糖蛋白激素长效超激动剂的制作方法

糖蛋白激素长效超激动剂
[0001]
本申请是中国发明专利申请(申请日：2013年7月29日；申请号：201380047511.2(国际申请号：pct/us2013/052510)；发明名称：糖蛋白激素长效超激动剂)的分案申请。
发明领域
[0002]
本发明大体涉及具有超激动剂活性的修饰糖蛋白激素，以及其在治疗与糖蛋白激素活性相关的病症中的用途。更具体地，本发明涉及修饰糖蛋白分子，其相比野生型α亚单位而言在α亚单位包含氨基酸取代和一个或多个插入的肽，其中该修饰分子相比野生型糖蛋白显示增强的药理学性质。


背景技术：

[0003]
促性腺素促滤泡素(促卵泡激素，fsh)和绒毛膜促性腺素(cg)、促黄体激素(黄体化激素，lh)和促甲状腺素(甲状腺刺激激素，tsh)构成糖蛋白激素家族。各激素为两个非共价连接的亚单位，即α和β亚单位的杂二聚体。在相同的物种，α-亚单位的氨基酸序列在所有激素中都相同，而β-亚单位的序列是激素特异性的(pierce，ann.rev.biochem.50:465-495(1981))。从鱼到哺乳动物所述亚单位的序列是高度保守的，该事实暗示这些激素都是由共同的祖先蛋白进化而来的(fontaine，gen.comp.endocrinol.32:341-347(1977))。
[0004]
之前关于修饰糖蛋白激素的研究已显示令人鼓舞的数据。例如，除了提供具有增加活性的修饰糖蛋白激素之外，进一步的突变已显示了受体亲和结合的增加(参见例如wo 2005/089445和wo 2005/101000)。然而，尽管亲和力增加，研究证明了修饰糖蛋白激素的清除即使不快于它们的野生型对应物，也与它们的野生型对应物一样快。为产生具有增强活性的临床有用的超激动剂，修饰糖蛋白超激动剂除了具有改善的受体结合亲和力之外，还应具有改善的生物半衰期。然而，之前进一步修饰糖蛋白激素以增加半衰期和提高生物利用度的尝试不太令人满意，且相反修饰糖蛋白激素仅证明了减弱的反应。


技术实现要素：

[0005]
本发明包括修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的q13、e14、p16或q20具有至少一个保守碱性氨基酸取代且在d3和q5之间具有vnvtinvt(seq id no:20)的插入片段。
[0006]
在一些实施方案中，该修饰糖蛋白激素在q13、p16和q20包含至少两个或至少三个碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，该修饰糖蛋白激素还在e14包含碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，该碱性氨基酸为精氨酸。
[0007]
在一些实施方案中，所述α亚单位包含与seq id no:11具有至少85％同一性的氨基酸序列且进一步包含黄体化激素(lh)的β亚单位、绒毛膜促性腺素(cg)的β亚单位、促卵泡激素(fsh)的β亚单位或甲状腺刺激激素(tsh)的β亚单位。在一些实施方案中，所述α亚单位衍生自人α亚单位(seq id no:6)。
[0008]
本发明包括修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的
k15、k17、k20或k24具有至少一个保守碱性氨基酸取代且在f6和t7之间具有nvtinv(seq id no:1)的插入片段。
[0009]
在一些实施方案中，修饰糖蛋白激素在k15、k17、k20和k24包含至少两个、或至少三个或至少四个碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，该修饰糖蛋白激素进一步在e18包含碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，该碱性氨基酸为精氨酸。
[0010]
在一些实施方案中，所述α亚单位包含与seq id no:7具有至少85％同一性的氨基酸序列且进一步包含黄体化激素(lh)的β亚单位、绒毛膜促性腺素(cg)的β亚单位、促卵泡激素(fsh)的β亚单位或甲状腺刺激激素(tsh)的β亚单位。在一些实施方案中，所述α亚单位衍生自牛、猪或绵羊的α亚单位(分别为seq id no:2、seq id no:5、seq id no:3)。
[0011]
本发明包括修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的k15、e18、k20或k24具有至少一个保守碱性氨基酸取代，且在f6和t7之间具有nvtinv(seq id no:1)的插入片段或具有在f6和t7之间nv的插入片段加上t7和t8之间inv的插入片段。
[0012]
在一些实施方案中，修饰糖蛋白激素在k15、e18、k20和k24包含至少两个、或至少三个或至少四个碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，所述修饰糖蛋白激素在所述α亚单位的f6和t7之间包含nvtinv(seq id no:1)的插入片段。在一些实施方案中，所述修饰糖蛋白激素包含在所述α亚单位的f6和t7之间nv的插入片段加上t7和t8之间inv的插入片段。在一些实施方案中，该碱性氨基酸为精氨酸或组氨酸。在一些实施方案中，该碱性氨基酸为精氨酸。
[0013]
在一些实施方案中，所述α亚单位包含与seq id no:4具有至少85％同一性的氨基酸序列且进一步包含黄体化激素(lh)的β亚单位、绒毛膜促性腺素(cg)的β亚单位、促卵泡激素(fsh)的β亚单位或甲状腺刺激激素(tsh)的β亚单位。在一些实施方案中，所述α亚单位衍生自马的α亚单位(seq id no:4)。
[0014]
本发明还包括刺激动物糖蛋白受体的方法，包括向动物给药上述修饰糖蛋白激素。本发明还包括刺激动物排卵的方法，包括向动物给药上述任一种修饰糖蛋白激素。在一些实施方案中，所述动物为人、牛、羊(sheep)、猪或马。
[0015]
附图简述
[0016]
图1显示用通过瞬时转染制备的所选的bfsh类似物在cho-fshr细胞中的camp刺激。图1a显示-v(pfsh)、bfsh-wt(野生型)与bfsh-5r类似物的比较。图1b显示通过两个n-端延伸物(anitv，nitv)和一个内部新糖基化(v78n)(spa camp测试)对hfsh-tr4402类似物(瞬时4402)的体外生物活性的减弱。图1c显示bfsh-5r类似物与插入片段1(5r+插入片段1)和插入片段2(5r+插入片段2)的比较。
[0017]
图2a和2b显示小鼠单一皮下注射后多种bfsh类似物的pk筛选测试。在各实验中，5只小鼠用于各制备物。血样在注射后24、32和48小时采集，扣除血浆水平且数据表示为注射剂量的％(％id)。血浆样品中fsh水平使用fsh elisa(endodrine technologies)测试。
[0018]
图3a-d显示tr55601产生的不同批次(lot)的分析。图3a显示电荷异质性分析，其使用ief然后是蛋白质印迹。批次3(泳道2和3)的次优唾液酸化作用(suboptimal sialylation)显然不同于批次4(泳道5和6)中检测的最优高度酸性亚型。泳道1，ief 3-10标记；泳道2，tr55601/批次3(8μg)；泳道3，tr55601/批次3(4μg)；泳道4和8，tr4401(1μg)；泳道5，tr55601/批次4(8μg)；泳道6，tr55601/批次4(4μg)；泳道8，ief 3-10标记。图3b显示
使用神经氨酸酶(霍乱弧菌)、ief和蛋白质印迹的带电荷的亚型的分析。未处理的tr55601/批次4样品(泳道2和3)和tr55601/批次4样品用神经氨酸酶处理，然后施加至3-10ief凝胶(泳道4-6)。泳道1，ief 3-10标记；泳道2，未处理的tr55601/批次4(8μg)；泳道3，未处理的tr55601/批次4(4μg)；泳道4，处理的tr55601/批次4(4μg)；泳道5，处理的tr55601/批次4(2μg)；泳道6，处理的tr55601/批次4(1μg)。神经氨酸酶消化的亚型的ief曲线已位移至7.8至10.0的pi范围。pi的平均位移为约5ph单位且多个带(接近10个带)转化为一个主要带(pi～9.5)和三个次要带(pi 7.8-10.0)，这表明大多数观察到的电荷异质性(图3a-批次4)依赖于末端唾液酸残基以及占较少组成的其它修饰如脱酰胺化和/或蛋白水解降解。3b所示的残余碱基带(pi 4.8-5.5)为非特异性的，衍生自神经氨酸酶制备。图3c显示tr55601-批次5的带电荷的亚型的分析，其通过在pi梯度凝胶(ief 3-10)中的ief 3-10，然后通过蛋白质印迹。泳道1，ief 3-10标记；泳道2，tr55601-批次5(4μg)；泳道3，tr55601-批次5(4μg)；泳道4，tr55601-批次4(4μg)；泳道5，tr55601-批次4(8μg)；泳道6，tr55601-批次3(4μg)；泳道7，tr55601-批次3(8μg)。图3d显示tr55601批次5的sds-蛋白质印迹分析，其与tr55601批次4和fol-v比较。泳道1，蛋白质标记；泳道2:批次4，500ng；泳道3:批次5，1ul；泳道4:空泳道；泳道5:批次4，4ug；泳道6:批次5，15ul；泳道7:fol-v，673ng；泳道8:蛋白质标记。
[0019]
图4显示在不成熟(22天龄)sprague-dawley雌性大鼠中对于卵巢重量的hcg增加的经典steelman-pohley生物测定的结果。在给药后72小时测量卵巢重量。数据表示为两个卵巢的平均总卵巢重量+sem(每次给药每组n＝5)。大鼠用补充有40iu hcg的测试制品或媒介物的一次单一注射刺激。使用以下剂量组:组1仅接受hcg(无fsh)，组2-5接受tr55601批次4(分别为0.33μg，1.0μg，3.33μg，和10μg，从左至右)，组6-8接受folltropin-(分别为3,333μg，10,000μg，and 30,000μg，从左至右)，且组9-10接受tr4401(1.0μg和3.33μg)。
