一种凤丹PoCAB151基因、表达载体及其制备方法和应用与流程

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种凤丹pocab151基因、表达载体及其制备方法和应用。

背景技术：

充足的水分是植物生长的一个重要条件。作为一种水分胁迫，干旱胁迫指土壤水分的供给不能满足植物对水分的正常需求,导致植物根系吸水困难，使植物萎蔫甚至死亡，这严重制约了农业生产。凤丹（paeoniaostii）属于芍药科芍药属的多年生木本植物，具有较高的结实性，目前主要用于以提取籽油为目的而栽培的一种新型油料作物。凤丹虽为肉质根，但干旱仍会对其正常生长发育产生不利影响（zhao等，physiologicalandtranscriptomicanalysisoftreepeony(paeoniasectionmoutandc.)inresponsetodroughtstress，forests，2019，10：135）。

绿色植物主要通过叶绿素结合蛋白（lhc）接收光能，通过同化作用进行能量转换。叶绿素a/b结合蛋白基因（cab）是由定位于核内的cab基因编码，其编码的蛋白与色素所形成的色素蛋白复合体捕获光能，并把能量迅速传至反应中心引起光化学反应、调节激发能在光系统i和光系统ⅱ之间的分配、光保护。目前，中国水仙（林江波等，中国水仙叶绿素a/b结合蛋白基因ntcabl的克隆与序列分析，福建农业学报，2013，28(5)：463-467）、金银花（蒋向辉等，金银花叶绿素a/b结合蛋白基因ljcab克隆与表达特性分析，华中师范大学学报（自然科学版），2016，50(3)：409-414）、杧果（罗聪等，杜果叶绿素a/b结合蛋白基因cdna全长克隆及其序列分析，果树学报，2010，27(3)：441-444）、银杏（王欢利等，银杏叶绿素a/b结合蛋白基因（gblhcb4）及其启动子克隆，中南林业科技大学学报，2015，35(5)：114-121）、菊花（韩霜等，菊花叶绿素a/b结合蛋白基因cmlhcbl及其启动子的克隆和表达分析，园艺学报，2013，40(6)：1119-1128）等多种植物的cab基因相继被克隆，并且研究不断深入。而凤丹的遗传背景比较薄弱，尚未见到关于凤丹cab基因的报道。对凤丹cab基因的深入研究不仅可以拓展凤丹分子生物学研究领域，而且对于制备耐旱转基因植物具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种凤丹pocab151基因、表达载体及其制备方法和应用。

本发明的目的之一是提供一种凤丹pocab151基因，该基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明的目的之二是提供上述凤丹pocab151基因编码的蛋白质pocab151，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明的目的之三是提供一种带有上述凤丹pocab151基因的真核表达载体。进一步，由序列如seqidno.1所示的凤丹pocab151基因与中间植物表达载体pcambia1301构成。

本发明的目的之四提供一种上述凤丹pocab151基因、上述真核表达载体在制备耐旱转基因植物中的应用。

本发明的目的之五是提供一种含有上述凤丹pocab151基因的耐旱转基因植物的制备方法，包括：

（1）真核表达载体的构建：合成凤丹pocab151基因cdna全长序列，设计引物，pcr扩增目的片段，对目的片段及表达载体pcambia1301进行双酶切反应，再将目的片段与表达载体的酶切产物进行连接、转化，重组产物转化至大肠杆菌感受态细胞，经卡那霉素筛选获得成功重组的真核表达载体；

（2）农杆菌介导的转化：将构建成功的真核表达载体质粒转化至农杆菌，将阳性克隆接种至yeb液体培养基中培养到od600=0.3-0.4，离心后用乙酰丁香酮和ms0液体培养基重悬沉淀，再将烟草无菌苗叶片块浸泡在侵染培养基中，而后取出叶片接种在共培养的培养基中进行共培养，而后转入到抗性芽筛选分化培养基中，不断继代，直至分化出芽，将不定芽转接到生根筛选培养基进行生根筛选，直至获得完整植株；

（3）转基因株系的筛选：将获得的植株先后进行rt-pcr和qrt-pcr验证，最后获得含耐旱基因pocab151的烟草植株。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案：

