烟草细胞色素C基因NtCYP94B3s及对提高烟草茉莉酸含量的应用的制作方法

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s的应用。

背景技术：

在自然界中，植物经常遭受各种生物和非生物胁迫，包括寒冷，干旱，盐胁迫和食草动物侵袭。植物防御食草动物的策略有两种，一种称为间接防御，是通过释放有机物来诱引食草动物的天敌、干扰昆虫对食物的识别；另一种是直接防御，植物产生可诱导的次生代谢产物来影响掠食者的生存，其中包括二十二碳酰亚精胺(dcs)，17-羟基香叶壬二醇二萜糖苷(hgl-dtg)，苯丙胺。

当植物受到草食动物侵袭时，会诱导内源性茉莉酸(ja)产生。前人研究发现植物可以识别昆虫的口腔分泌物(os)中存在的一些特殊物质，例如脂肪酸-氨基酸结合物(facs)。当植物受到m.sexta侵袭时，ja水平在5至60分钟内升高。沉默掉减毒猪笼草中的两个功能性冗余酶jasmonate-resistant44(jar4/6)，植物更容易受到草食动物的攻击，并且一些次生代谢产物(例如tpi和尼古丁含量)在irjar4/6突变体植株中降低。因此，激素ja在抵抗食草动物中起着至关重要的作用。

jas是由磷脂酶释放的亚麻酸(c18：3)合成的，并通过三种酶13-hy-droperoxyliolenicic(13-lox)，烯化氧合酶(aos)和异戊烯在氧化环化酶(aoc)催化下进一步环化为12-氧代-植物二烯酸(opda)。opda在过氧化物酶体中转化为ja。接下来，ja与异亮氨酸通过jar酶催化缀合产生具有生物活性的ja-ile。在较低的ja-ile水平下，下游受调控基因被jasmonate-zim-domain(jaz)阻遏物抑制。逆境胁迫条件会引起ja-ile水平升高，ja-ile与scfcoi1的一部分f-box蛋白coronatine-insensitive1(coi1)相结合，并导致26s蛋白酶体降解jaz阻遏物。阻遏物的降解释放出目标基因，例如bhlh家族成员myc2及其同源物myc3，myc4，myc5可以激活植物防御反应相关基因的转录。

之前的研究已经鉴定了许多ja化合物。在jar的介导下，ja甲基转移酶(jmt)分别催化ja到ja-ile，meja。ja还可以被2-氧戊二酸/fe(ii)依赖性加氧酶(jox)羟化为12-oh-ja。12-oh-ja可以进一步转化为12-oh-glc-ja或12-oh-hso4-ja。

本发明鉴定了来自烟草的cyp94b3s基因。同时沉默ntcyp94b3s基因验证其功能。在沉默ntcyp94b3的植物中，ja-ile的含量提高，而12-oh-ja-ile的含量与野生型相比显着下降。ja含量的提高可以有助于植物的抗虫、抗逆，这对某些农作物来说非常有价值。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s，第二目的在于提供所述的烟草细胞色素c因ntcyp94b3s对提高烟草ja的应用。

本发明的第一目的是这样实现的：

一种烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s，所述的烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示；或者与序列表seqidno：1限定的dna序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表seqidno：1限定的dna序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列，所述烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示。

本发明的第二目的是这样实现的：

所述烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s用于提高烟草茉莉酸含量。

进一步地，所述烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s用于提高烟草茉莉酸含量，是在烟草植株体内抑制所述ntcyp94b3s基因的表达，提高ja及ja-iie的含量，通过由rna介导的方法抑制ntcyp94b3s基因的表达。

进一步地，所述烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s在高抗虫和高烟碱烟草育种中的应用。

进一步地，所述烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s编码的一种细胞色素c的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如seqid：no.2所示，或者由seqidno：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成，且具有调控烟草茉莉酸含量功能的衍生多肽；所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明的烟草细胞色素c因ntcyp94b3s及其编码基因为农作物尤其是烟草高ja含量育种提供基因与技术的支持。

本发明中，在烟草植株内抑制烟草内源基因ntcyp94b3s的表达，会使烟草中ja及ja-iie含量明显提高，在植物高ja及ja-iie含量育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

附图说明

图1为ntcyp94b3s基因的rnai片段pcr产物电泳图；

其中，m-分子量标记；1-pcr产物；

图2为中间载体pdonr-zeo图；

图3为ntcyp94b3s基因植物rnai干扰载体phellsgate12图；

图4为ntcyp94b3s基因rnai干扰烟草植株的ja及ja-iie含量示意图；

其中，nicotianaattenuata对照；ntcyp94b3s-7和ntcyp94b3s-22为转基因烟株。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

一种烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s，其核苷酸序列如序列表seqidno：1所示；或者是与序列表seqidno：1限定的dna序列杂交的核苷酸序列；或者是与序列表seqidno：1限定的dna序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。所述烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示。