[0020]
图5显示超数排卵、诱导排卵和固定时间人工受精的卵泡波同步方案。folltropin-vr(bioniche)的8次注射用单次或双次注射tr55601代替。
[0021]
图6显示在肉用母牛(beef cow)的超刺激处理过程中卵泡(直径3至5mm)的平均数，其用60μg rfsh单一肌内注射给药，或每天两次肌内注射300mg folltropin-v(对照)给药，历经4天(组合3个实验)。
[0022]
图7显示在肉用母牛的超刺激处理过程中卵泡(直径6至8mm)的平均数，其用60μg rfsh单一肌内注射给药，或每天两次肌内注射300mg folltropin-v(对照)给药，历经4天(组合3个实验)。
[0023]
图8显示在肉用母牛的超刺激处理过程中卵泡(直径>9mm)的平均数，其用60μg rfsh单一肌内注射给药，或每天两次肌内注射300mg folltropin-v(对照)给药，历经4天(组合3个实验)。
[0024]
图9显示在肉用母牛的超刺激处理过程中直径≥3mm的所有卵泡的平均直径曲线，其用60μg rfsh单一肌内注射给药，或每天两次肌内注射300mg folltropin-v(对照)给药，历经4天(组合3个实验)。
[0025]
图10a显示对于人α亚单位中的插入片段(a2)、没有氨基端缬氨酸的插入片段(插入片段2)、仅没有插入片段的5个精氨酸取代(5r)和仅介质对照的camp产生的比较。图10b显示三个测试的构建物的ec50。
[0026]
图11a显示响应于具有seq id no:1插入片段的人修饰的α亚单位和缺少所述插入
片段的牛修饰的α亚单位的camp产生的比较。图11b显示响应于有和没有各种插入片段的人修饰的α亚单位和牛的亚单位的camp产生的比较。
[0027]
发明详述
[0028]
本发明提供修饰的超活性糖蛋白激素分子，其相比它们的野生型对应物显示出人意料的增强的效力和增加的生物半衰期。被修饰的意思是，虽然所述蛋白含有不同于野生型糖蛋白激素的氨基酸序列，但是该序列并没有被改变得以至于它与另一物种的已知糖蛋白激素序列相同。用各种参数可以评价超活性，包括效力和功效。“效力(potency)”是通过测定半最大应答所确定出的生物活性的参数。通过将糖蛋白激素类似物在基线和最大值(ec
50
)之间的中间值的糖蛋白激素应答值与野生型糖蛋白激素的糖蛋白激素应答值进行比较，可以确定出效力的差异。可以用纯化蛋白在体外测定出糖蛋白激素应答，或者可以在瞬时转染编码修饰蛋白的核酸之后评估出糖蛋白激素应答。也可以在体内(即在对所述糖蛋白激素类似物有应答的动物体内)测定出糖蛋白激素应答。这些应答包括糖蛋白激素与其受体结合后的任何已知的细胞的或生物学的以及定量的或定性的应答，例如camp生成、蛋白质例如孕酮合成、受精率、胚泡形成率、每个受精卵母细胞的胚胎发育等。“功效(efficacy)”(vmax)或最大应答是另一种生物活性的参数。如在此所讨论的，取决于所测定细胞系中的受体数目和受体结合力，生物活性的参数可以有所不同。在具有低受体数目或结合较差的系统中，vmax(功效)上的差异更为明显。在受体过度表达的系统中，效力上的差异更为显著。
[0029]
例如，在修饰糖蛋白激素为修饰的fsh或cg分子的情况下，可以用对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量测定出体内定量和定性的参数例如卵母细胞的数量、受精率和胚泡及胚胎形成率。对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量是对卵母细胞的质量和数量而言为最佳量的超活性fsh。对于卵母细胞数目而言的最大有效剂量依赖于动物的体重和代谢率。例如，具有较慢代谢率的较大动物的最大有效剂量要比具有较快代谢率的较小动物的最大有效剂量更大。能经验性地确定出每只动物的最大有效剂量。
[0030]
然而，无论所使用的系统如何，相比野生型对应物，本发明的修饰的超活性糖蛋白激素蛋白质可显示效力至少约2至10倍的增加或效力至少约20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或甚至100倍的增加，或相比野生型对应物，本发明的修饰的超活性糖蛋白激素蛋白质可显示最大功效约2至10％的增加，或最大功效至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、甚至100％的增加。相比野生型fsh，本发明的超活性类似物也可提供效力约5至10倍的增加或最大功效5％至10％的增加。相比野生型，本发明的一些修饰蛋白质可显示效力至少约30至50倍的增加或最大功效30％至50％的增加。因此，本发明的修饰糖蛋白激素蛋白质可用于治疗具有低受体数目或受体响应缺陷的受试者，因为本发明的修饰蛋白质即使在具有低受体数目或响应的系统中仍可保持效力至少10倍的增加或最大功效10％的增加。
[0031]
修饰的超活性糖蛋白激素的吸收速率可导致增加的作用持续时间。具有降低的吸收速率和增加的作用持续时间的修饰糖蛋白激素类似物可有益于敏感度减弱的受试者，如患有生育障碍的那些受试者。吸收速率通过k
a
测量。消除速率通过k
e
测量。
[0032]
本发明的修饰糖蛋白激素分子包括选自以下物种的修饰蛋白质：人、牛、马、猪、绵羊、小鼠、大鼠、兔、灵长类等。鱼糖蛋白激素(也已知为gth-1)可用于水产业，即，以辅助濒
危的或其它鱼类物种的圈养生长。修饰糖蛋白激素的其它物种可用于农业育种，且还可用于实验室环境以测试不同组合的突变对不同雄性和雌性糖蛋白激素相关的状况的作用。
[0033]
其它物种的修饰糖蛋白激素分子在对应于本文公开的修饰的人(例如表1)、牛(参见表2)、绵羊、马和猪的糖蛋白激素分子的位置具有取代，其可使用任何比对程序鉴定，包括但不限于dnasis、alionment、sim和gcg程序如gap、bestfit、framealign和compare。
[0034]
本发明的修饰糖蛋白激素分子至少包含修饰的α-亚单位，其中所述α亚单位包含至少两个碱性氨基酸如赖氨酸残基。在人α亚单位中，碱性氨基酸可在野生型人α亚单位(seq id no:6)的13、14、16和20位引入。在其它物种中，碱性氨基酸可在对应于野生型牛的α(seq id no:2)、野生型猪的α(seq id no:5)和野生型绵羊的α(seq id no:3)的15、17、20和24位引入，和在对应于野生型马的α(seq id no:4)的15、20和24位引入。18位(牛、猪、绵羊和马)的谷氨酸残基也可被碱性氨基酸取代。在一些实施方案中，该碱性氨基酸可为精氨酸或组氨酸。在一些实施方案中，该碱性氨基酸可为精氨酸。
[0035]
序列为nvtinv(seq id no:1)或tnvtinv(seq id no:12)或vnvtinvt(seq id no:20)的肽可插入在人α亚单位(seq id no:6)的氨基酸d3和q5之间以及牛、猪、绵羊和马的α亚单位的f6和t7之间。或者，牛、猪、绵羊或马的修饰糖蛋白激素α亚单位可包括在f6和t7之间nv的插入片段加上t7和t8之间inv的插入片段。本发明的修饰蛋白质也可包含其它取代，特别是不改变所述蛋白质增强的性质的保守取代。然而，通常，该修饰蛋白质在以上所列位置之外的位置将包含少于5个取代，且可能在以上所列位置之外的位置显示与相应的野生型糖蛋白激素α的完全氨基酸序列同一性。
[0036]
碱性氨基酸包括氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸，以及可能为这三个氨基酸中任一个的修饰体的任何其它碱性氨基酸，通常在自然界没有的合成的碱性氨基酸，或在中性ph带正电荷的任何其它氨基酸。所述碱性氨基酸尤其选自赖氨酸和精氨酸。
[0037]
具有碱性氨基酸取代和肽插入片段的示例性修饰的α分子示于seq id no:11(人)、seq id no:7(牛)、seq id no:8(绵羊)、seq id no:10(猪)和seq id no:9(马)。本发明提供的修饰糖蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:7至11中的任一个具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
[0038]
本发明的修饰糖蛋白激素蛋白质的修饰的α亚单位也可具有包含两个、三个、四个或五个碱性氨基酸取代的α亚单位。取代的氨基酸可为赖氨酸残基、谷氨酸残基、脯氨酸残基或谷氨酰胺残基。例如，在野生型牛的α亚单位，在15、17、20和24位的一个或多个赖氨酸以及18位的谷氨酸可被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型人α亚单位中，13和20位的一个或多个谷氨酰胺以及14位的谷氨酸和16位的脯氨酸可被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型猪的α亚单位中，在15、17、20和24位的一个或多个赖氨酸以及18位的谷氨酸可被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型绵羊的α亚单位中，在15、17、20和24位的一个或多个赖氨酸以及18位的谷氨酸可被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。在野生型马的α亚单位中，15、20和24位的一个或多个赖氨酸以及18位的谷氨酸可被碱性氨基酸如精氨酸和组氨酸取代。
