Two Cinn曰moyl Esterases Purified from 曰 L曰ctob曰cillus johnsonii Str曰in Isol曰ted from Stool Samples of Diabetes-Resistant Rats,2009,Applied and environmental microbiology ,5(15) ,5018-5024;)。之前有报道芽抱杆菌也具有阿魏酸醋酶活性 (Detection of ferulic 曰cid ester曰se production by B曰cillus spp.曰nd lactobaci 11 i .Appl Microbiol Biotechno 1,1998,50: 257-260)，但始终未从芽抱杆菌中 克隆表达到相关的基因。本发明首次从解淀粉芽抱杆菌中克隆得到了一个新型的醋酶，并 公开了其底物特性及其应用。
【发明内容】
[0004] 本发明从解淀粉芽抱杆菌中克隆得到了一个新型的醋酶基因，利用大肠杆菌工程 菌异源表达，公开了其相关的酶学特性。并用它进行了阿魏酸提取的应用。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 1、菌株
[0007] 本发明醋酶基因的来源菌株为：Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350(从美 国ATCC菌种库购买）。
[000引 2、醋酶基因的克隆
[0009] 提取Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350菌体基因组总DNA。设计特异性引 物，应用PCR方法，扩增出醋酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。
[0010] 3、醋酶表达与纯化
[0011] 将重组质粒导入化21大肠杆菌中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻 干燥备用。
[0012] 4、醋酶酶学性质
[0013] W阿魏酸甲醋为底物研究pH对本发明所述醋酶酶活的影响。
[0014] W阿魏酸甲醋为底物研究溫度对本发明所述醋酶酶活的影响。
[001引 W阿魏酸甲醋为底物测定了化2+、1(\船\]\1112+、2112\化\(：〇+、加 2+、]\%2\化2+离子对 酶活的影响。
[0016] 醋酶的底物特性分析:所用的底物有己酸乙醋、葵酸乙醋、下酸乙醋、辛酸乙醋、乙 酸乙醋、乙締葵酸醋、己豆酸乙締醋、月桂酸乙締醋、Ξ甲基乙酸乙締醋、苯甲酸乙締醋、甲 基丙締酸乙締醋、丙酸乙締醋、正下酸乙締醋、乙酸乙締醋、甘油Ξ下醋、丫-戊内醋、乙酸下 醋、Ξ-0-乙酷基-D葡萄締糖、Ξ乙酸甘油醋、a-D( + )五乙酷葡萄糖、乙酸香叶醋、乙酸正丙 醋、乙酸异丙醋、乳酸甲醋、二氨莱莉酬酸甲醋、辛酸甲醋、己酸甲醋、2-漠丙酸甲醋、漠乙酸 甲醋、甲基（R)-(-)-扁桃酸、漠苯乙酸甲醋、肉桂酸卞醋、乙酸-2-糞醋、丙酸糞醋、乙酸苯 醋、下酸糞基醋、4-硝基苯基辛酸醋、乙酸-1-糞醋、2,6-二径基-4-甲基苯甲酸甲醋、糞酪丙 酸醋、甲基扁桃酸醋、阿魏酸乙醋、阿魏酸甲醋、绿原酸、迷迭香酸、咖啡酸乙醋、咖啡酸苯乙 醋、对径基肉桂酸甲醋。
[0017] 酶活测定方法为:20mM憐酸缓冲液，20ug/ml冷冻干燥的纯酶，ImM底物，水浴控溫 反应30min，沸水浴100°C加热3分钟终止反应。用高效液相色谱检测底物减少量，高效液相 色谱检测条件为:0-1511111110%乙腊、90%水(0.1%甲酸）；15-20111111100%乙腊、0水;20- 30min 10%乙腊、90%水(0.1 %甲酸），检测器为Alltech 3300型蒸发光散射检测器。溫度、 pH、离子、底物的影响均采用该体系。
[0018] 5. W去淀粉教皮为原料，添加该醋酶后的阿魏酸释放率分析。
[0019]去淀粉教皮按照文献的方法制备（Xylan-hydrolysing enzymes from Streptomyces spp.Enzyme and Microbial Technology, 1988,10(7):403-409.)。教皮中 阿魏酸的总量W碱法提取得到的阿魏酸计算（Pr邱aration of ferylic acid from agric yltural wastes : Its improved extraction and purification. Journal of Agricy Itural and Food化emis化y，2008,56(17) :7644-7648.)。阿魏酸释放率为阿魏酸的酶解 释放量占碱提取的阿魏酸总量的百分率
【具体实施方式】
[0020] 实施例1
[0021] 本实施例为本发明所述醋酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。
[0022] 1'Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350DNA的提取
[0023] 将Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350菌株在LB培养基中培养 12小时， 1200化/min离屯、10分钟得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(化KaRa公司）按照其操 作提取Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350菌体基因组总DNA，放冰箱备用。
[0024] 2、大肠杆菌感受态制备
[0025] (1)接种E.coli D册α和化21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37 °C、200巧m/min培养过夜。
[0026] (2)按1 %接种量接种于50mL LB培养基中，37 °C培养至0D600约0.6(约2~化）。
[0027] (3)将菌液转移到5〇1111^预冷的离屯、管中，冰上放置3〇111；[]1，8000巧111/111；[]1、4°[离屯、 5min0
[0028] (4)弃上清，加入5mL预冷的O.lmol/L CaC12溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，