本发明所述烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s用于提高烟草茉莉酸含量，获得高ja含量植株。具体是在烟草植株体内抑制所述ntcyp94b3s基因的表达，提高ja及ja-iie的含量，可通过由rna介导的方法抑制ntcyp94b3s基因的表达，如植物病毒载体介导基因沉默的方法、农杆菌介导转化rnai干扰载体、优化修改基因编码匡、优化基因启动子等方法。所述抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制ntcyp94b3s表达即可。

烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s可应用于高抗虫和高烟碱烟草育种中，得到烟草品种及其种子和无性繁殖体。

采用本发明所述烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s编码的一种细胞色素c的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如seqid：no.2所示，或者由seqidno：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成，且具有调控烟草茉莉酸含量功能的衍生多肽；所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明的烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s及其编码基因为农作物尤其是烟草高ja含量育种提供基因与技术的支持。在烟草植株内抑制烟草内源基因ntcyp94b3s的表达，会使烟草烟叶的ja含量及ja-iie含量明显提高，因此该基因可以应用于高抗虫和高烟碱烟草育种，在植物高ja含量育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

下面以具体实施案例对本发明进行进一步说明：

实施例中所有的植物组织材料取自渐狭叶烟草。烟草植株的生长和发育阶段都是在人工气候室中，并保持生长温度在22-25℃之间，以尽量减少外界环境因素的影响。实验选取的烟草材料为6-7叶期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株。采取非转基因烟株及转基因烟株的相同叶位叶片进行采样，将这些烟草材料测定ja含量。

实施例1

植物rnai载体的构建：

以nicotianaattenuata的cdna为模板，用含有gateway接头序列的引物进行pcr扩增(图1)，扩增产物经pcr产物纯化后，经过bp反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体(见图2)中，将构件好的bp反应载体通过lr反应将ntcyp94b3s片段置换到phellsgate12rnai干扰载体(见图3)中。

(1)gateway反应引物序列为seqid：no.3和seqid：no.4，如下所示：

seqid：no.3

ntcyp94b3s_f5’-aaaaagcaggctcgatggaacacacagcgcaaatt-3’；

seqid：no.3

ntcyp94b3s_r5’-agaaagctggggatctcgttaatacaacagtgaacacg-3’。

(2)pcr反应均采用phusion高保真聚合酶进行pcr克隆。

(3)bp反应：

(a)在200μl离心管中准备8μl的反应体系，包括：1-7μl的attb-pcr产物(约15～150ng，质量浓度≥10ng/μl)、1μl150ng/μl的pdonr-zeo载体和适量的te缓冲液(ph8.0)，在室温下混匀；

(b)将bpclonase^tmii酶混合物在冰上静置2min融化，轻轻震荡2次，混匀待用；

(c)向(1)准备的样品中加入2μl的bpclonase^tmii酶混合物，轻轻地将体系混匀；

(d)将bpclonase^tmii酶混合物放回到-20℃或者-80℃保存；

(e)将反应体系放在25℃温浴1h；

(f)向反应体系中加入1μl的蛋白酶k溶液，轻轻震荡，然后将样品放在37℃温浴10min，以便终止bp反应；

(g)将混合液转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含zeacin抗性的lb平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养，提取阳性克隆的pdonr-zeocin质粒(图2)备用。

(4)lr反应：

(a)在200μl离心管中准备8μl的反应物，包括：1-7μl的获得的pdonr-zeocin质粒(50-150ng)、1μl150ng/μl的目的载体和适量的te缓冲液(ph8.0)，在室温下混匀；

(b)将lrclonase^tmii酶混合物静置在冰上2min融化，轻轻震荡2次以混匀；

(c)加入2μl的lrclonase^tmii酶混合物，轻轻震荡将体系混匀；

(d)将lrclonase^tmii酶混合物放回到-20℃或者-80℃冰箱保存；

(e)将反应体系放在25℃温浴反应1h；

(f)向反应体系中加入1μl的蛋白酶k溶液以终止lr反应，轻轻震荡后，将样品放在37℃静置10min；经过摇菌扩繁后得到phellsgate12rnai干扰载体。

实施例2

农杆菌介导的烟草转化及转基因植株的鉴定：

(1)冻融法转化农杆菌：

将1μg(200ng/μl)phellsgate12重组载体加入到100μl感受态农杆菌lba4404中，混匀后在冰上静置5min，放入液氮中冷冻5min，然后从液氮中取出，放入37℃水浴锅中水浴5min，再在冰上静置5min后，加入500μllb溶液，在28℃、充分震荡条件下恢复培养4h，最后将菌液均匀涂抹于选择性平板培养基上，28℃下培养48h。

