促黄体生成素lh定量测定试剂盒及其制备方法与检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，主要涉及一种基于磁微粒分离化 学发光法定量检测血液中促黄体生成素LH的试剂盒及其制备方法，W及应用该试剂盒定 量检测血液中促黄体生成素LH的方法。
【背景技术】
[0002] 促黄体生成素（Luteinizing化rmone，LH)是由脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一 种糖蛋白激素，受下丘脑促性腺释放激素控制，是垂体分泌的促性腺激素之一，主要作用是 促进排卵和黄体生成，W促进黄体分泌雌激素巧2)和孕激素（P)。LH分子量约为28. 5kDa， 像其它糖蛋白如FSH、T甜和HCG-样，也是由α和目亚基组成的。送类激素的α亚基的 结构是很相似的，因此，送些激素的生物学和免疫学特性的区别取决于其独特的目亚基。 正常人血清LH基础值为5~10IU/L。
[0003] 促黄体生成素LH对于男性和女性的性腺功能各方面的调节具有重要的作用。在 女性体内，LH调节月经周期，促使卵泡生长与成熟，合成雌激素和孕丽，促使排卵及黄体形 成。在男性体内，LH调节睾丸激素的产生。此外，LH对于下丘脑垂体有一定影响。因此， LH的测定对于男性和女性不育的判断、月经失调的研究、更年期的指示、绝经期的征兆W及 垂体失调、染色体失常和其他卵巢或睾丸相关疾病的诊断提供有用的信息。
[0004] 在国内，促黄体生成素LH检测临床上主要依靠国外进口试剂和免疫组化试剂应 用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。具 有自主知识产权的国产促黄体生成素LH免疫化学发光检测试剂盒目前还较少，也仅停留 在96孔微孔板式技术水平上。该技术灵敏度较低、线性窄、特异性较差，也不利于高通量的 全自动检测。
[0005] 因此，有待开发对促黄体生成素LH检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成本的 检测技术。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种新的可定量检测促黄体生 成素LH的试剂盒，提高检测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
[0008] -方面，本发明提供了一种促黄体生成素LH定量测定试剂盒，该试剂盒包括校准 品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。
[0009] 其中：
[0010] -、促黄体生成素LH校准品、促黄体生成素LH质控品的配制方法如下：
[0011] 用标准品缓冲液溶解促黄体生成素LH，配置促黄体生成素LH校准品、促黄体生成 素LH校准品，其中，所述校准品缓冲液是通过在1L健康男性血清中加入0.Olg~0. 05g的 四环素和0.Ig~0. 5g硫酸新霉素，溶解后经过0. 22μm滤膜处理制备；
[0012] 二、抗试剂的制备方法如下：
[001引（1)、抗试剂缓冲液的制备：
[0014] Tris;12. 12mg~60. 57mg，四环素；0.Olg~0. 05g，绵羊血清；Ig~5g，新生牛血 清3g~lOg，马血清Ig~5g加入1L纯化水中，充分揽拌至完全溶解；
[0015] (2)、异硫氯酸英光素与促黄体生成素LH的偶联，获得异硫氯酸英光素标记的促 黄体生成素LH包被抗体：
[0016] 首先用抗试剂缓冲液将异硫氯酸英光素配制成浓度为1. 0~5.Omg/血的异硫氯 酸英光素溶液，使用分光光度计在495皿处读取吸光值，来调整浓度，然后按照促黄体生成 素LH抗体与异硫氯酸英光素的质量之比为1:1. 3,将二者同时转移到踪色玻璃瓶中，室温 下揽拌1~2小时，充分反应后使用抑=8~9的碳酸氨盐缓冲液进行平衡，然后凝胶层 析分离纯化得到的异硫氯酸英光素标记的促黄体生成素LH包被抗体；紫外监测，记录仪记 录纯化图谱，同时注意确认含有连接物的试管，注意、避光防护。
[0017] (3)、碱性磯酸酶与促黄体生成素LH抗体的偶联，获得碱性磯酸酶标记的促黄体 生成素LH标记抗体：
[0018] 首先用抗试剂缓冲液将碱性磯酸酶配制成浓度为1. 0~5.Omg/mL的碱性磯酸酶 溶液，可W根据分光光度计在280皿处读取吸光值，将碱性磯酸酶的吸光值应该在一定的 范围内。然后按照碱性磯酸酶与促黄体生成素LH的摩尔比为1:2~1:10的量将二者转移 至踪色瓶中，室温下揽拌4~5小时，充分反应后使用抑=8~9的碳酸氨盐缓冲液平衡， 然后使用凝胶层析分离纯化得到的碱性磯酸酶标记的促黄体生成素LH标记抗体；注意含 有连接物的试管的避光防护。