[0039]
作为实例，进一步修饰的牛的α亚单位存在于seq id no:13至19和22所示的序列。本发明提供的修饰糖蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:13至19和22中的任一个具有至
少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
[0040]
作为实例，进一步修饰的马的α亚单位存在于seq id no:38至42所示的序列。本发明提供的修饰糖蛋白具有的氨基酸序列与seq id no:43至45中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
[0041]
可通过与其它物种比较相关的α亚单位的氨基酸序列以鉴定出其它物种的蛋白中的相应基础残基，从而设计出进一步修饰的α亚单位。在美国专利6,361,992中阐述了这些方法，在此通过引用其全部内容将其并入本申请。对于所选定的用于比较和取代的物种，要结合考虑不同物种的糖蛋白激素的相对生物学活性。此外，基于相关糖蛋白激素的结构进行同源性建模，其可用于鉴定表面暴露出的氨基酸残基。为了修饰附加的氨基酸位点，利用标准的计算机软件程序例如dnasis(hitachi software engineering)或任一上面所列的其它比对程序(包括但不限于lionment、sim和gcg程序例如gap、bestfit、framealign和compare)都可以比对来自人和非人的糖蛋白激素序列。然后利用上面所提及的技术可以取代在人和非人的糖蛋白激素之间的有所不同的氨基酸残基，并用在此所提及的测定法中的一种测定所形成的糖蛋白激素的效力。
[0042]
因此，本发明还提供包含本文所述的修饰的α亚单位的修饰的fsh蛋白，其相比源自相同物种的野生型fsh而言具有增强的效力。
[0043]
本发明还提供包含本文所述的修饰的α亚单位的修饰的lh蛋白，其相比源自相同物种的野生型lh而言具有增强的效力。
[0044]
本发明还提供包含本文所述的修饰的α亚单位的修饰的tsh蛋白，其相比源自相同物种的野生型tsh而言具有增强的效力。
[0045]
本发明还提供包含本文所述的修饰的α亚单位的修饰的cg蛋白，其相比源自相同物种的野生型cg而言具有增强的效力。
[0046]
本发明还包括本文所述的类似物的片段，其具有超激动剂或拮抗剂活性。例如，本发明的修饰的α链的片段可单独使用，也可与片段或全长β链组合使用，以产生超激动剂化合物。在一些情况下，本发明的修饰的α亚单位分子的片段也可用作拮抗剂，例如，以限制在给药后糖蛋白激素治疗剂的活性的持续时间。
[0047]
本发明还提供编码本文所述的修饰糖蛋白激素的核酸序列。本发明还提供编码具有保守氨基酸取代的多肽的核酸。本发明的核酸可编码运输糖的多肽。分离的核酸可与上述识别的序列具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％85％、90％、95％、或99％的序列同一性。分离的核酸可编码的多肽所具有的氨基酸序列与上述识别的登记号编码的氨基酸序列具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的序列同一性。编码转运体的分离的核酸可杂交至上述识别的核酸序列。
[0048]
编码所述修饰糖蛋白激素蛋白质的核酸可遗传融合至表达控制序列以进行表达。合适的表达控制序列包括适用于靶宿主有机体的启动子。对于源自原核和真核有机体的不同宿主，该启动子是本领域技术人员众所周知的且描述于文献中。例如，该启动子可从天然存在的基因分离或可为合成或嵌合启动子。
[0049]
本发明还提供用于将编码修饰糖蛋白激素蛋白质的核酸插入靶核酸分子如载体
的表达盒(expression cassette)。出于该目的，该表达盒在5'-和3'-侧提供有核苷酸序列以促进在具体的序列位置的移除和插入，例如，限制酶识别位点或用于同源重组(例如通过重组酶所催化)的靶序列。除了本发明的核酸分子或表达盒之外，该载体可包含其它基因如标志基因，其使得所述载体可在合适的宿主细胞和在合适的条件下选择。通常，该载体还包含一个或多个复制起点。该载体还可包含终止序列以限制转录长度超过编码本发明的转运体的核酸。
[0050]
有利地，该载体中包含的核酸分子可操作地连接至表达控制序列，其允许在原核细胞或真核细胞中的表达，即保证可翻译rna的转录和合成。
[0051]
术语“分离的”是指分子从存在于大分子的天然来源中的其它细胞/组织成分(例如dna或rna)分离。本文使用的术语“分离的”还指当通过重组dna技术制备时基本上无细胞材料、病毒材料和培养基的核酸或肽，或当化学合成时基本上无化学前体或其它化学物质的核酸或肽。而且，分离的核酸或肽可包括不以片段天然存在且不以天然状态发现的核酸或肽片段。
[0052]
术语质粒和载体可互换使用，因为质粒为最常用的载体形式。然而，本发明意在包括表达载体的这些其它形式，其具有相同功能且随后在本领域变为已知。载体可为多个核酸的任一种，在该核酸中所需序列可通过限制和连接而插入以用于在不同遗传环境之间运输或用于在宿主细胞中表达。载体通常由dna组成，尽管rna载体也是可用的。载体包括，但不限于，质粒和噬菌粒。克隆载体是能在宿主细胞中复制的载体，且其特征进一步在于一个或多个核酸内切酶限制位点，在这些位点所述载体可以可确定的方式切割，且在这些位点中所需dna序列可连接使得新的重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，所需序列的复制可由于质粒以拷贝数在宿主细菌中增加而发生多次，或在宿主通过有丝分裂复制前每个宿主仅发生一次。在噬菌体的情况下，复制可在细胞溶解阶段主动发生或在生成细胞溶素阶段被动发生。
[0053]
载体还可包含启动子序列。启动子可包括通常位于编码区上游的非翻译核酸序列，其包含引发核酸转录的位点。启动子区还可包含作为基因表达的调节剂的其它成分。在本发明的其它实施方案中，表达载体包含另外的区以辅助选择掺入表达载体的细胞。启动子序列经常在其3’端以转录起始位点为界(包含端点)且向上游(5'方向)延伸以包括以背景之上可检测到的水平引发转录所需的最小数量的碱基或成分。在启动子序列中将发现转录起始位点，以及负责rna聚合酶结合的蛋白质结合域。真核启动子经常，但不总是，包含tata盒和cat盒。启动子活化对于某些细胞或组织可能是特异的，例如其通过仅在某些组织中表达的转录因子，或该启动子可能是普遍存在的且能在大多数细胞或组织中表达。
[0054]
载体还可包含一个或多个标记序列，其适合用于识别和选择已用载体转化或转染的细胞。标记包括，例如，编码增加或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性可通过本领域已知的标准测试检测的酶(例如，β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的基因，和明显影响转化或转染的细胞、宿主、集落或噬斑的表型的基因。载体可为能自发复制和表达在它们可操作连接的dna片段中存在的结构基因产物的那些载体。表达载体是指这样的载体，在该载体中所需核酸序列可通过限制和连接而插入，使得其可操作地结合或可操作地连接至调节序列且可作为rna转录物表达。表达是指细胞中内源性基因、转基因或编码区的转录和/或翻译。
[0055]
当编码序列和调节序列以将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制之下的方式共价连接时，所述编码序列和调节序列可操作地连接。如果需要将编码序列翻译为功能蛋白质，据称两个dna序列可操作连接，条件是5'调节序列中启动子的诱导导致编码序列的转录且两个dna序列之间的连接性质不会(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区引导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的rna转录物翻译为蛋白质的能力。因此，启动子区将可操作连接至编码序列，条件是启动子区能实现该dna序列的转录，使得所得转录物可翻译为所需的蛋白质或多肽。
[0056]
本发明的一些方面包括核酸的转化和/或转染。转化为将外源或异源核酸引入原核细胞内部。转染为将外源或异源核酸引入真核细胞内部。该转化或转染核酸可或可不整合(共价连接)至构成细胞基因组的染色体dna。在原核生物中，例如，该转化核酸也可保持在附加体成分如质粒或病毒载体上。关于真核细胞，稳定转染的细胞为其中转染核酸已整合至染色体的细胞，以使得其经子细胞通过染色体复制而继承。该稳定性通过真核细胞建立包含一群含转染的核酸的子细胞的细胞系或克隆的能力而证明。
[0057]
本领域技术人员已知多种能用于表达核酸插入片段的大肠杆菌(escherichia coli)表达载体。其它适用的微生物宿主包括杆菌例如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，和其它肠道细菌例如沙门氏菌(salmonella)、沙雷氏菌(serratia)和各种假单胞菌属。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，它通常含有与宿主细胞相兼容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，还可以存在任何数目的各种公知的启动子，例如乳酸启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达，任选地与操纵基因序列一起，并且具有例如启动和完成转录和翻译的核糖体结合位点序列。如果需要，通过在5’且与下游核酸插入物以符合读码框方式插入met密码子可以提供氨基末端的甲硫氨酸。并且，利用标准的寡核苷酸诱变方法可以去除核酸插入片段中的羧基末端延伸。