本发明采用race技术克隆了凤丹耐旱基因pocab151，所述耐旱基因pocab151具有seqidno.1所示的核苷酸序列，其中，序列表中的seqidno.1由1066个碱基组成。该耐旱基因pocab151能够编码pocab151蛋白，此种蛋白具有seqidno.2所示的氨基酸序列，其中，序列表中的seqidno.2由264个氨基酸组成。

本发明中pocab151基因编码的蛋白与博落回（ova20177.1）、橡胶树（xp_021664574.1）、扁桃（xp_034207560.1）、草莓（xp_004293460.1）等植物同源蛋白的同源性超过90%。

可用现有的植物双元表达载体pcambia1301构建含有pocab151基因的重组表达载体。将携带有本发明基因pocab151的植物表达载体转入农杆菌eha105细胞中，再通过叶盘法转化到植物组织中，被转化的宿主植物是烟草。进一步的，构建真核表达载体中设计的引物为seqidno.6和seqidno.7。

通过rt-pcr和qrt-pcr验证来筛选转化的烟草植株。进一步的，进行rt-pcr的上游引物为seqidno.8，下游引物为seqidno.9。进行qrt-pcr检测，以烟草actin为内参基因，设计引物为：上游引物ntactin-f：5'-tcctcatgcaattcttcg-3'（seqidno.10）；下游引物ntactin-r：5'-acctgcccatctggtaac-3'（seqidno.11）；设计pocab151基因引物为：上游引物pocab151-f：5′-gctggcaatgacttctat-3′（seqidno.12）；下游引物pocab151-r：5'-cagtgcgttacagggtta-3'（seqidno.13）。

本发明所提供的获得耐旱的转基因植物的方法，是将上述植物耐旱蛋白的编码基因pocab151导入植物中，得到耐旱转基因植株。

pocab151凤丹耐旱基因pocab151的核苷酸序列（seqidno.1）

cccgtaggtacgacggcagttgatctgactcaggatcactcgtgttacactgcaatcgcgtgtcgcccttctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagtacatgggtccctcctcccttgtaacataatccatcagcaacaaagaagcttcacaaaaaaagaaacagaaagaatggcaacttgtgcaattcaacactccgcctttgctggtcagactgctttgaagcaacaagatgatcttgtccgcaagatcggtagctttggtggtcgcatttcgatgcgtcgcacagtgaagagcgtcccacaaagcatctggtacggtccagatcgccccaagtacttgggcccattttcggaacaaactccatcgtacctgacaggtgaattccccggtgactatgggtgggacacggccgggctatcggcagacccagagacatttgccaagaaccgtgaactcgaagtgatccactgcagatgggccatgcttggtgcactgggctgtgtcttccctgaaatcctttccaagaacggaatcaaattcggcgaggcagtctggttcaaggccggagcccaaatcttctcggaaggtgggctcgactatcttggcaacccaaacctggtccatgcccagagcatcctagcaatttgggctgttcaagttgtgctcatgggctttgtcgagggatacagagtcggcggaggcccacttggcgaaggactcgataaactttacccaggcggagcctttgacccgcttggattggcggatgatccagaggcatttgcagaattgaaggtgaaggagataaagaatggaaggctggcaatgacttctatgtttggattctttgtgcaggctattgttactggaaagggcccggttgagaacctttatgaccacgttgctgacccagttgctaacaatgcatgggcttatgccaccaacttcgtccccggaaaatgaattttattcacatttgtaaccctgtaacgcactgtaacactctccttgttttctgcaagttcttgaaaatttaaaaaaaaaaa。

由凤丹耐旱基因pocab151的核苷酸序列推测得到的氨基酸序列（seqidno.2）

matcaiqhsafagqtalkqqddlvrkigsfggrismrrtvksvpqsiwygpdrpkylgpfseqtpsyltgefpgdygwdtaglsadpetfaknrelevihcrwamlgalgcvfpeilskngikfgeavwfkagaqifseggldylgnpnlvhaqsilaiwavqvvlmgfvegyrvgggplgegldklypggafdplgladdpeafaelkvkeikngrlamtsmfgffvqaivtgkgpvenlydhvadpvannawayatnfvpgk。

