2°C，72 h发酵。
[0019]发酵完成后将100ml无菌水加入培养基，搅拌0.5 h, 4层纱布过滤除去菌体及不溶性杂质，其余杂质可使用11500 rpm,20 min离心除去。缓慢加入56 g固体硫酸钱，搅拌均匀，4°C静置I h，待酶完全沉淀。
[0020]沉淀加入6 —8 ml Na2C03/NaHC03(30 mM pH 9.2)溶液完全溶解，使用分子量为5000或8000的透析袋进行透析，在400 ml Na2C03/NaHC03 (30 mM pH 9.2)溶液中进行透析，每8 h更换一次透析液，重复三次，缓冲液至换完毕。
[0021]使用QHP强阴离子预装柱(1.6*2.5 cm; GE Healthcare 瑞典)，以2.5 ml/min的流速使用双蒸水将柱子平衡10倍柱体积，更换流动相为Na2C03/NaHC03 (30 mM pH 9.2流动相A)，以相同流速平衡柱子17柱体积，取2.5 ml上一步所制得粗酶液样品加载在柱子上，以流动相A冲洗6倍柱体积，然后在3个柱体积内线性增加流动相B(流动相A含I M NaCl)至100%洗脱，收集11 ml至28 ml之间的部分。
[0022]将上述收集得到的目标酶液使用孔径为20kDa，体积为50 ml的超滤管进行超滤浓缩，待每管体积变为浓缩至1/3时加2倍体积双蒸水再次超滤，重复3次，取穿透部分冷冻干燥，得纯度大于90%的纳豆激酶粉末，该纯化方法酶的纯化倍数为476.1，回收率为48.3%。
[0023]实施例二:
称取40克大豆及4 g MgCl2,添加双蒸水20 ml，置于500 ml烧杯中，121°C，20 min灭菌，待冷却后，接种一环纳豆枯草芽孢杆菌。35°C，72 h发酵。
[0024]发酵完成后将400ml无菌水加入培养基，搅拌0.5 h, 4层纱布过滤除去菌体及不溶性杂质，其余杂质可使用11500 rpm,20 min离心除去。缓慢加入224 g固体硫酸钱，搅拌均匀，4°C静置I h，待酶完全沉淀。
[0025]沉淀加入25 — 35 ml Na2C03/NaHC03 (30 mM pH 9.5)溶液完全溶解，分装于2个孔径为8 kDa的超滤管(密理博)中，超滤至每管体积为5 ml,加入Na2C03/NaHC03 (30 mM pH
9.5)溶液至原体积(每管约15 ml)重新超滤至体积为每管5 ml，重复三次，缓冲液至换完毕。
[0026]使用4支Q HP阴离子预装柱(1.6*2.5 cm)头尾依次串接，以2.5 ml/min的流速使用流动相Na2C03/NaHC03 (30 mM pH 9.5流动相A)平衡柱子20倍柱体积，取10 —15 ml上一步所制得粗酶液样品加载在柱子上，以流动相A冲洗6倍柱体积，然后在3个柱体积内线性增加流动相B(流动相A含I M NaCl)至100%洗脱，收集35 ml至110 ml之间的部分。
[0027]将上一步收集得到的目标酶液使用孔径为20kDa，体积为50 ml的超滤管进行超滤浓缩，(为节省超滤管可先以40°C水浴旋转蒸发浓缩后再进行超滤)，待每管体积变为5ml时加2倍体积双蒸水再次超滤，至总体积变为5 ml，重复三次，收集穿透部分，冷冻干燥，得纯度大于90%的纳豆激酶粉末，该纯化方法酶的纯化倍数为454.1，回收率为45%。
[0028]实施例三:
称取200克大豆及20g MgCl2,添加双蒸水100 ml，置于I L ml烧杯中，121°C，20min灭菌，待冷却后，接种一环纳豆枯草芽孢杆菌。32°C，72 h发酵。
[0029]发酵完成后将2000ml无菌水加入培养基，搅拌0.5 h, 4层纱布过滤除去菌体及不溶性杂质，其余杂质可使用11500rpm，20min离心除去。缓慢加入1120g固体硫酸铵，搅拌均匀，4°C静置Ih，待酶完全沉淀。
[0030]沉淀加入250—300 ml Na2C03/NaHC03 (30mM pH 9.2)溶液完全溶解，使用Benchtop超滤仪(GE Healthcare瑞典)进行缓冲液置换，原溶液体积浓缩至60 ml时加入Na2C03/NaHC03 (30 mM pH 9.2)溶液至原体积，重新超滤至体积为每管60 ml，重复三次，缓冲液至换完毕。
[0031]使用XK-50空柱(GE Healthcare瑞典)加入2 cm深双蒸水，将300 ml Q HP阴离子凝胶填料沿玻璃棒缓慢倾入柱子，待液面与胶面齐平时压下推杆，以5 ml/min的流速使用双蒸水将柱子平衡一昼夜，更换流动相为Na2C03/NaHC03 (30 mM pH 9.2流动相A)，以相同流速平衡柱子17柱体积，将上一步所制得粗酶液样品加载在柱子上，以流动相A冲洗6倍柱体积，然后在3个柱体积内线性增加流动相B(流动相A含I M NaCl)至100%洗脱，收集550 ml至1450 ml之间的部分。
[0032]将上述收集得到的目标酶液使用孔径为20kDa，体积为50 ml的超滤管进行超滤浓缩，(为节省超滤管可先以40°C水浴旋转蒸发浓缩后再进行超滤)，待每管体积变为5 ml时加2倍体积双蒸水再次超滤，至总体积变为5 ml，重复三次，收集穿透部分，冷冻干燥，得纯度大于90%的纳豆激酶粉末，该纯化方法酶的纯化倍数为429.7，回收率为42.7%。