[0058]
另外，可以使用酵母表达。酵母表达系统具有一些优点。首先，事实表明酵母分泌系统中所产生的蛋白显示正确的二硫键配对。其次，用酵母分泌系统可以有效地实施翻译后的糖基化。酿酒酵母前α因子原前导区(mf
”-
1基因编码)常规用于指导酵母分泌蛋白(brake，proc.nat.acad.sci.，81：4642-4646(1984))。前α因子原前导区含有一个信号肽和一个包括kex2基因所编码的酵母蛋白酶的识别序列的前片段(pro-segment)：该酶在lys-arg二肽裂解信号序列的羧基侧裂解前体蛋白。可以将fsh编码序列与前α因子原前导区骨架融合。然后将该构建体放置在强转录启动子例如乙醇脱氢酶i启动子或糖酵解启动子的控制之下。核酸编码序列之后的是复制终止密码子，其之后是转录终止信号。或者，核酸编码序列可以与第二种蛋白编码序列例如sj26或β半乳糖苷酶融合，所述第二种蛋白可以有助于经亲和色谱法纯化融合蛋白。用于分离融合蛋白组分的蛋白酶裂解位点的插入可以应用于在酵母中表达的构建体。在杆状病毒系统中也可以实现重组蛋白的有效的翻译后糖基化和表达。
[0059]
哺乳动物细胞容许在有利于重要的翻译后修饰环境中表达蛋白，所述修饰例如折叠和半胱氨酸配对、添加复杂的碳水化合物结构以及分泌活性蛋白。用于在哺乳动物细胞内表达活性蛋白的载体的特征是在强病毒启动子和多腺苷酸化信号之间插入蛋白编码序列。载体可以含有赋予潮霉素耐药性、庆大霉素耐药性，或其它适用于作为选择性标记物的
基因或表型，或甲氨蝶呤耐药性以进行基因扩增的基因。利用编码甲氨蝶呤耐药性的载体可以将嵌合蛋白编码序列引入到中国仓鼠(cho)细胞系内，或者利用合适的选择标记物将嵌合蛋白编码序列引入到其它细胞系内。用southern印迹分析可以确定出载体dna在转化细胞中的存在。用northern印迹分析可以确定出对应于插入编码序列的rna的产生。在本领域已经开发出了大量的其它适合的能分泌完整的人类蛋白的宿主细胞系，其包括cho细胞系、hela细胞、骨髓瘤细胞系、jurkat细胞等。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列例如复制起点、启动子、增强子，以及必需的信息加工处理位点例如核糖体结合位点、rna剪切位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列。示例的表达控制序列是源自免疫球蛋白基因、sv40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒等的启动子。用公知的方法可以将含有相关核酸片段的载体转移到宿主细胞内，所用的方法根据细胞宿主的类型而有所不同。例如，氯化钙转化常常被用于原核细胞，而磷酸钙、deae葡聚糖或脂染介导的转染或电穿孔可以用于其它的细胞宿主。
[0060]
可以采用用于在哺乳动物细胞内表达基因的其它载体，那些与被开发用于表达人γ干扰素、组织纤溶酶原激活剂、凝血因子viii、乙型肝炎病毒表面抗原、蛋白酶nexinl和嗜酸性粒细胞的主要碱性蛋白的载体相似的载体。此外，载体可以包括可用于在哺乳动物细胞(例如cos-7)内表达所插入的核酸的多腺苷酸化信号和cmv启动子序列。
[0061]
可以在体内或体外表达基因或杂合基因。体内合成包括转化可以充当载体的宿主细胞的原核或真核细胞。或者，可以在体外表达系统中进行基因表达。例如，可以商业化获得体外转录系统，其可被常规地用于合成相对大量的mrna。在这些体外转录系统中，将编码糖蛋白激素的核酸克隆到表达载体内，邻近于转录启动子。例如，bluescript ii克隆和表达载体含有多个克隆位点，其位于原核细胞的强转录启动子(stratagene)的侧面。可以获得含有所有从dna模板例如bluescript载体体外合成rna所必需的试剂的试剂盒(stratagene)。然后可以在体外翻译如上系统在体外所生成的rna，以生成所需的糖蛋白激素(stratagene)。
[0062]
生成糖蛋白激素的另一种方法是用蛋白化学技术将两种肽或多肽连接在一起。例如，利用目前可获得实验室设备，利用fmoc(9-芴甲氧羰基)或boc(叔丁氧羰基)化学可以化学合成肽或多肽(applied biosystems)。本领域技术人员可以容易地认识到用标准的化学反应可以合成对应于杂交糖蛋白激素的肽或多肽。例如，肽或多肽可以被合成并且不将其从合成树脂中裂解下来，而杂交肽的其它片段可以被合成并随后从树脂中裂解下来，据此暴露出在其它片段中被功能封闭的末端基团。通过肽缩合反应，这两种片段可以分别经其羧基和氨基末端的肽键共价地连接在一起，以便形成杂交肽。(grant，synthetic peptides：a userguide，w.h.freeman(1992)and bodansky，principles of peptide synthesis，springer-verlag(1993))。或者，如上所述可以体内独立地合成肽或多肽。一旦分离出肽或多肽，经相似的肽缩合反应可以将这些独立的肽或多肽连接在一起形成糖蛋白激素。例如，所克隆的或合成的肽片段的酶的或化学的连接可以容许相对短的肽片段连接在一起，生成更大的肽片段、多肽或整个蛋白结构域(abrahmsen，biochemistry，30:4151(1991)；dawson，science，266:776-779(1994))。
[0063]
本发明的修饰糖蛋白激素可以是通过将编码多肽的核酸克隆到能生成多肽片段的表达系统内所获得的重组蛋白。例如，可以确定出修饰的α亚单位的活性结构域，其与β亚
单位一起可以与糖蛋白激素受体相互作用并引起与糖蛋白激素相关的生物效应。在一个实例中，可以删除所发现的不会影响糖蛋白激素的活性或结合特异性或亲和力的氨基酸，且不会丧失相应的活性。
[0064]
例如，可以依次去除天然或修饰的糖蛋白激素中的氨基或羧基末端的氨基酸，并在如上所述的多种可获得的测定法中的一种测试相应的活性。在另一个实例中，可以用多肽片段或其它部分(例如生物素)取代本发明的修饰蛋白中的氨基末端或羧基末端或者甚至激素的内在区域的一部分，所述多肽片段或其它部分可以有助于修饰的糖蛋白激素的纯化。例如，通过将编码两种多肽片段的相应的核酸克隆到表达载体内使得编码区的表达生成杂交多肽的肽化学，可以将修饰的糖蛋白与麦芽糖结合蛋白融合。通过使得杂交多肽经过直链淀粉亲和柱，可以亲和纯化所述杂交多肽，然后通过用特异的蛋白酶因子xa裂解杂交多肽，可以将修饰的糖蛋白与麦芽糖结合区域分离开来。
[0065]
也可以直接地合成或者可以通过化学地或机械地分裂更大的糖蛋白激素来获得本发明的修饰糖蛋白激素分子的活性片段。活性片段被定义为源自天然存在的氨基酸序列的至少约5个连续氨基酸的氨基酸序列，其具有相关的活性例如结合或调节活性。无论是否与其它的序列相连接，片段也可以包括插入、缺失、取代、或其它所选的对具体区域或特定氨基酸残基的修饰，只要肽的活性与修饰的糖蛋白的活性相比而言没有被显著地改变或削弱。这些修饰可以提供一些附加的性能，例如去除/添加能形成二硫键的氨基酸以便增加其生物寿命等。在任何情况中，肽必须具备生物学活性的性能，例如结合活性、调节结合区域的结合的活性等。通过对激素的特定区域的诱变作用，以及随后的表达及对所表达多肽的测试，可以鉴定出糖蛋白激素的功能的或活性的区域。这些方法对于本领域人员是显而易见的，并且可包括对编码受体的核酸的位点特异性的诱变作用。
[0066]
本发明也包括包含本申请所述的突变的融合蛋白和嵌合蛋白，例如包括与fsh糖蛋白的融合。通过用本领域已知的方法在正确的编码框中彼此连接编码所需氨基酸序列的合适的核酸序列，并用上面所述的任一方法表达融合蛋白，可以生成这样一种融合蛋白。或者，用蛋白合成技术例如用肽合成仪可以生成这样一种融合蛋白。本发明的单链类似物和嵌合蛋白可以在其α和β亚单位之间或在嵌合蛋白的不同部分之间整合有肽连接物。
[0067]
糖蛋白激素超激动剂的表征
[0068]
本文所述的对野生型糖蛋白激素的一种或多种修饰的作用可以任意数量的途径确定。例如，用编码修饰糖蛋白激素的核酸转染的细胞中第二信使系统的变化可进行测量且与用编码野生型糖蛋白激素的核酸转染的类似细胞比较。或者，修饰糖蛋白激素的活性可从受体结合测试、胸苷摄取测试、孕酮产生测试或t4分泌测试确定。本领域技术人员可容易确定使用任何合适的测试来确定野生型或修饰糖蛋白激素的活性。
[0069]
在本发明一个实施方案中，该修饰糖蛋白激素具有的效力比野生型糖蛋白激素的效力增强。该增强的效力可通过任何上述技术或本领域技术人员容易确定的任何其它合适的测试评估。增强的效力在每种测试之间或每种细胞系之间不必一致，因为这些效力当然会改变。
[0070]
在本发明另一实施方案中，该修饰糖蛋白激素具有的最大功效相比野生型糖蛋白激素的最大功效增加。该增加的最大功效可通过上述任意技术或本领域技术人员容易确定的任何其它合适的测试评估。该增加的最大功效在每种测试之间或每种细胞系之间不必一
致，因为这些最大功效当然会改变。
[0071]
在pct/us99/05908中描述了适用于表征本申请所述的类似物的其它测定法，在此通过引用将其全部内容并入本申请。例如，可以施用各种免疫测定法，其包括但不限于利用如下技术的竞争性和非竞争性测定系统：例如放射免疫测定法、elisa、等电点聚焦(ief)测定法、三明治免疫测定法、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、原位免疫测定法、western印迹法、沉淀反应法、凝集测定法、补体固定测定法、免疫荧光测定法、蛋白a测定法和免疫电泳测定法等。
[0072]
