白斑综合征病毒VP28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用与流程

wssv的vp28基因的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列、以及密码子优化后的核苷酸序列，尤其涉及wssv的vp28蛋白的重组表达制备方法和抗兔多克隆抗体的制备。通过重组表达wssv的vp28蛋白可以进一步在体外分析该蛋白的结构和功能，另外多克隆抗体的制备能够为进一步检测鱼虾内wssv的含量奠定基础。

背景技术：

wssv的vp28是目前研究最多的白斑综合征病毒囊膜蛋白，蛋白是病毒最主要的组成成分之一，包括结构蛋白和非结构蛋白两大类。wssv的结构蛋白包括囊膜蛋白、核衣壳蛋白和被膜蛋白三个部分，它们维持着病毒的基本结构，并保护病毒的核酸，同时参与病毒对宿主组织细胞的识别、吸附及侵入。非结构蛋白大多是一些催化、调节病毒复制的酶类和调控蛋白。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了白斑综合征病毒vp28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用，以解决缺少克氏原螯虾wssvvp28检测抗体，无法进行wssv测定等问题。

本发明的技术方案如下：

一种白斑综合征病毒vp28基因，所述vp28基因命名为wssvvp28，序列如sedidno：1所示。

一种密码子优化后的白斑综合征病毒vp28基因，其序列如sedidno：2所示。

一种白斑综合征病毒vp28重组蛋白，其氨基酸序列如sedidno：3所示。

一种白斑综合征病毒vp28重组蛋白的制备方法，包括：将白斑综合征病毒vp28密码子优化基因序列sedidno：2连入pet-b2m表达载体得到pet-b2m-wssvvp28重组质粒；

将pet-b2m-wssvvp28重组质粒转化入大肠杆菌中，培养，诱导，裂解，纯化，得到白斑综合征病毒vp28重组蛋白。

在一些实施例中，将密码子优化后的序列seqidno.2进行合成，并直接连入pet-b2m载体，转化进入大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞，iptg诱导表达，收集菌体进行sds-page蛋白检测，超声破碎裂解细菌，纯化重组蛋白。

进一步的，转化步骤为：向感受态细胞e.colibl21中加入pet-b2m-wssv-vp28重组质粒，轻轻混匀，在冰浴中静置5min，后置于42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中。向每个离心管中加入900μl的无菌lb培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min，使菌体复苏，然后吸取100μl复苏的菌液涂布在含有卡纳青霉素抗性的lb固体培养基上，37℃培养12-16h。

进一步的，诱导表达步骤为：挑选含有重组质粒的大肠杆菌，加入液体培养基，37℃震荡培养直至菌液od600＝0.4～0.6，加入适量iptg至终浓度1mm，诱导表达4h后，收集菌体，并用灭菌水重悬菌体，放入-80℃冻存，并反复冻融1-2次；取冻融后的重悬菌体在冰浴条件下进行超声波破碎，离心收集破碎后的上清液，并进行sds-page电泳检测。

进一步的，破碎条件为：破碎4s，间隔3s，破碎30min。

进一步的，纯化步骤为：收集超声破碎后的上清液，用ni²⁺亲和层析柱进行纯化，使用15倍柱体积的bindingbuffer（20mmtris-hclph7.9,5mm咪唑，0.5mnacl）冲洗柱子，洗去杂蛋白；用5mlelutionbuffer（20mmtris-hclph7.9,500mm咪唑，0.5mnacl）洗脱，收集洗脱蛋白。

一种多克隆抗体，是以所述的白斑综合征病毒vp28重组蛋白为抗原，免疫动物制备所得。

上述多克隆抗体的制备方法，以所述的白斑综合征病毒vp28重组蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清，将抗血清分离纯化得到多克隆抗体。进一步的，包括：将所述的白斑综合征病毒vp28重组蛋白作为抗原注入兔子体内，四次免疫后，采集兔血，分离血清，纯化后得到白斑综合征病毒vp28抗兔多克隆抗体。

