一种调控甘蔗钾吸收效率的SsCBL01基因及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控甘蔗钾吸收效率的基因sscbl01及其应用。

背景技术：

甘蔗(saccharumspp.)是最重要的糖料作物，目前世界上消费的食糖中有75％是以甘蔗为原材料进行加工而成。甘蔗是我国重要的糖料作物，生育期长、生物量大，对钾肥的吸收量大，据估计，每生产一吨甘蔗大约需吸收2～2.5kg的钾素。我国甘蔗主栽区培区土壤普遍存在酸化、钾淋溶严重等现象，蔗区耕作层中全钾和速效钾的含量都处于较低水平。此外，我国可溶性钾肥资源紧缺，供应不足，50％以上依赖进口，而在生产过程中甘蔗对钾肥的利用率也仅30％左右，这些均制约了我国甘蔗产业的健康发展。

cbl(calcineurinb-like)蛋白家族是一组最初从拟南芥中鉴定出来的钙传感器，其氨基酸序列与酵母中钙调神经磷酸酶的调节b亚基和动物中的神经钙传感器(neuronalcalciumsensor，ncs)高度同源。后续研究发现，拟南芥和水稻基因组均编码10个不同的cbl蛋白，基于比较基因组方法，在玉米、高粱和棉花中已经鉴定出不同数量的cbls。所有的cbls均存在三个结合ca²⁺的螺旋-环-螺旋的ef手型结构域(elongationfactor-hand，ef-hand)。ef-hand结构较为保守，每个ef-hand中都由36个氨基酸残基和保守的asp(d)或glu(e)组成。为了传递ca²⁺信号，cbls与其靶蛋白如激酶、代谢酶或细胞骨架有关蛋白相互作用，并调节基因表达。cbls相互作用蛋白激酶(cbl-interactingproteinkinases，cipks)是cbls的重要靶蛋白。cbl与其特异性靶蛋白cipk相互作用形成的cbl-cipk复合物在植物对非生物胁迫如盐度、低钾+、低温和干旱的响应中发挥重要作用。此外，cbls也参与植物生长发育、no^3-、nh4⁺和铁的摄取和运输、h⁺稳态以及活性氧(ros)信号转导等重要信号网络。

拟南芥、水稻等植物中多项研究均表明，类钙调磷酸酶b亚基蛋白cbl介导植物对低k⁺胁迫的应答反应。因此深入探讨甘蔗cbl基因的生物学功能及其调控耐低钾胁迫的机制，可为通过常规育种和现代生物技术培育钾高效的优良品种提供重要参考。

技术实现要素：

本发明的目的：深入探讨cbl基因在甘蔗响应低k⁺胁迫反应中的功能及分子机制，以期对采用现代生物技术培育钾高效甘蔗品种具有重要的指导意义。

为实现上述目的，一种调控甘蔗钾吸收效率的基因sscbl01。所述甘蔗sscbl01基因的核苷酸序列具有：

(1)seqidno.1所示的核苷酸序列；

(2)seqidno.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而形成的具有同等功能的核苷酸序列；

(3)在严格杂交条件下与seqidno.1杂交的序列。

本发明还保护所述甘蔗sscbl01基因编码的蛋白。所述甘蔗sscbl01基因编码蛋白的氨基酸序列为：

(1)seqidno.2所示的氨基酸序列；

(2)seqidno.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。

含有所述甘蔗sscbl01基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等生物材料均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体进行构建，例如可以是双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用sscbl01基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用sscbl01基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

携带有所述sscbl01基因的重组表达载体可通过ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

所述表达盒尤其是指含有所述甘蔗sscbl01基因的表达盒。

所述转基因细胞系尤其是指人工构建的稳定表达所述甘蔗sscbl01基因，或所述甘蔗sscbl01基因编码蛋白的转基因细胞系。

所述重组菌尤其是指使用sscbl01基因构建的酵母工程菌。

进一步地，本发明还保护所述甘蔗sscbl01基因、所述甘蔗sscbl01基因编码的蛋白和含有该基因的所述生物材料在甘蔗钾离子吸收调控中的应用。所述生物材料是指含有所述甘蔗sscbl01基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。