附图说明

图1：凤丹pocab151基因cdna全长的race结果检测；其中，m：dl2000marker；1：3'-race扩增产物；2：5'-race扩增产物。

图2：凤丹与其他4种植物cab151基因推测得到的氨基酸序列同源性比对分析：其中，黑色部分为所有物种同源性为100%的序列。

图3：基于rt-pcr检测的转凤丹pocab151基因烟草株系筛选：其中，m：dl2000marker；1-3：转基因烟草植株；4：野生型烟草。

图4：基于qrt-pcr检测的转凤丹pocab151基因烟草株系筛选；

图5：自然干旱胁迫后烟草植株的表型，其中，野生型烟草叶片萎蔫、下垂；转入pocab151基因的烟草保持正常生长状态；

图6：自然干旱胁迫后土壤含水量与叶片含水量测定；

图7：自然干旱胁迫后叶片相对电导率（rec）测定；

图8：自然干旱胁迫后叶片超氧阴离子（o2^·-）积累水平观测；

图9：自然干旱胁迫后叶片过氧化氢（h2o2）积累水平观测。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

下面结合具体实施方式和说明书附图对本发明作进一步详细的描述。若无特别说明，本发明所述的实验方法，均为常规方法；所述的生物材料，均可从商业途径获得。

实施例1pocab151基因cdna全长序列的克隆

pocab151基因3'端cdna序列的获得：选用干旱胁迫下凤丹叶片作为材料，采用minibestplantrnaextractionkit(takara)试剂盒提取总rna。采用3'fullracecoresetver.2.0(takara)反转录生产cdna的第一条链，反转录体系为：1μlrna、1μl3'-raceadaptor、1μldntpmixture(10mmeach)、2μl5×m-mlvbuffer、0.25μlrnaseinhibitor、0.25μlreversetranscriptasem-mlv(rnaseh^-)、4.5μlrnasefreeddh2o；反转录程序：42℃反应60min，70℃延伸15min。在此基础之上，3'-race分别进行两轮pcr扩增。第一轮pcr扩增体系为：2μlcdna、8μl1×cdnadilutionbufferⅱ、2μl3'-raceouterprimer、2μlgenespecificouterprimer(10μm)（5'-cggaacaaactccatcgt-3'（seqidno.3））、5μl10×lapcrbufferⅱ(mg⁺plus)、0.5μlladnapdymerase、30.5μlrnasefreeddh2o。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s，循环20次；72℃延伸10min。第二轮pcr扩增体系为：1μl第一轮pcr扩增产物、8μldntpmixture(2.5mmeach)、2μl3'-raceinnerprimer（5'-tgtcttccctgaaatcct-3'（seqidno.4））、2μlgenespecificinnerprimer、5μl10×lapcrbufferⅱ(mg⁺plus)、0.5μlladnapdymerase、31.5μlrnasefreeddh2o。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环30次；72℃延伸10min。将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

pocab151基因5'端cdna序列的获得：采用smarter^tmracecdnaamplificationkitusermanual(clontech)反转录生产cdna的第一条链，反转录反应分为三步，首先进行体系一：1μlrna、1μl5'-racecdsptimera、9μldeionizedh2o。反应程序为：72℃反应3min后，42℃反应2min。然后进行体系二：11μl体系一的反应液、4μl5×frist-standbuffer、0.5μldithiothreitol(100mm)、1μldntpmixture(20mmeach)、0.5μlrnaseinhibitor、2μlsmartscribereversetranscriptase、1μlsmarteriiaoligonudeatide。反应程序为：42℃反应90min后，70℃反应10min。最后进行体系三：20μl体系二的反应液、50μltricine-edtabuffer。反应程序为：25℃条件下静置15min，稀释cdna。在此基础之上，5'-race进行pcr扩增，反应体系为：2.5μl5'cdna、25μl2×seqampbuffer、1μlseqampdnapolymerase、5μl10×upm、1μl5'genespecificprimer（5'-cattgccagccttccattctttatctcct-3'（seqidno.5））、15.5μlrnasefreeddh2o。反应条件为：94℃反应30s、72℃反应3min，循环5次；94℃反应30s、70℃反应30s、72℃反应3min，循环5次；94℃反应30s、68℃退火30s、72℃延伸3min，循环25次。将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