(2)叶盘法转化烟草nicotianaattenuata，具体方法如下：

(a)无菌条件下，将烟草nicotianaattenuata种子放入ep管中用无菌水冲洗2-3次；

(b)于75％的酒精中浸泡30-60s；

(c)再用0.1％的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；

(d)播种于ms培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4d,25℃光照培养20-30d；

(e)待烟草苗长至3-5cm时(20-30d)，取顶芽放于ms+ba0.2mg/l(壮芽，使其快速成长)培养基上，继代培养；

(f)继代培养14天后(有小叶片即可)，取叶片，大小1cm×1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入ms+ba1.0mg/lph6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3d；

(g)然后取出预培养的叶片或茎段，放入农杆菌侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000r/min离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例(10ml悬菌液放1管1.5ml菌体)放入悬菌液，加入as25mg/l(40ml中加40μlas)不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；

其中，农杆菌侵染液的制备方法如下：

1)取-80℃冰箱保存的已被转化的农杆菌，划平板培养，lb固体平板中加入50mg/lspec和50mg/lrif；

2)挑取单菌斑到含50mg/lspec和50mg/lrif的5mllb液体培养基中，放入摇床中28℃、200r/min培养过夜(12-16h)；

3)保存菌种，750μl菌液加入灭过菌的甘油250μl，-80℃冰箱保存备用。

4)摇菌，lb液体培养基10ml加spec(所需浓度50mg/l)10μl、rif(所需浓度50mg/l)10μl及菌液10μl，28℃、200r/min过夜培养(12-16h)；

5)当菌液浓度达到od600＝1.5左右时，取2ml菌液加入到离心管中，4000r/min离心5min；

6)倒掉上清液，吸1ml新的ms液体培养基，重悬农杆菌，4000r/min离心5min；

7)重复步骤(6)1次；

8)用1ml的ms液体培养基重悬菌后，再加入到40ml的ms的液体培养基中(含40ul25mg/l的as)，即为侵染液。放置2h以上，再侵染；

200ml悬菌液的配制如下：

20×大量元素10ml

200×有机元素1ml

200×铁盐1ml

200×微量元素1ml

蔗糖5.6g

(h)将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；

(i)洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/lcef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；

(j)取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为ms+ba1.0mg/l+kan25mg/l+cef500mg/lph5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低cef浓度。如果长菌，则继续保持cef浓度；

(k)每2周更换1次培养基，直至长出不定芽(一般情况为2周)。切下再生的小苗(1cm左右)，转入继代培养基ms+ba0.2-0.1mg/l+kan25mg/l+cef500mg/lph5.8；

(l)至小苗长至2cm长时(有小芽即可)，转接入生根培养基ms+naa0.2-0.1mg/l上，24±1℃、12h光照、1500lx培养3周左右,长出粗壮根系；

(m)待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。

(3)得到稳定的转基因株系

采用qiagen公司dna提取试剂盒，提取转基因烟草幼苗的基因组dna，设计kan抗性基因引物进行pcr扩增，筛选阳性植株,检测到25株阳性植株；

kan抗性基因引物为seqid：no.5和seqid：no.6，如下所示：

seqid：no.5

kanf：5’-tctggacgaagagcatcagg-3’

seqid：no.6

kanr：5’-atgaatccagaaaagcggcc-3’。

实施例3

将每个样品的约200mg叶子组织在液氮中研磨。用1ml乙酸乙酯萃取植物激素，该乙酸乙酯中掺有100ngd5-ja(2,4,4-d3；乙酰-2,2-d2，c/d/n同位素公司)和20ngja-13c6-ile作为内参。涡旋振荡10分钟后，通过在4℃以16100g离心15分钟获得有机相。将样品在真空浓缩器(eppendorf)中于30℃减压下蒸发至干。然后将叶片样品重悬于600μl甲醇：水(7：3，v/v)中，并在4100℃下以16100g离心15分钟。shimadzu填料xr-ods色谱柱(内径2.0mm，75mm，shimadzu)上进行分离。通过lc-ms分析了茉莉酸酯。

通过测定发现基因敲除的烟草植株的ja含量及ja-iie的含量比非转基因材料相比显著提高，说明ntcyp94b3s基因能够影响烟草中ja及ja-iie的含量(图4)。

序列表

<110>云南省烟草农业科学研究院

<120>烟草细胞色素c基因ntcyp94b3s及对提高烟草茉莉酸含量的应用

<141>2020-09-27

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1509

<212>dna

<213>烟草植物(nicotianaattenuata)

<400>1

atgtttctttccctcttactttccttcattttagggtttctttccttctcttttttgtct60

ttctccaaaaaacttcatctcaaattccgaagaatcactcccatctatggcccttcctct120

tacccaatccttggctgtcttatttccttttacaaaaatcgtcaccgtctattggattgg180

tacactggacttttggctgagtcacctacacaaaccattctagttcaacgttttggcgca240

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<210>2

<211>502

<212>prt

<213>烟草植物(nicotianaattenuata)

<400>2

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