进一步地，本发明还保护所述甘蔗sscbl01基因、所述甘蔗sscbl01基因编码的蛋白和含有该基因的所述生物材料在甘蔗种质资源改良中的应用。所述生物材料是指含有所述甘蔗sscbl01基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。

进一步地，本发明还保护所述甘蔗sscbl01基因、所述甘蔗sscbl01基因编码的蛋白和含有该基因的所述生物材料在在甘蔗育种中的应用，所述育种的目的为培育钾高效甘蔗品种。所述生物材料是指含有所述甘蔗sscbl01基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。

通过亚细胞定位获知，所述甘蔗sscbl01基因编码蛋白定位于细胞膜上。所述甘蔗sscbl01基因编码蛋白的n端有一个保守的豆蔻酰化位点。

进一步地，所述甘蔗sscbl01基因可增强甘蔗钾转运蛋白sshak1的钾离子转运能力。

此外，本发明提供一种培育钾高效甘蔗品种的方法，其在转基因甘蔗细胞中同时表达sshak1基因及所述的sscbl01基因。

还有，本发明还保护特定的甘蔗品种。这种特定的甘蔗品种采用所述的培育钾高效甘蔗品种的方法得到。

与现有技术相比，本发明所述甘蔗sscbl01基因及其应用具有的有益效果或优点包括：本发明首次公开了甘蔗sscbl01基因及其序列，深入探讨cbl基因在甘蔗响应低k⁺胁迫反应中的功能及分子机制，对采用现代生物技术培育钾高效甘蔗品种具有重要的指导意义。

附图说明

图1是甘蔗sscbl01基因pcr产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，m1表示250bpdnamarker，1-3表示pcr产物。

图2是甘蔗sscbl01基因在低钾胁迫处理不同时间点的相对表达水平图。

图3是甘蔗sscbl01基因的亚细胞定位图。其中，a-c是gfp在水稻原生质体中的定位(对照)；d-f是sscbl01-gfp在水稻原生质体中的定位。

图4是甘蔗sscbl01和sshak1基因分别单独转化和共转化的酵母突变株cy162在不同钾浓度培养基上的表型鉴定图。其中，a是sscbl01单独转化的cy162；b是sshak1单独转化以及sscbl01和sshak1共转化的cy162。

具体实施方式

下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

1、甘蔗sscbl01基因的cds序列

本实施例提供了甘蔗sscbl01基因的cds序列，即本发明所述的seqidno.1所示的核苷酸序列。

甘蔗sscbl01基因的cds序列克隆采用同源克隆的方法，即根据拟南芥和水稻的cbl01序列，设计正向引物(5’-atggggtgcttccattccacggcg-3’)和反向引物(5’-tcatgtgacgagatcgtcgacttc-3’)进行目的基因的扩增，使用的试剂为primestarhsdnapolymerase(takaracodeno.r010q)。pcr扩增反应体系及反应条件，见表1。

表1甘蔗sscbl01基因的cds序列扩增反应体系及条件

取5ulpcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，结果显示扩增产物条带单一、长度在700bp左右，与目标产物长度相符，表明pcr扩增成功，获得了目标长度的pcr产物。对pcr产物进行测序，获得甘蔗sscbl01基因的cdna序列，即本发明所述的seqidno.1所示的核苷酸序列。

2、甘蔗sscbl01基因编码的氨基酸序列

根据甘蔗sscbl01基因的全长cdna序列，采用在线软件(http://www.bioinformatics.org/sms/)转换为氨基酸序列，经测定，共编码213个氨基酸，即本发明所述的seqidno.2所示的氨基酸序列：

metglycysphehisserthralalysargglnhisproglytyrgluaspprovalhisleualaserglnthralapheservalsergluvalglualaleuphegluleuphelysserileserglyservalileaspaspglyleuileasnlysgluglupheglnleualaleuphelysasnglnarglysgluasnleuphealaasnargilepheaspleupheaspvallyslysargglyvalileasppheglyaspphevalargalaleuasnvalphehisproasnileprometgluglulysileasppheserphelysleutyraspmetaspglythrglypheilegluarglysgluvallysglnmetleuilealaleuleuglygluserglumetargleuseraspgluileilegluthrileleuasplysthrpheseraspalaaspalaasnglnaspglylysileaspargthrglutrpgluasnphevalthrargasnproserleumetlysilemetthrleuprotyrleulysaspilethrthrthrpheproserphevalpheasnsergluvalaspaspleuvalthr。