例如，当β亚单位为fsh的β亚单位时，卵母细胞质量和数量的改善可通过体外和体内测试评估。超活性fsh可用于改善动物的卵母细胞的质量和数量，所述动物包括但不限于，人、小鼠、大鼠、灵长类、兔、猪、马、羊和狗。优选地，将超活性fsh给予人或任何动物。通常卵母细胞的质量和数量的改进可使用体外受精过程如卵母细胞形成、卵母细胞受精和胚泡形成的不同终点确定。体外受精实验可按照“超数排卵方案”，其中受试者用本发明的超活性fsh类似物处理，其导致多个卵母细胞的释放和成熟。在体外受精实验中，fsh(超活性fsh和重组野生型fsh)可与hcg一起给予以引起排卵。可使用仅接受hcg或孕马血清促性腺素(pmsg)的对照动物。卵母细胞的质量可通过增加动物中卵母细胞的受精率而改善。超活性促卵泡激素的受精率可通过比较使用超活性fsh达到的受精率与使用相同量的重组野生型fsh实现的受精率在体内或体外确定。也可使用接受hcg的对照动物。受精率可通过基于卵母细胞总数的发育的两细胞胚胎的百分比而测量。如果受精在体外发生，两细胞胚胎可在受精培养皿中计数。在小鼠中，两细胞胚胎在受精后约24小时发育。受精率基于给予的超活性fsh的量而改变。动物可接受多剂量的超活性fsh。由于以卵母细胞数量的最大有效剂量给予超活性fsh，受精率增加至少约10％。由于以卵母细胞数量的最大有效剂量给予超活性fsh，受精率可增加至少约20％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。超活性促卵泡激素可通过改善基于每个受精的卵母细胞的胚泡形成率而改善卵母细胞的质量。胚泡形成率可通过测定形成胚泡的两细胞胚胎的百分比而测量。无论胚泡体内或体外形成，胚泡形成率都增加。胚泡形成率取决于给予的超活性促卵泡激素的量。由于以卵母细胞数量的最大有效剂量给予超活性促卵泡激素，胚泡形成率增加至少约10％。由于以卵母细胞数量的最大有效剂量给予超活性fsh，胚泡形成率可增加至少约20％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
[0073]
超活性促卵泡激素可通过增加每个受精的卵母细胞的胚胎总数而改善卵母细胞的质量。无论受精在体内或体外发生，基于每个受精的卵母细胞的胚胎总数增加。基于每个受精的卵母细胞的胚胎总数的增加取决于给予的超活性促卵泡激素的量。由于以卵母细胞数量的最大有效剂量给予超活性促卵泡激素，基于每个受精的卵母细胞的胚胎总数增加至少约10％。由于以卵母细胞数量的最大有效剂量给予超活性fsh，基于每个受精的卵母细胞的胚胎总数可增加至少约20％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
[0074]
例如，当β亚单位为cg的β亚单位，有效的促黄体激素(lh)-状活性可通过体外和体内生物测定评估。在某些物种中超活性cg诱导排卵，延长黄体寿命，增加孕酮合成且促进附属黄体形成。在某些物种中这些作用导致更有效的卵母细胞收集、卵母细胞质量增加、妊娠和妊娠维持率增加。
[0075]
具有增加的血清半衰期的糖蛋白激素类似物
[0076]
本发明的修饰糖蛋白激素蛋白质还可以被进一步地修饰，使得血浆半衰期比野生型对应物的半衰期更长。本发明的修饰糖蛋白激素蛋白质还可以包括潜在的糖基化位点，所述位点包括含n-糖基化和/或o-糖基化位点的序列。例如，将肽nvtiv(seq id no:1)或vnvtinvt(seq id no:20)置于α亚单位中提供α亚单位潜在的糖基化位点。seq id no:20或seq id no:1的肽可置于d3和q5之间的人野生型序列中。seq id no:20或seq id no:1的肽可置于牛、马、猪和绵羊的野生型序列的f6和t7之间。插入的肽在氨基端可包含另外的苏氨酸残基。可插入以改变糖基化的其它肽包括nv、inv和tnv肽，以及tnvtinv(seq id no:12)。例如，糖激素修饰的α亚单位可包括在f6和t7之间nv的插入片段加上t7和t8之间inv的插入片段。增加的半衰期也可通过其它合适的化学基团的聚乙二醇化或缀合或通过构造具有增加的半衰期的融合蛋白或通过任何其它方法而提供。这些方法是本领域已知的，例如描述于美国专利5,612,034、美国专利6,225,449和美国专利6,555,660，在此通过引用将其全部内容并入本申请。
[0077]
通过增加分子内的带负电荷残基(例如谷氨酸和/或天冬氨酸残基)的数目也可以增加半衰期。通过定点诱变方法可以实现这些改变。通过往所述修饰糖蛋白激素蛋白质中插入含有一个或多个带负电荷残基的氨基酸序列也可以实现这些改变。
[0078]
蛋白的半衰期是蛋白稳定性的量度，且表明蛋白浓度降低一半所需的时间。通过任一适用于测定一段时间内的受试者样品中的激素水平可以确定出本申请所述的修饰糖蛋白激素蛋白质的血清半衰期，所述方法例如，但不限于，利用抗体的免疫测定法以测量在施用修饰糖蛋白激素蛋白质一段时间后所采集的血清样品中的水平，或者通过检测在施用标记的糖蛋白激素后所采集的受试者血清样品中的标记的激素分子，即放射性标记的分子。
[0079]
治疗方法
[0080]
本发明的修饰糖蛋白激素蛋白质可用于治疗任何与糖蛋白激素活性相关的疾病。本发明的修饰糖蛋白激素蛋白质可用于治疗有此需要的受试者。受试者可为动物，如哺乳动物、爬行动物、鱼、鸟和两栖动物。该受试者可为哺乳动物，如人、牛、羊、猪或马。动物包括家畜和家养宠物，如狗和猫。该受试者可为需要改善的糖蛋白激素活性的人患者或动物。与糖蛋白激素活性相关的病症是完全或部分由改变了的糖蛋白激素应答性所引起的病症，或者能从施用糖蛋白激素中获益的病症。例如，这些病症包括，但不限于排卵功能障碍、黄体期缺陷、原因不明的不育症、雄性因素的不育症、限时怀孕、fsh受体低表达、fsh受体低敏感性、fsh受体结合缺陷、fsh受体偶联缺陷、低睾酮生成、男性型脱发症和垂体衰竭或损伤。
[0081]
例如，通过对动物施用本申请所述的超活性fsh类似物可以提高卵母细胞的数量和质量。例如，申请人惊奇地发现通过施用含有修饰的α亚单位的超活性fsh，获得了卵母细胞的数量和质量的显著增加。通过增加超活性fsh的fsh血清半衰期，可以进一步增强超活性fsh对卵母细胞的数量和质量的作用。通过进一步地修饰超活性fsh可以增加fsh血清半衰期。可以用更多的修饰(包括但不限于前面所述的那些修饰)增加fsh血清半衰期。
[0082]
也可以在男性或女性受试者的辅助生殖的治疗方案中使用本发明的修饰的fsh、cg、lh或tsh糖蛋白激素蛋白质，包括对受试者施用辅助量的修饰的糖蛋白激素蛋白质。在这些方法中，类似物可以单独地施用或与其它的治疗药物组合施用，其它的治疗药物例如包括但不限于柠檬酸氯米芬和gnrh(促性腺释放激素)。本发明的修饰糖蛋白激素蛋白质可
以一种或多种糖蛋白的组合而给予。例如，修饰的α亚单位可与fshβ亚单位、cgβ亚单位、tshβ亚单位和/或lhβ亚单位一起或分开组合，且然后将修饰的糖蛋白给予受试者。例如，在患有单一性促性腺激素缺陷症(igd)的受试者中，可以对受试者施用修饰的fsh、cg、tsh和lh，以便恢复正常的性腺功能。本领域所广泛认同的是，糖蛋白激素(例如fsh、cg、tsh和lh)在雌性生殖生理中是一个整体，且可以对受试者施用这些糖蛋白激素以便克服大量的生殖疾病并据此辅助生殖。
[0083]
针对修饰的马的cg糖蛋白测试单一和多重注射给药方案。对于在马、牛或猪中使用ecg类似物的超刺激，使用单一或2:1分批ecg类似物注射。ecg类似物的剂量范围研究包括单一肌内注射30、45、60、75、90、105和120mcg。优化的剂量以2:1比例测试，且在第6天或另一天任选的第二分批剂量将与pgf2α治疗一致。在马、牛和猪中用修饰的ecg治疗产生超数排卵。
[0084]
本领域的技术人员可以容易地确定出所施用的有效量的糖蛋白激素，这将取决于例如体重、体格、具体病症的严重度和受试者本身的类型等因素。通过常规的优化方法可以容易地确定出治疗有效量。本发明提供了具有比野生型糖蛋白激素更强效力的糖蛋白激素。这些修饰的糖蛋白激素将容许本领域人员施用比野生型糖蛋白激素更小剂量的修饰的糖蛋白激素，以获得相似的治疗效果，或者施用与野生型糖蛋白激素相似剂量的修饰的糖蛋白激素，以获得更高的治疗效果。
[0085]
取决于是否口服、肠胃外或其它方式施用糖蛋白激素，所施用的前列腺素可以是固体、半固体形式或液体剂型的形式，例如片剂、丸剂、胶囊、粉末、液体、乳膏和悬浮液等，优选地是适用于递送精确剂量的单位剂型。糖蛋白激素可以包括与药用可接受的载体组合的有效量的所选的糖蛋白激素，另外还可以包括其它的药剂、药物、载体、辅料、稀释剂等。“药用可接受的”意思是非生物的或非必需的物质，即该物质可以与所选的糖蛋白激素一起对个体施用且不引起不可接受的生物效应或以不可接受的方式与糖蛋白激素相互作用。制备这些剂型的实际方法对于本领域人员是已知的或者是显而易见的，例如参见最新版的remington's pharmaceutical sciences(mack publishing)。
[0086]
提供以下实施例以描述和示例说明本发明。由此它们不应被理解为限制本发明的范围。本领域技术人员将理解许多其它实施方案也落在本发明的范围内，如上文和权利要求所描述。
实施例
[0087]
α亚单位类似物的设计
[0088]
在q13r+e14r+p16r+q20r(人4r)具有对α-亚单位的修饰且具有野生型β-亚单位的人fsh超激动剂糖蛋白相比其野生型对应物而言显示显著的结合优越性。
[0089]
表1显示人α野生型(wt)和选择的hfsh超激动剂一级氨基酸结构的比较。示出了人α野生型的n-端部分(总计92个残基的氨基酸残基1-28)和突变形式的n-端部分。4个超激动剂精氨酸(r)取代的位置在阴影区。引入一个或两个另外的n-连接的碳水化合物链的所选的4个不同插入片段在野生型序列的氨基酸d3和q5之间标记。
[0090]
表1.