[0033]经测定，由本发明方法制备得到的纳豆激酶的氨基酸序列如下:
AQSVPYGISQ IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHP DLNVRGGASF VPSETNPYQD 60GSSHGTHAAG TIAALNNSIG VLGVAPSASL YAVKVLDSTG SGQYSffIING IEffAISNNMD 120VIMMSLGGPT GSTALKTVVD KAVSSGIVVA AAAGNEGSSG STSTVGYPAK YPSTIAVGAV 180NSSNQRASFS SVGSELDVMA PGVSIQSTLP GGTYGAYNGT SMATPHVAGA AALILSKHPT 240WTNAQVRDRL ESTATYLGNS FYYGKGLINV QAAAQ275
本发明方法所涉及的纯化步骤包括盐沉淀，缓冲液置换，初步纯化和粗细纯化三部分，
其中只有初步纯化采用了柱层析的方法，大大提高了酶的回收率，减少了操作单元，简单易行，纯化成本极为低廉。
[0034]本发明可应用于生物发酵和蛋白分离工程领域。
【主权项】
1.一种可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)配置固体培养基，灭菌，冷却； (2)固体发酵:往冷却后的固体培养基内接入纳豆枯草芽孢杆菌进行发酵产生纳豆激酶； (3)粗酶液收集:发酵完成后，用无菌水洗涤固体培养基，洗液经过滤去除不可溶杂质，再加入硫酸铵沉淀得到粗酶，通过冷冻复溶去糖类得到粗酶液； (4)缓冲液置换:粗酶液用超滤法去除残留的硫酸铵，然后进行缓冲液置换； (5)酶纯化:利用强阴离子柱进行初步提纯，经初步提纯后收集到的酶液用超滤法进行精细提纯，得到纯化纳豆激酶。2.根据权利要求1所述的一种可放大的快速高效纳豆激酶春花制备方法，其特征在于:所述步骤(I)和步骤(2)所述的固体培养基是将黄豆、MgCl2和双蒸水的混合物加入5?10倍体积的容器中，温度为30?36°C，时间为48?SOh进行培养得到，灭菌，冷却待用，其中黄豆、MgCh和双蒸水的质量/质量/体积比为w/w/v=10:1:5。3.根据权利要求1所述的一种可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中，所述无菌水的体积为固体培养基体积的10倍，在每毫升洗液中添加的硫酸铵为0.56g。4.根据权利要求1所述的一种可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中的超滤法使用的超滤膜孔径为5?8kDa，采用的缓冲液为30 mM pH 9.1?9.5的~&20)3/^&!10)3。5.根据权利要求1所述的一种可放大的快速高效纳豆激酶春花制备方法，其特征在于:所述步骤(5)所述的强阴离子柱为5*16 cm的Q HP柱，其流动相A为30 mM pH 9.1?9.5的Na2C03/NaHC03，流动相B为含I M NaCl的流动相A;先用17?20倍柱体积流动相A冲洗柱子使柱子达到平衡，然后上样，使用5?8倍柱体积的流动相A冲洗，在3?5个柱体积内线性增加流动相B至100%，收集洗脱液为第2个柱体积至流动相B之前的部分。6.根据权利要求1所述的一种可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法，其特征在于:所述步骤(5)中的超滤法使用的超滤膜孔径为25kDa，收集穿透部分，经冷冻干燥，得纯度大于90%的纳豆激酶。7.根据权利要求1所述的一种可放大的快速高效纳豆激酶春花制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，无菌水洗涤固体培养基后得到的洗液用纱布过滤除去菌体及不溶性杂质，其余杂质使用11500 rpm,20 min离心除去。
【专利摘要】一种可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法。本发明旨在提供一种简单有效，产率高，试剂消耗少，酶纯度高，操作单元可灵活放大缩小，适用于不同数量级酶制备，耗时少，成本低的可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法。本发明方法采用固体发酵法生产纳豆激酶，然后用硫酸铵盐析完全沉淀酶，超滤置换缓冲液后用Q？HP强阴离子柱对酶进行粗分，最后用20？kDa超滤膜进行粗细分离。本发明的纯化方法简单有效，回收高，试剂消耗少。制得的纳豆激酶纯度高，操作单元简单，耗时短，在纳豆激酶的研究与工业化应用方面有良好的前景。本发明可应用于生物发酵和蛋白分离工程领域。
【IPC分类】C12N9/56
【公开号】CN105586329
【申请号】CN201510495062
【发明人】雷波, 辛雄, 蔡宗苇
【申请人】雷波, 辛雄, 蔡宗苇
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年8月13日