3、甘蔗sscbl01基因在低钾胁迫下的转录表达

本实施例提供了低钾胁迫试验，具体试验过程简述如下。将在正常钾水平(3.0mmol/l)下培养20d后的甘蔗栽培种粤糖55号，移至不含钾的营养液中作缺钾饥饿处理，并分别在低钾胁迫0h、6h、12h、24h、48h、72h时取根部样品用于提取总rna，每个样品3个生物学重复。

为了分析甘蔗sscbl01基因在低k⁺胁迫处理下的转录表达，取1μgrna逆转录为cdna。根据甘蔗sscbl01基因的序列设计正向引物：5’-gtgactttgtccgagctctaaa-3’和方向引物：5’-taaaccctgtgccatccatatc-3’，以cdna为模板在abi7500real-timepcr系统上进行实时定量pcr(rt-qpcr)，每个样品3个技术重复。

采用两个甘蔗组成型表达的基因β-actin和eef-1a作为内参，对甘蔗sscbl01基因表达水平进行标准化处理。

图2给出了甘蔗sscbl01基因在低钾胁迫处理不同时间点的相对表达水平。从图2看出，甘蔗sscbl01基因的表达水平在6h时显著升高，而在12h、24h、48h和72h时降低，表明甘蔗sscbl01基因可能在甘蔗应对低k⁺胁迫中发挥关键作用。

4、甘蔗sscbl01基因的亚细胞定位

甘蔗sscbl01基因编码蛋白的n端有一个保守的豆蔻酰化位点，这是细胞膜定位的特征之一。根据甘蔗sscbl01基因的cds序列，设计含bsai酶切位点的正向引物和反向引物，扩增甘蔗sscbl01基因的全长cdna。

正向引物f-primer：

5’-cagtggtctcacaacatggggtgcttccattccac-3’；

反向引物r-primer：

5’-cagtggtctcatacatgtgacgagatcgtcgactt-3’。

以甘蔗栽培种粤糖55号在低钾胁迫6h时的根系样品提取的rna逆转录合成的cdna为模板进行pcr扩增。

pcr反应体系(50μl)：34μlh2o，5μlbuffer，4μlmg²⁺，2μldntp，2μlf-primer，2μlr-primer，2utaq酶，1μl模板。

pcr循环：94℃for5min，30cycles；94℃for30sec，60℃for30sec，72℃for40sec；72℃for10min，16℃for30min。

将642bp的目标电泳片段切下，溶胶回收，用总体积30μl的水溶解回收dna(回收产物标记为：rdna1)，检测无误后与载体pbwa(v)hs-glosgfp进行连接。

酶切连接反应体系(20μl)：8μlddh2o，2μlbuffer，1μlbsai，1μlt4_ligase，4μlpbwa(v)hs-ccdb-glosgfp，4μlrdna1。

37℃酶切连接1小时后，将5-10μl连接产物转化大肠杆菌感受态dh5α，转化涂卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑pcr鉴定。挑取10个菌斑同时进行1.5ml离心管接菌和pcr鉴定。

pbwa(v)hs-ccdb-glosgfp鉴定引物35seq-s：

5’-ttcatttggagagaacacgggggac-3’；

目的基因反向引物：

5’-cagtggtctcatacatgtgacgagatcgtcgactt-3’。

25μl反应体系：16.5μlddh2o，2.5μlbuffer，2μlmg²⁺，1μldntp，1μl35seq-s，1μlr-primer，1utaq酶，1μl模板(菌液dna)。

pcr循环：94℃for5min，30cycles；94℃for30sec，50℃for45sec，72℃for40sec；72℃for10min，16℃for30min。

目标条带为642bp左右的片段。取1-3个阳性条带对应的菌液，取100μl送样测序，其余400μl菌液接种到含有5-10ml卡纳霉素抗性lb中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒。将提取的质粒用ecorv酶切验证正确后用于后续转化水稻原生质体。在ms培养基上28℃暗培养48小时后，采用共激光共聚焦显微镜(nikonc2-er)，在激发光488nm、发射光510nm下检测荧光信号。