在一些实施例中，一种白斑综合征病毒vp28抗兔多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

采用2只日本大耳兔，将重组wssv的vp28蛋白浓度调整为1mg/ml作为抗原注射，佐剂和抗原为1:1体积比抽取。首免采用完全佐剂，二兔采用不完全佐剂。兔子采用多点皮下注射，每点为0.2ml。首免后第14天进行二免，二免到三免间隔时间为7天。兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。用elisa（间接法）检测兔血清中抗体效价。然后使用亲和层析柱proteing，纯化抗体，并应用于后续的westernblot等实验。

所述的白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因是cdna序列:长度615bp，类型是双链、线性、核酸，所述wssvvp28的序列是通过pcr扩增，并进行测序获得。具体序列如下所示，seqidno.1：

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利用dnaworks2.4在线软件，对wssvvp28的核苷酸序列进行密码子优化，选用大肠杆菌表达系统，对wssvvp28序列的密码子优化后的序列，标记seqidno.2:

cataacaccgtgaccaaaaccattgaaacccataccggtaatatcgaaaccaacatggatgaaaatctgcgtattccggttaccgcagaagttggtagcggttatttcaaaatgaccgatgttagctttgatagcgataccctgggcaaaatcaaaattcgcaatggtaaaagtgacgcccagatgaaagaagaggacgcagatctggttattacaccggttgaaggtcgtgcactggaagttaccgttggccagaatctgacctttgaaggcacctttaaagtgtggaataataccagccgcaagattaacattaccggcatgcagatggttccgaaaattaacccgagcaaagcatttgttggtagcagcaataccagcagctttactccggttagcattgatgaagatgaagttggcacctttgtttgtggcaccacctttggtgcaccgattgcagcaaccgcaggcggtaacctgtttgatatgtatgttcatgttacctatagcggcaccgaaaccgaa。

所述的wssvvp28分子类型为蛋白质，序列特征：长度区段：30-204aa，共计175aa，分子量19kd，类型为氨基酸，序列信息如下，标记为seqidno.3:

hntvtktiethtgnietnmdenlripvtaevgsgyfkmtdvsfdsdtlgkikirngksdaqmkeedadlvitpvegralevtvgqnltfegtfkvwnntsrkinitgmqmvpkinpskafvgssntssftpvsidedevgtfvcgttfgapiaataggnlfdmyvhvtysgtete。

本发明所述白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28重组蛋白和抗兔多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

一个白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28密码子优化基因的合成；

一个白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28重组表达步骤；

一个白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28抗兔多克隆抗体的制备方法。

本发明还提供所述的白斑综合征病毒vp28重组蛋白/所述多克隆抗体在白斑综合征病毒检测中的应用。

本发明将wssvvp28密码子优化后的序列seqidno.2直接连入pet-b2m载体，通过转化到大肠杆菌bl21感受态细胞，挑选单克隆进行摇菌，iptg诱导表达，收集菌体进行sds-page蛋白检测，超声破碎裂解细菌，用ni²⁺亲和层析柱纯化目的蛋白。然后以纯化后的wssvvp28重组蛋白作为抗原，采用5只新西兰白兔，进行免疫，收集血清，用elisa（间接法）检测兔血清中抗体效价。然后使用亲和层析柱proteing，纯化抗体，并应用于后续的westernblot等实验。通过重组表达wssvvp28蛋白可以进一步在体外分析该蛋白的结构和功能，另外多克隆抗体的制备能够为进一步检测虾体内wssv的vp28的含量奠定基础。

有益效果：本发明不仅重组表达了具有活性的wssvvp28蛋白，为进一步研究该蛋白功能提供基础，而且生产的多克隆抗体，也为检测虾体内wssv的vp28提供了条件，生产的抗体可为进一步科学研究。