[0091][0092]
表1中的片段如下所列:seq id no:43:hfsh wt；seq id no:33，hfshα(4r)；seq id no:34，hfshα(4r+insl)；seq id no:35，hfshα(4r+ins2)；seq id no:36，hfshα(4r+ins3)；seq id no:37，hfshα(4r+ins4)。
[0093]
在一些实施方案中牛的fsh(bfsh)取代高度类似于人fshα亚单位中之前诱变处理的残基且包括5个突变的组合，称为“5r”(k15r+k17r+e18r+k20r+k24r)。例如seq id no:7。为增加引入的糖基化识别序列(nxt或nxs)导致n-连接的碳水化合物链的附接的可能性，建立18个不同的牛α亚单位构建物且克隆至之前开发的表达载体中。12个构建物包含n-端延伸肽序列anitv、antta、antsa、anitvnitv、antsantta和antsantsa。
[0094]
表2显示牛的α野生型(wt)和所选的bfsh超激动剂一级氨基酸结构的比较。显示了牛的α野生型的n-端部分(总计96个残基的氨基酸残基1-32)和突变的牛α的n-端部分。5个超激动剂精氨酸(r)或赖氨酸(k)取代的位置标注在氨基酸c14和p25之间的阴影区，编码为4r+1k的5r。引入一个或两个另外的n-连接的碳水化合物链的所选的4个不同插入片段在野生型序列的氨基酸f6和t8之间标记。
[0095]
表2中的片段如下所列:seq id no:44，wt bfsh；seq id no:23，bfshα(5r)；seq id no:24，bfshα(4r+1k)；seq id no:25，bfshα(5r+ins l)；seq id no:26，bfshα(5r+ins2)；seq id no:27，bfshα(5r+ins3)；seq id no:28，bfshα(5r+ins4)；seq id no:29，bfshα(4r+1k+ins l)；seq id no:30，bfshα(4r+1k+ins2)；seq id no:31，bfshα(4r+1k+ins3)；seq id no:32，bfshα(4r+1k+ins4)。
[0096]
表2
[0097][0098]
也制备包括突变的马糖蛋白α亚单位，且一些实施方案包括k15r、e18r、k20r和k24r的取代。例如seq id no:9；seq id no:38-40。此外，也产生具有k15r、e18h、k20r和k24r的马糖蛋白α亚单位(例如seq id no:41；seq id no:42)。这些突变的α亚单位还包含所述亚单位的f6和t7之间的nvtint的插入片段(例如seq id no:9、40和42)，或包含f6和t7之间nv插入片段加上t7和t8之间的inv插入片段(例如seq id no:38、39和41)。
[0099]
相比基于脂转染胺(lipofectamine)的方法，使用聚乙烯亚胺(pei)瞬时转染bfsh类似物导致bfsh类似物表达的3.7-4.5倍增加(数据未显示)。基于杂二聚体-特异的elisa
1263，1996；szkudlinski，physiol.rev.82:473-502，2002)，且在与位于糖蛋白激素受体的铰链区的带负电荷的群簇的静电相互作用方面起了重要的作用(mueller，trends endocrinol.metab.21:111-122，2010；mueller，j.biol.chem.284:16317-16324，2009；mueller，endocrinol.152:3268-3278，2011)。特异的bfsh超激动剂开发包括4-5r和/或k的最小取代以制备更有效力和更有功效的分子，该分子具有可能的延迟吸收以增加作用持续时间，如本文数据以及其它对hfsh和其它糖蛋白激素类似物的研究所示(szkudlinski，physiol.rev.82:473-502，2002)。也研究了最小长度氨基酸插入片段，其包含一个或两个碳水化合物新糖基化位点以增加半衰期来制备单一注入类似物而不降低所增加的超激动剂效力/功效(参见图4)。对于进一步的分析，可使用包含位于野生型序列的氨基酸6和8之间的肽插入片段nvtinv、nvtinvt、nv和nvt的8个构建物。如本文的数据所示且不同于之前的新糖基化和聚乙二醇化研究(trousdale，feril.steril.91:265-270，2009；uchiyama，vet j.184:208-21 1，2010；perlman，j.clin.endocrinol.metab.88:3227-3235，2003)，可设计包含复合碳水化合物的最小长度的氨基酸插入片段以增加半衰期而不降低所增加的超激动剂效力/功效。这些新的类似物可通过使用优化的高表达系统方法使用pei和滚瓶在cho-k1细胞中瞬时转染而表达。
[0103]
通过瞬时转染表达的所选的4-6个类似物的纯化可通过以下进行：使用捕捉步骤使用sp sepharose柱，然后使用mono q离子交换色谱法选择类似物，然后使用凝胶过滤最终精制(polish)。bfsh类似物的纯度可大于98％。累积回收可达50％，且具有总共50倍纯化。所有类似物可通过elisa免疫测定、使用cho-fshr细胞系的稳固体外camp生物测定、sds-page电泳和等电点聚焦(ief)凝胶分析而进行体外表征。所选的纯化类似物也可通过严格定量通过反相hplc、碳水化合物组成分析以及稳定性和聚集状态评估而分析。
[0104]
其它实验生成了牛的fsh类似物tr55601(α亚单位:seq id no:7)，其包括在α亚单位的15k、17k、18k、20k和24k取代为精氨酸(r)以及在α亚单位的6f和7t之间具有nvtinv(seq id no:1)插入片段。生成了多批次tr55601且使用ief和蛋白质印迹分析测试。图3a-d显示该分析的示例性结果。图3a-3d部分证实tr55601/批次4和批次5显示最优分布且证实突变在该批次的有效性。批次4和5以及具有类似筛选结果的批次在动物治疗中使用。例如，在图3a-c中该ief-蛋白质印迹分析显示了批次4和批次5的tr56001的优化的酸性亚型。另一方面，如图3a和3c所示，批次3没有完全验证且没有在动物治疗中使用。该bfsh类似物且特别是tr55601的样品也用pk筛选测定在小鼠中进行了研究。对小鼠皮下注射选择的bfsh样品且血样在注射后24、32和48小时采集。分离血浆且用bfsh elisa(endocrine technologies，inc.)分析。tr55601样品的批次4的延长的半衰期用pk筛选测定得到证实。数据未显示。
[0105]
所选的候选类似物的完全药代动力学分布可通过皮下给药单剂量的10μg/大鼠且在跨越分布和消除阶段的10个不同的血液收集时间(1、5、15、30分钟和1、2、6、24和48h)进行。牛的fsh血浆水平可在血浆中使用bfsh-elisa定量。可进行完全pk分析。
[0106]
选择类似物以用于构建双顺反子表达载体，且在cho-dg44细胞中选择和扩增类似物表达为在牛中大规模制备、纯化和超数排卵研究做准备。将cho-dhfr(-)dg44细胞用表达载体共转染且在包含逐步增加的甲氨蝶呤(mtx)的培养基中进行基因扩增。细胞在恢复它们的多边形形态后(2-3周)有资格用于随后的扩增步骤。分泌水平>2pg/细胞/天的克隆可
进行第二次处理，旨在扩增gs标记基因(msx)。可获得另外的2-5倍增加，达到多达10pg/细胞/天的分泌水平。
[0107]
使用α亚单位类似物的制备和实验
[0108]
尽管在单一肌内(i.m.)注射后rfsh诱导超数排卵响应，且60μg似乎非常接近最优剂量，但当母牛暴露于rfsh三次或更多次时，超数排卵响应有显著降低。因此，设计实验以检测一种新的rfsh制剂，称为tr 55601rfsh，其包括具有“5r”取代和在f6和t7之间的nvtint插入片段的α亚单位(seq id no:7)。其目的是首先确定用rfsh单一或分批剂量治疗肉用母牛来诱导超数排卵响应的效果，然后进一步评估单一注射rfsh的超数排卵响应和确定当母牛暴露于rfsh两次或三次时超数排卵响应是否保持较高。
[0109]
tr55601 fsh样品在大鼠体内使用经典steelman-pohley fsh生物测定分析(steelman等人，endocrinol.53:604-616，1953)。对雌性sprague-dawley大鼠(200-220g)注射单一剂量的补充有40iu hcg的测试制品(例如bfsh)或媒介物。卵巢重量在给药后72小时测量。参见图4。各组用hcg处理以提供基线。tr55601 bfsh在所有浓度均显著增加卵巢重量。
[0110]
图5显示超数排卵、诱导排卵和固定时间人工受精的卵泡波同步方案，其中folltropin-vr(bioniche)的8次注射用单次或两次注射tr55601代替。治疗包括在第0天插入释放孕酮(p4)的阴道内设备和给药苯甲酸雌二醇(be)。超数排卵治疗在第4天开始，其使用tr55601作为单一或两次注射给予。第二次分剂量注射与pgf
2α
治疗在第6天同时发生。在第7天最后注射fsh后去除孕酮设备。在第8天供体接受猪的lh且在12和24小时后在没有发情期检测的情况下授精，或在第8天受精一次(plh后16h)。在第15天非手术地收集卵细胞/胚胎(2，3)。folltropin-用作对照；在8次肌内(im)注射中给予总共300mg*，每天两次，历时4天(mg*-基于高度不纯的nih-fsh-p1参照标准)。
[0111]
具体地，将30只非哺乳中的red angus母牛分组且基于它们之前的胚胎产生历史阻断，并随机分配至三个治疗组之一。对照组的母牛(n＝10)接受300mg folltropin-v，每天两次以逐渐降低的剂量方案肌内给药，历经4天的周期。具体地:第4天，3.0ml(am和pm)；第5天，2.5ml(am和pm)；第6天，1.5ml(am和pm)；和第7天，0.5ml(am和pm)。rfsh 60μg治疗组的母牛接受单一肌内注射60μg rfsh，且rfsh 40-20μg治疗组的母牛在第4天接受肌内注射40μg rfsh，然后在第6天再肌内注射20μg rfsh。
[0112]
然后，30只母牛中的25只再用folltropin-v(对照)或单一注射60μg rfsh进行超刺激。对照组中的动物(n＝10)保持在对照组中，且实验1中以rfsh 60μg治疗的10只母牛中的8只再通过单一肌内注射rfsh而治疗。而且，之前用分批-单一注射rfsh治疗的10只母牛中的7只用单一肌内注射rfsh治疗。胚胎收集之间的间隔为29天。
[0113]
第二实验中使用的25只母牛中的24只再用folltropin-v(对照)或单一注射60μg rfsh进行超刺激。同样，对照母牛保持在对照组中且rfsh母牛保持在rfsh组中。胚胎收集之间的间隔为30天。
[0114]
在第0天(实验开始时)，所有动物接受5mg雌二醇-17β加上50mg孕酮和充满孕酮的阴道内设备(cue-mate，bioniche animal health)。在第4天(卵泡波出现的预期天)，所有母牛根据上述组进行超刺激。单一肌内注射rfsh的60μg剂量构成了7.5ml，且folltropin-v以逐渐降低剂量的方案在8次肌内注射中给予。所有动物在第6天早上和晚上肌内接受500μ
g氯前列醇(cyclase，syntex，argentina)。cue-mate在第6天晚上移去。在第8天早上，母牛接受100μg戈那瑞林(gonasyn，syntex argentina)且在12和24小时后授精。所有母牛用源自相同公牛的冷冻精液授精。卵细胞/胚胎在第15天非手术收集且根据iets推荐评估。
[0115]