利用与绿色荧光蛋白(gfp)融合构建的sscbl01基因在水稻原生质体中进行瞬时转染。结果参见图3。对照组的gfp信号在整个细胞中均可见到，而sscbl01-gfp荧光信号仅在细胞膜上可见，表明sscbl01基因定位于细胞膜上。

5、甘蔗sscbl01基因在钾离子吸收缺陷型酵母中的功能分析

以甘蔗栽培种粤糖55号在低钾胁迫6h时的根系样品提取的rna逆转录合成的cdna为模板，克隆sscbl01基因的全长cdna。回收pcr产物，将sscbl01基因用in-fusion酶连接到酵母表达载体pgbkt7(takarabiotechnologyco.ltd)上。

将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞jm109，选择阳性菌落进行pcr验证。将验证正确的携带sscbl01基因质粒以及空载体pgbkt7分别转入酵母突变株cy162的感受态细胞，在sd/-trp培养基中筛选阳性菌落。筛选出的阳性酵母在液体培养基中培养过夜至饱和，调整酵母浓度至od600＝0.8，然后梯度稀释，分别接种于含100mm、10mm和0mmkcl的sd/-trp培养基中培养3-5天，观察酵母长势。

为了研究sscbl01基因对sshak1的调控作用，构建了sshak1的酵母融合表达载体pyes2.0-sshak1。将pyes2.0-sshak1和pgbkt7-sscbl01共转入酵母突变体cy162中，接种于sd/-ura/-trp培养基中，筛选阳性菌株。将转化空载体pyes2.0、pyes2.0-sshak1及pyes2.0-sshak1和pgbkt7-sscbl01共转化的酵母菌株(cy162)进行梯度稀释，接种于含100mm、10mm和0mmkcl的sc/-ura培养基中培养3-5天，观察酵母生长情况。

sscbl01基因在低钾胁迫下的表达模式分析显示，其可能在甘蔗响应低k⁺胁迫中发挥关键作用。本发明利用酵母表达载体pgbkt7在钾离子吸收缺陷型酵母菌株cy162中表达sscbl01基因，结果如图4显示，转化sscbl01的酵母菌株与转pgbkt7空载体的酵母菌株之间的生长势没有明显差异，说明单独的sscbl01并不能吸收k⁺。

为了研究sscbl01对sshak1的调控作用，本发明构建了这两个基因的共转化酵母，观察其在100mm、10mm和0mmkclsc/-ura培养基中的生长情况。结果如图4，在100mm、10mm和0mmkcl三种钾离子浓度条件下，sshak1和sscbl01共转化的酵母cy162均比单独转化sshak1的酵母cy162生长得更好。

上述结果表明，单独的sscbl01不能吸收k⁺，但可以促进sshak1对k⁺的吸收。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

序列表

<110>广东省科学院生物工程研究所

<120>一种调控甘蔗钾吸收效率的sscbl01基因及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>642

<212>dna

<213>甘蔗钾吸收效率的基因(sscbl01基因)

<400>1

atggggtgcttccattccacggcgaagcggcagcaccctggctacgaggaccccgtgcac60

ctcgcctcccagaccgccttcagcgttagcgaggttgaggctctattcgagctgttcaag120

agcataagtggttcggtgattgatgatggcctgatcaacaaggaagaattccagctagca180

ttatttaagaatcagaggaaagaaaatcttttcgctaatcggatatttgaccttttcgat240

gtcaagaaaaggggtgtcattgattttggtgactttgtccgagctctaaatgtgtttcat300

ccaaatatcccaatggaagaaaaaattgatttctcattcaagctatacgatatggatggc360

acagggtttattgaacggaaggaggttaagcagatgttaattgctctcctaggagaatca420

gaaatgaggctatctgatgagatcattgagacaatcctggataagacattttcggacgct480

gatgcaaatcaggatgggaaaatagatagaacagagtgggagaattttgttacaagaaat540

ccttccttgatgaagataatgactctgccatacctcaaggacataacaacaacattcccc600

agctttgtgtttaactccgaagtcgacgatctcgtcacatga642