实施例2凤丹与其他4种植物cab151基因推测得到的氨基酸序列同源性比对分析

将凤丹与其他4种植物cab151基因推测得到的氨基酸序列分别用fasta格式表示，保存为txt文件，再载入dnaman5.2.2软件中进行同源性比对，可以观察到它们最同源的氨基酸序列，结果见图2。

实施例3凤丹pocab151真核表达载体在烟草中的表达

凤丹pocab151真核表达载体构建：将已获得的pocab151基因全长序列送武汉思特进科技发展有限公司进行全基因合成，再进行pcr扩增，体系为：1μldntpmixture(25mmeach)、pocab151-forwardprimer（5'-gagaacacgggggactggtacccggggatccatggcaacttgtgcaatt-3'（seqidno.6））和pocab151-reverseprimer（5'-acagctcctcgcccttgctcaccatgtcgacttttccggggacgaagtt-3'（seqidno.7））各2μl、5μl10×pfubuffer、0.4μlpfu高温聚合酶（5u/μl）、40μlrnasefreeddh2o。扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环35次；72℃延伸6min。将目的片段切下，进行胶回收，检测无误后与载体进行连接。随后，对目的基因及表达载体pcambia1301进行双酶切反应。分别对载体pcambia1301和扩增片段pocab151分别用bamhi和sali进行酶切。载体酶切体系为：10μl质粒（300μg/ml）、1μlbamhi（10u/μl）、1μlsali（10u/μl）、5μl10×buffer、33μlrnasefreeddh2o。扩增片段酶切体系为：43μlpcr产物、1μlbamhi（10u/μl）、1μlsali（10u/μl）、5μl10×buffer。以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应3h。对酶切的产物进行胶回收，洗脱后备用。再将目的片段与表达载体进行连接、转化，连接体系为：6μl酶切目的片段（50ng）、8μl酶切载体（100ng）、2μl10×t4dnaligasebuffer、1μlt4dnaligase、3μlrnasefreeddh2o，然后16℃水浴2h即可。重组产物取10μl加入200μl预冷的dh5α感受态中，42℃热击90s，冰上静置2min，加入790μl无抗生素的lb液体培养基，37℃下100rpm培养1h，铺板后放入恒温培养箱，37℃倒置培养18h。挑取培养基上的单菌株放入3mllb液体培养基（50mg/lkan）中，37℃下200rpm过夜培养后进行菌液pcr验证。pcr验证体系：2.5μl10×pcrbufferⅱ（mg²⁺）、2μldntpmixture(2.5mmeach)、2μl质粒dna、1.25μlforwardprimer（5'-ggactggtacccggggatccatggcaacttgtgcaatt-3'（seqidno.8））、1.25μlreverseprimer（5'-cccttgctcaccatgtcgacttttccggggacgaagtt-3'（seqidno.9））、0.25μllataqdna聚合酶（5u/μl）、15.75μlddh2o。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min。对pcr反应液进行电泳检测以验证扩增片断大小。最后提取质粒进行双酶切验证，体系为：1μlbamhi、1μlsali、10μl上一步提取的质粒dna、2μl10×kbuffer、6μlddh2o，37℃反应1.5h，直至凤丹pocab151真核表达载体构建成功。