所有母牛在0、4、6和8天超声检查cl的存在和卵泡尺寸和数量且确定卵泡生长分布。通过在第15天超声波检查和直肠触诊计数cl和直径>10mm的卵泡的数量而证实排卵响应。
[0116]
在各实验中，对数据点首先评估其变量的常规性和均质性。因为变量在组间不同，数据通过平方根转化且通过单因素anova分析。三个实验得出结论后对总体响应的分析将通过双因素anova完成以检测实验次数和治疗的效果以及它们的相互作用。平均值通过保护的lsd测试对比。卵泡数据通过mixed程序分析以检测治疗、天数和它们的相互作用对卵泡数和生长概况的作用。所有分析使用infostat analytical软件(universidad nacional de cordoba，argentina)完成。
[0117]
超数排卵响应和卵细胞/胚胎数据总结于表3。尽管在各组之间cl和具有≤2cl的母牛的平均数在卵细胞/胚胎收集当天没有不同，但分批-注射的rfsh导致更高的(p<0.05)数量的未排卵的卵泡。总卵细胞/胚胎、受精的卵细胞和可转移胚胎(1，2&3级)的平均数也没有不同。
[0118]
表3显示使用单一或分批-单一给予tr55601(rfsh)的超数排卵。
[0119]
表3:在用单一(60μg)或分批-单一(40-20μg)肌内注射rfsh(tr55601)处理或以每天两次肌内注射300mg folltropin-(对照)4天处理的肉用母牛中，黄体(cl)、直径>10mm的卵泡、在卵细胞/胚胎收集时具有≤2cl的母牛数、卵细胞/胚胎的数量、受精的卵细胞的数量和1、2和3级胚胎(可转移胚胎)的数量的平均(
±
sem)值。
[0120][0121]
第二次给药的超数排卵响应和卵细胞/胚胎数据总结于表4和5。在卵细胞/胚胎收集当天各组之间的cl、>10mm的卵泡和具有≤2cl的母牛的平均数没有不同。总卵细胞/胚胎、受精的卵细胞和可转移胚胎(1，2和3级)的平均数在各组之间也没有不同。
[0122]
表4和5显示使用单一给药tr55601(rfsh)的超数排卵。
[0123]
表4.cl、直径>10mm的卵泡和在卵细胞/胚胎收集时具有≤2cl的母牛的数量的平均(
±
sem)值。母牛用单一(60μg)肌内注射rfsh或以每天两次肌内注射300mg folltropin-v(对照)4天来处理。
[0124][0125]
表5.在用单一(60μg)肌内注射rfsh(tr55601)处理或以每天两次肌内注射300mg folltropin-(对照)4天处理的肉用母牛中，卵细胞/胚胎、受精的卵细胞和1、2和3级胚胎(可转移胚胎)的数目的平均(
±
sem)值。
[0126][0127]
对于最终给药实验，仅有卵泡数据在此时可得。在授精前那天的卵泡生长曲线和卵泡数在rfsh和folltropin-v组之间没有显著差异。排卵和卵细胞/胚胎数据随后可得且将单独对实验3呈现，然后与实验1和2合并。实验3的卵泡数据是可得的且已与实验1和2的数据合并并呈现在表6。
[0128]
表6显示以30天的间隔使用tr55601(rfsh)的三个超数排卵。
[0129]
表6.在用单一(60μg)或分批-单一(40-20μg)肌内注射rfsh(tr55601)处理或以每天两次肌内注射300mg folltropin-(对照)4天处理的肉用母牛中，cl、直径>10mm的卵泡、在卵细胞/胚胎收集时具有≤2cl的母牛数、卵细胞/胚胎的数量、受精的卵细胞的数量和1、2和3级胚胎(可转移胚胎)的数量的平均(
±
sem)值。母牛以～30天间隔连续三次处理(合并3个实验)。
[0130][0131]
从治疗开始直到紧接人工受精之前的卵泡特征示于表7和图6-9。
[0132]
表7显示不产奶的母牛中超数排卵模型中的卵泡数。卵泡发育(平均值
±
sem)通过超声波检查肉用母牛而检测，该牛用60μg rfsh单一肌内注射处理或用300mg-v每天两次肌内注射4天而处理。
[0133]
表7.
[0134][0135]
直径3至5mm的卵泡数在各治疗组之间没有区别(图6)。而且直径6至8mm的卵泡数(图7)、>9mm的卵泡数(图8)或在历经该治疗天数的平均卵泡直径(图9)也没有不同。
[0136]
该系列实验中所得的结果可解释为表明该rfsh产物诱导肉用母牛的超数排卵响应，其与folltropin-v没有不同。当母牛被连续治疗三次时，相比folltropin-v，超数排卵响应也没有下降的迹象。最终给药中的超数排卵响应似乎类似于前两次给药，这将在卵细胞/胚胎收集后得到证明。对于用rfsh处理的母牛中大量未排卵的(>10mm)卵泡(主要是由于在两只牛中大量的未排卵的卵泡)存在关注，其需要进一步研究。还需要更多研究来确定使肉牛和奶牛超数排卵的rfsh最优剂量的和确定连续用rfsh治疗三次以上的长期效果。
[0137]
插入片段对改善半衰期的特异性
[0138]
为确定观察到的改善的半衰期是否对seq id no:1插入片段的序列特异，修饰了具有插入片段的人α亚单位以去除氨基终末缬氨酸。然后测试该两者的产生camp的能力，并测试缺少该插入片段的类似物。该研究显示该插入片段是序列特异的且对α亚单位赋予优异的结合和半衰期(参见图9)。然后在各种生长条件检查产生条件以优化达到最大产生(参见表8)。
[0139]
表8显示人α亚单位的产生的优化。
[0140][0141]
该插入片段然后与牛的对应物一起检查，且证实增加的半衰期对于插入片段的序列是特异的(参见图11)。
[0142]
本申请包括以下技术方案：
[0143]
1.修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的q13、e14、p16和q20具有至少一个保守碱性氨基酸取代且在d3和q5之间具有vnvtinvt(seq id no:20)的插入片段。
[0144]
2.实施方案1的修饰糖蛋白激素，其在q13、p16和q20包含至少两个碱性氨基酸取代。
[0145]
3.实施方案1的修饰糖蛋白激素，其在q13、p16和q20包含三个碱性氨基酸取代。
[0146]
4.实施方案1至3任一项的修饰糖蛋白激素，其还在e14包含碱性氨基酸取代。
[0147]
5.实施方案1至4任一项的修饰糖蛋白激素，其中该碱性氨基酸为精氨酸。
[0148]
6.实施方案1的修饰糖蛋白激素，其中该α亚单位包含与seq id no:11具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0149]
7.实施方案1的修饰糖蛋白激素，其还包含黄体化激素(lh)的β亚单位。
[0150]
8.实施方案1的修饰糖蛋白激素，其还包含绒毛膜促性腺素(cg)的β亚单位。
[0151]
9.实施方案1的修饰糖蛋白激素，其还包含促卵泡激素(fsh)的β亚单位。
[0152]
10.实施方案1的修饰糖蛋白激素，其还包含促甲状腺激素(tsh)的β亚单位。
[0153]
11.实施方案1的修饰糖蛋白激素，其中所述α亚单位衍生自人α亚单位(seq id no:6)。
[0154]
12.刺激动物糖蛋白受体的方法，包括向动物给药实施方案1至11任一项的修饰糖蛋白激素。
[0155]
13.刺激动物排卵的方法，包括向动物给药实施方案1至11任一项的修饰糖蛋白激素。
[0156]
14.实施方案12至13任一项的方法，其中所述动物为人。
[0157]
15.修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的k15、k17、k20和k24具有至少一个保守碱性氨基酸取代且在f6和t7之间具有nvtinv(seq id no:1)的插入片段。
[0158]
16.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其在k15、k17、k20和k24包含至少两个碱性氨基酸取代。
[0159]
17.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其在k15、k17、k20和k24包含至少三个碱性氨基酸取代。
[0160]
18.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其在k15、k17、k20和k24包含四个碱性氨基酸取代。
[0161]
19.实施方案15至18任一项的修饰糖蛋白激素，其还在e18包含碱性氨基酸取代。
[0162]
20.实施方案15至19任一项的修饰糖蛋白激素，其中该碱性氨基酸为精氨酸。
[0163]
21.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其中所述α亚单位包含与seq id no:7具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0164]
22.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其还包含黄体化激素(lh)的β亚单位。
[0165]
23.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其还包含绒毛膜促性腺素(cg)的β亚单位。
[0166]
24.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其还包含促卵泡激素(fsh)的β亚单位。
[0167]
25.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其还包含甲状腺刺激激素(tsh)的β亚单位。
[0168]
26.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其中所述α亚单位衍生自牛的α亚单位(seq id no:2)。
[0169]
27.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其中所述α亚单位衍生自猪的α亚单位(seq id no:5)。
[0170]
28.实施方案15的修饰糖蛋白激素，其中所述α亚单位衍生自绵羊的α亚单位(seq id no:3)。
[0171]
29.刺激动物糖蛋白受体的方法，包括向动物给药实施方案15至28任一项的修饰糖蛋白激素。
[0172]
30.刺激动物排卵的方法，包括向动物给药实施方案15至28任一项的修饰糖蛋白激素。
[0173]
31.实施方案29至30任一项的方法，其中所述动物为牛、羊或猪。
[0174]
32.修饰糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的k15、e18、k20和k24具有至少一个保守碱性氨基酸取代，且在f6和t7之间具有nvtinv(seq id no:1)的插入片段或具有在f6和t7之间nv的插入片段加上t7和t8之间inv的插入片段。
[0175]
33.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其中所述氨基酸序列在糖蛋白激素的α亚单位的f6和t7之间包含nvtinv(seq id no:1)的插入片段。
[0176]
34.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其中所述氨基酸序列包含在糖蛋白激素的f6和t7之间nv的插入片段加上t7和t8之间inv的插入片段。
[0177]
35.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其在k15、e18、k20和k24包含至少两个碱性氨基酸取代。
[0178]
36.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其在k15、e18、k20和k24包含至少三个碱性氨基酸取代。