附图说明

图1，wssvvp28重组蛋白的sds-page电泳检测。m表示蛋白marker，1表示未iptg诱导的菌体蛋白，2表示iptg诱导后的菌体蛋白，3表示ni²⁺纯化后的vp28重组蛋白。

图2，vp28抗体的westernblot检测感染wssv的小龙虾肌肉蛋白样品。

图3，vp28抗兔多克隆抗体效价检测结果。

具体实施方式

实施例1

1.wssvvp28-his重组蛋白的诱导表达：

向感受态细胞e.colibl21中加入pet-b2m-wssvvp28重组质粒，轻轻混匀，在冰浴中静置5min，后置于42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中。向每个离心管中加入900μl的无菌lb培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min，使菌体复苏，然后吸取100μl复苏的菌液涂布在含有卡纳青霉素抗性的lb固体培养基上，37℃培养12-16h。挑选含有重组质粒的大肠杆菌，加入液体培养基，37℃震荡培养直至菌液od600＝0.4～0.6，加入适量iptg至终浓度1mm，诱导表达4h后，收集菌体，并用灭菌水重悬菌体，放入-80℃冻存，并反复冻融1-2次；取冻融后的重悬菌体在冰浴条件下进行超声波破碎，离心收集破碎后的上清液，并进行sds-page电泳检测。如图1所示，wssvvp28重组蛋白的sds-page电泳检测。m表示蛋白marker，1表示未iptg诱导的菌体蛋白，2表示iptg诱导后的菌体蛋白，3表示ni²⁺纯化后的vp28重组蛋白。

从结果可以看出，重组蛋白vp28能够成功大量诱导表达，而且经过ni²⁺纯化后的条带单一，没有其它杂蛋白，能够满足后续制作多克隆抗体的要求。

2.wssvvp28-his重组蛋白的纯化：

对wssvvp28-his重组蛋白进行分离纯化：将超声破碎后的上清样品负载上ni²⁺离子亲和层析柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。用15倍柱体积的bindingbuffer（20mmtris-hclph7.9,5mm咪唑，0.5mnacl）冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用5mlelutionbuffer（20mmtris-hclph7.9,500mm咪唑，0.5mnacl）洗脱，收集洗脱蛋白。

3.抗兔wssvvp28-his多克隆抗体的制备：

采用2只日本大耳兔，将重组wssvvp28蛋白浓度调整为1mg/ml作为抗原注射，佐剂和抗原为1:1体积比抽取。首免采用完全佐剂，二-四免采用不完全佐剂。兔子采用多点皮下注射，每点为0.2ml。首免后第14天进行二免，二免到三免间隔时间为7天。兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。用elisa（间接法）检测兔血清中抗体效价。然后使用亲和层析柱proteing，纯化抗体，并应用于后续的westernblot等实验。

4.wssvvp28-his多克隆抗体的westernblot检测：

提取稀有鮈鲫的血清总蛋白，进行sds-page电泳，在湿转法的条件下对血清总蛋白进行pvdf转膜，然后将pvdf膜放在5%的脱脂奶粉中封闭2h，并将纯化后的抗体按照1：3000进行稀释，并孵育2h，用tbst洗膜三次，每次5min，后用羊抗兔hrp标记的igg二抗与pvdf膜孵育2h，再用tbst洗膜三次，最后用增强型的dab显色试剂盒进行显色，并进行观察。

图2为vp28抗体的westernblot检测感染wssv的小龙虾肌肉蛋白样品。

通过westernblot验证，可以看出从感染wssv的小龙虾肌肉样品中能够明显的检测出vp28蛋白条带，并且特异性较好，表明通过本方法生产出的vp28多克隆抗体能够用于检测。

图3为制备得到的vp28抗兔多克隆抗体效价检测结果。

通过elisa实验来验证抗体效价，从结果中可以看出抗体的效价超过1：50000，表明抗体的质量较好，可用于westernblot检测。

序列表

<110>扬州大学

<120>白斑综合征病毒vp28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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