凤丹pocab151真核表达载体转化烟草：将100ml的yeb固体培养基（kan50mg/l、rif50mg/l）分装至6个培养皿，用接种针蘸取农杆菌菌液，在培养基上分区划线，暗培养36-48h；挑选单菌落，放入yeb液体培养基（kan50mg/l、rif50mg/l）中，28℃下200rpm过夜培养后取2ml菌液加入50mlyeb液体培养基（kan50mg/l、rif50mg/l）中，28℃下200rpm培养到od600=0.3-0.4；摇好的菌液倒入50ml的离心管中，25℃下5,000rpm离心10min，倒掉上清液；小三角瓶灭菌后依次加入400μlas（20mg/ml）和5mlms0液体培养基（不用调ph，不要加入蔗糖、琼脂），用枪打匀菌体，倒入上述小三角瓶中，然后加ms0液体培养基至50ml；纱布灭菌，然后用橡皮筋绑紧覆盖在烧杯口；将50mlms0倒入另一个灭过菌的小三角瓶中备用；把烟草无菌苗叶片切成1cm×1cm小块，切100-150片，放入含有50mlms0的小三角瓶中，然后把叶片倒入烧杯中，再把过滤后的叶片放到含有菌液的小三瓶中，不断摇动，侵染8min；过滤菌液，取出叶片，用无菌滤纸吸干表面的菌液，接种在共培养的培养基[ms0+naa（0.1mg/l）+6-ba（3.0mg/l）+6.66%琼脂+蔗糖（30g/l）]中，暗培养3d左右；共培养结束以后，转入到抗性芽筛选分化培养基[ms0+naa（0.1mg/l）+6-ba（3.0mg/l）+蔗糖（30g/l）+6.66%琼脂+hyg（25mg/l）+cb（100mg/l）]中，大概两周继代一次，直至分化出芽；当分生不定芽长到2cm以上时，用刀切下不定芽，转接到生根筛选培养基[1/2ms+6.66%琼脂+蔗糖（30g/l）+cb（50mg/l）+iba（3.0mg/l）+hyg（8mg/l）]进行生根筛选。经过3个月的培养，可获得转pocab151基因烟草。

转凤丹pocab151基因烟草株系的筛选：

rt-pcr检测：采集烟草叶片为材料，参照minibestplantgenomicdnaextractionkit(takara)试剂盒提取dna，以提取的dna为模板，通过pcr进行序列分析扩增，pocab151扩增的上游引物pocab151-f：5'-ggactggtacccggggatccatggcaacttgtgcaatt-3'（seqidno.8），下游引物pocab151-r：5'-cccttgctcaccatgtcgacttttccggggacgaagtt-3'（seqidno.9）；25μl反应体系：10×pcrbuffer（mg²⁺plus）2.5μl，上游引物、下游引物各1.25μl（10mm），dntpmixture（2.5mmeach）2.0μl，lataq^®高保真酶0.25μl，dna模板2.0μl，ddh2o15.75μl；反应程序：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，反应35个循环，72℃延伸10min；使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。从图3中可以看出，转pocab151烟草植株能够扩增出1条清晰明亮的条带，而野生型烟草的带条暗弱。

qrt-pcr检测：采集烟草叶片为材料，参照rnaisoplus（totalrna提取）试剂盒（takara）说明书方法提取总rna，按照primerscript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒（takara）取1.0μg总rna反转录成cdna。将反转录所得的cdna按照transstart®tipgreenqpcrsupermix试剂盒（trans）进行qrt-pcr检测，以烟草actin为内参基因，设计引物为：上游引物ntactin-f：5'-tcctcatgcaattcttcg-3'（seqidno.10）；下游引物ntactin-r：5'-acctgcccatctggtaac-3'（seqidno.11）；设计pocab151基因引物为：上游引物pocab151-f：5′-gctggcaatgacttctat-3′（seqidno.12）；下游引物pocab151-r：5'-cagtgcgttacagggtta-3'（seqidno.13）；25μl反应体系：2×transstart®tipgreenqpcr12.5μl，cdna模板2.0μl，上游引物、下游引物各1.0μl（10mm），ddh2o8.5μl；反应程序：94℃预变性30sec，然后94℃变性5sec，52.2℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应45个循环，溶解曲线65℃-95℃，每5sec升温0.5℃；采用公式2^-△△ct法计算基因的相对表达量。从图4可以看出，pocab51在野生型烟草植株中的表达水平与转pocab151烟草植株存在显著差异，转pocab151烟草植株的表达水平约为野生型烟草植株的20倍。

实施例4转凤丹pocab151基因烟草植株的耐干旱能力鉴定

干旱胁迫下烟草植株的表型：将烟草植株置于22℃、10h光照条件下进行自然干旱胁迫，32天后可以观察到野生型烟草叶片出现萎蔫、下垂等干旱伤害症状，而转pocab151基因烟草并未出现上述的干旱伤害症状，仍然保持正常的生长状态，表明转pocab151基因烟草具有较强的耐干旱能力，结果见图5。