[0179]
37.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其在k15、e18、k20和k24包含四个碱性氨基酸取代。
[0180]
38.实施方案32至37任一项的修饰糖蛋白激素，其中该碱性氨基酸为精氨酸或组氨酸。
[0181]
39.实施方案38的修饰糖蛋白激素，其中该碱性氨基酸为精氨酸。
[0182]
40.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其中所述α亚单位包含与seq id no:4具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0183]
41.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其还包含黄体化激素(lh)的β亚单位。
[0184]
42.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其还包含绒毛膜促性腺素(cg)的β亚单位。
[0185]
43.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其还包含促卵泡激素(fsh)的β亚单位。
[0186]
44.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其还包含甲状腺刺激激素(tsh)的β亚单位。
[0187]
45.实施方案32的修饰糖蛋白激素，其中所述α亚单位衍生自马的α亚单位(seq id no:4)。
[0188]
46.刺激动物糖蛋白受体的方法，包括向动物给药实施方案32至45任一项的修饰糖蛋白激素。
[0189]
47.刺激动物排卵的方法，包括向动物给药实施方案32至45任一项的修饰糖蛋白激素。
[0190]
48.实施方案46至47任一项的方法，其中所述动物为马。
[0191]
49.一种α亚单位多肽，其选自seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5，其中所述α亚单位多肽还包含：
[0192]
(a)包含至少一个提供潜在的糖基化位点的氨基酸的氨基酸插入片段,其中所述插入片段紧接在位置6、7或8之后放置，其中所述位置是相对没有任何插入或取代的野生型α亚单位测量的；和
[0193]
(b)所述α亚单位多肽的野生型氨基酸被碱性氨基酸的取代。
[0194]
50.实施方案49的α亚单位多肽，其中所述插入片段的长度为1至8个氨基酸。
[0195]
51.实施方案49的α亚单位多肽，其中所述插入片段选自:
[0196]
(a)天冬酰胺(n)；
[0197]
(b)苏氨酸(t)；
[0198]
(c)半胱氨酸(c)；
[0199]
(d)天冬酰胺-缬氨酸(nv)；
[0200]
(e)苏氨酸-天冬酰胺-缬氨酸(tnv)；
[0201]
(f)苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸(tinvt)
[0202]
(g)天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸(nvtinv)(seq id no:l)；
[0203]
(h)天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸(nvtinvt)；
[0204]
(i)苏氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸(tnvtinv)(seq id no:12)；和
[0205]
(j)缬氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸(vnvtinvt)(seq id no:20)。
[0206]
52.实施方案49的α亚单位多肽，其中所述碱性氨基酸为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。
[0207]
53.实施方案49的α亚单位多肽，其中所述碱性氨基酸为精氨酸。
[0208]
54.实施方案49的α亚单位多肽，其中所述α亚单位多肽包含一个、两个、三个、四个或五个取代。
[0209]
55.实施方案54的α亚单位多肽，其中所述α亚单位多肽在位置15、17、18、20和24中
的一个或多个包含取代，其中所述位置是相对没有任何插入或取代的野生型α亚单位多肽测量的。
[0210]
56.实施方案54的α亚单位多肽，其中所述α亚单位多肽包含以下取代的一个或多个:
[0211]
(a)位置15的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代,
[0212]
(b)位置17的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代,
[0213]
(c)位置18的野生型氨基酸被精氨酸(r)、赖氨酸(k)或组氨酸(h)取代,
[0214]
(d)位置20的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代,和
[0215]
(e)位置24的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代。
[0216]
57.实施方案51的α亚单位多肽，其中所述α亚单位多肽包含两个或三个插入片段。
[0217]
58.一种α亚单位多肽，其选自seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5，其中所述α亚单位多肽还包含:
[0218]
(a)提供潜在的糖基化位点的氨基酸插入片段，其中所述插入片段紧接在位置6、7或8之后放置，其中所述位置是相对没有任何插入或取代的野生型α亚单位多肽测量的,且其中所述插入片段选自：
[0219]
(a)天冬酰胺(n)；
[0220]
(b)苏氨酸(t)；
[0221]
(c)半胱氨酸(c)；
[0222]
(d)天冬酰胺-缬氨酸(nv)；
[0223]
(e)苏氨酸-天冬酰胺-缬氨酸(tnv)；
[0224]
(f)苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸(tinvt)
[0225]
(g)天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸(nvtinv)(seq id no:1)；
[0226]
(h)天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸(nvtinvt)；
[0227]
(i)苏氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸(tnvtinv)(seq id no:12)；和
[0228]
(j)缬氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸(vnvtinvt)(seq id no:20)；和
[0229]
(b)至少一个野生型氨基酸被碱性氨基酸的取代,
[0230]
其中所述取代选自:
[0231]
(i)位置15的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代，
[0232]
(ii)位置17的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代，
[0233]
(iii)位置18的野生型氨基酸被精氨酸(r)、赖氨酸(k)或组氨酸(h)取代，
[0234]
(iv)位置20的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代，和
[0235]
(v)位置24的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代，
[0236]
且其中所述位置是相对没有任何插入或取代的野生型α亚单位多肽测量的。
[0237]
59.牛、绵羊、猪或马α亚单位多肽，其中，相对没有任何取代或插入的野生型牛α亚单位多肽(seq id no:2)、野生型绵羊α亚单位多肽(seq id no:3)、野生型猪α亚单位多肽(seq id no:5)或野生型马α亚单位多肽(seq id no:4),存在以下取代的一个或多个:
[0238]
(a)位置15的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代,
[0239]
(b)位置17的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代，
[0240]
(c)位置18的野生型氨基酸被精氨酸(r)、赖氨酸(k)或组氨酸(h)取代，
[0241]
(d)位置20的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代,和
[0242]
(e)位置24的野生型氨基酸被精氨酸(r)取代,
[0243]
且其中紧接在位置6之后，相对没有任何取代或插入的野生型牛α亚单位多肽(seq id no:2)、野生型绵羊α亚单位多肽(seq id no:3)、野生型猪α亚单位多肽(seq id no:5)或野生型马α亚单位多肽(seq id no:4)，插入以下多肽之一:
[0244]
(a)天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸(nvtinv)(seq id no:1)；
[0245]
(b)苏氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸(tnvtinv)(seq id no:12)；
[0246]
(c)缬氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸(vnvtinvt)(seq id no:20)；
[0247]
(d)天冬酰胺-缬氨酸(nv)；和
[0248]
(e)苏氨酸-天冬酰胺-缬氨酸(tnv)。
[0249]
60.实施方案49、51或58的α亚单位多肽，其中所述α亚单位多肽包含具有与选自以下的序列至少80％、85％、86％、87％、88％，89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9和seq id no:10。
[0250]
61.修饰糖蛋白激素，其包含实施方案49、51、56、58或59的α亚单位多肽,和黄体化激素(lh)、绒毛膜促性腺素(cg)、促卵泡激素(fsh)或甲状腺刺激激素(tsh)的β亚单位。
[0251]
62.修饰糖蛋白激素，其包含实施方案49、51、56、58或59的α亚单位多肽,和促卵泡激素(fsh)的β亚单位。
[0252]
63.刺激动物糖蛋白受体的方法，包括向所述动物给药包含实施方案49、51、56、58或59的α亚单位多肽的修饰糖蛋白激素。
[0253]
64.刺激动物糖蛋白受体的方法，包括向所述动物给药实施方案61或62的修饰糖蛋白。
[0254]
65.刺激动物排卵的方法，包括向所述动物给药包含实施方案49、51、56、58或59的α亚单位多肽的修饰糖蛋白激素。
[0255]
66.刺激动物排卵的方法，包括向所述动物给药实施方案61或62的修饰糖蛋白。
[0256]
67.实施方案63、64、65或66的方法,其中所述动物为牛、羊或猪。