[001引 （4)、将步骤似中获得的异硫氯酸英光素标记的促黄体生成素LH包被抗体和和 步骤（3)中获得的碱性磯酸酶标记的促黄体生成素LH标记抗体，加入含有表面活性剂的 化is盐缓冲液充，分揽拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为Tween20、化itonX-100、 化onidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0. 01%~0. 5%。
[0020] H、磁微粒试剂的制备：
[0021] 将抗异硫氯酸英光素抗体与駿基磁珠偶联制得磁微粒试剂。
[0022] (1)、取一定体积的充分混匀后的駿基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶在磁场 放置15min，待駿基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入2~5倍于反应瓶中駿基磁 珠体积的磁微粒缓冲液，混匀20-30min。再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清。重复 清洗駿基磁珠3遍。最后将駿基磁珠溶液定容到10-50mg/mU混匀；所述磁微粒缓冲液的 配置方法是；Tris;12. 12mg，氯化钢5. 82mg，甲基纤维離50g，加入1L纯化水中，充分揽拌 至完全溶解；
[0023](2)、连接反应；按照駿基磁珠与抗异硫氯酸英光素抗体质量比为100:1的比例， 在駿基磁珠中加入抗异硫氯酸英光素抗体，2~8°C内保持混匀状态反应18小时；
[0024](3)、反应瓶在在磁场放置15min，待駿基磁珠沉降后用磯酸缓冲液清洗3遍，然后 定容至10mg/mL，2~8°C保存，制得所需待用磁微粒试剂。
[00巧]四、发光底物的制备
[0026] 将ALI^溶解于发光底物缓冲液中制备发光底物。
[0027] 用4~10倍于ALI^体积的发光底物缓冲液充分溶解ALPS,所述发光底物缓冲液 的配置方法是；Tris12. 12g~121. 14g，氯化钢5.82g，光泽精0.03g，加入1L纯化水中，充 分揽拌至完全溶解，用盐酸调节缓冲液的抑至9. 5。
[0028] 进一步的，本发明的促黄体生成素LH定量测定试剂盒，该试剂盒还包括清洗液。 该清洗液主要用于在检测过程中清洗与磁微粒试剂反应后的样品，清洗液的具体组分可W 参照所属领域的常规操作进行。通常是磯酸二氨钢、氯化纳、Tween20和ProcLin300的混 合溶液，在试剂盒制品中可W浓缩清洗液的形式存在，检测时适当稀释后使用。优选的清洗 液的配置方法是；Tris12. 12g，氯化钢5. 82g，Tween-2050血，曲拉通-100, 50血，加入1L纯 化水中，充分揽拌至完全溶解。
[0029] 另一方面，本发明提供了送种促黄体生成素LH定量测定试剂盒的制备方法，包括 W下步骤。
[0030] 分别配制促黄体生成素LH校准品、促黄体生成素LH质控品、抗试剂、磁微粒试剂、 发光底物；将促黄体生成素LH校准品、促黄体生成素LH质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光 底物独立地置于包装容器内，得到促黄体生成素LH的定量测定试剂盒。
[0031] 本试剂盒的异硫氯酸英光素标记的促黄体生成素LH包被抗体为能与人体内促黄 体生成素LH抗原特异结合的单克隆抗体，所述碱性磯酸酶标记的促黄体生成素LH标记抗 体为能与促黄体生成素LH抗原特异结合的单克隆抗体。包被抗体和标记抗体除能与促黄 体生成素LH抗原特异性结合外，配对使用时可与抗原形成"H明治"夹必结构。
[0032] 再一方面，本发明提供了利用送种促黄体生成素LH定量测定试剂盒检测促黄体 生成素LH的方法，该方法包括步骤：
[0033] (1)取Η支试管分别加30μL促黄体生成素LH的校准品、30μL促黄体生成素LH 的质控品、30μL待测样本；
[0034] 似每一试管中加入60μL抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置 37 °C下水浴15分钟；
[0035] (3)每一试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s， 置37 °C下水浴5分钟；
[0036] (4)将Η支试管在磁分离器上沉淀2分钟，缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清 液，把倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸上，用力拍击磁分离器底部W除去粘在管壁 上的所有液滴；
[0037] (5)每支试管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混 匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸 上，用力拍击分离器底部W除去粘在