干旱胁迫下烟草植株的相关胁迫生理指标测定：（1）土壤含水量：取适量盆土称重并记为鲜重（fw），而后将其在烘箱（9423a，上海精宏实验设备有限公司）中105℃处理5min，再在65℃处理2h以上，将烘干恒重的样品称量并记为干重（dw），并按下列公式计算叶片相对含水量：土壤含水量（%）=（fw-dw）/fw×100%。（2）叶片含水量：取适量新鲜叶片称重并记为鲜重（fw），而后将其在烘箱（9423a，上海精宏实验设备有限公司）中105℃处理5min，再在65℃处理2h以上，将烘干恒重的样品称量并记为干重（dw），并按下列公式计算叶片相对含水量：叶片相对含水量（%）=（fw-dw）/fw×100%。（3）相对电导率（rec）：称取0.1g用直径1cm打孔器获得的叶片圆片，放入含有适量去离子水的注射器中，堵住注射器前端抽真空直至叶片沉入水下。然后一起倒入玻璃试管中，加去离子水至总体积达为20ml。室温静置4h，摇匀后用电导率仪（dds-307a，上海雷磁仪器有限公司）测定溶液电导率c1。接下来将试管封口，沸水浴30min，等温度冷却至室温后测定此时溶液电导率为c2。每个处理按下列公式计算叶片rec：rec（%）=c1/c2×100%。（4）超氧阴离子（o2^·-）积累水平：采用荧光探针法观察o2^·-积累量，具体操作参照活体细胞氧化应激ros原位染色试剂盒（上海哈灵公司）说明书并稍作修改，具体步骤如下：①滴100μl清理液于载玻片上，捏紧2片不锈钢双面剃须刀片快速切割滤纸上的新鲜叶片，避开主叶脉；②用细头毛笔沾取切好的样品放于载玻片清理液中，并调整好位置；③叶片样品全部放好后将载玻片上清理液尽量吸取干净，然后加入10μl荧光染色剂二氢溴化乙啶（dhe），37℃孵育20min；④在荧光显微镜（axioimagerd2，zeiss，德国）下观察并且拍照。（5）过氧化氢（h2o2）积累水平：采用二氨基联苯胺（dab）染色法观察h2o2的积累量。使用50mm的tris-acetate缓冲液来配制浓度为0.1mg/ml、ph为5.0的dab染色液。用染色液在黑暗中充分浸泡叶片24h后，取出叶片放入95%（v/v）酒精中进行沸水浴，在15min后进行拍照。从图6-9可以看出，与野生型烟草相比，转pocab151基因烟草植株具有显著较高的叶片含水量、较低的相对电导率、o2^·-和h2o2积累水平，而两者之间的土壤含水量差异不显著，表明转pocab151基因烟草植株在干旱胁迫下受到的伤害少，具有较强的耐旱能力。

综上所述，本发明获得了1个凤丹pocab151基因cdna全长序列，并通过将构建的pocab151基因真核表达载体转化到烟草中进行表达，制备了耐旱转基因烟草。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，但并非是对本发明的实施方式的限定。本领域普通技术人员应该理解的是，在不脱离本发明创造构思的前提下，以本发明为基础做出的任何修改、等同替换和改进等，都属于本发明的要求保护范围之列。

序列表

<110>扬州大学

<120>一种凤丹pocab151基因、表达载体及其制备方法和应用

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1066

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cccgtaggtacgacggcagttgatctgactcaggatcactcgtgttacactgcaatcgcg60

tgtcgcccttctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagtacatg120

ggtccctcctcccttgtaacataatccatcagcaacaaagaagcttcacaaaaaaagaaa180

cagaaagaatggcaacttgtgcaattcaacactccgcctttgctggtcagactgctttga240

agcaacaagatgatcttgtccgcaagatcggtagctttggtggtcgcatttcgatgcgtc300

gcacagtgaagagcgtcccacaaagcatctggtacggtccagatcgccccaagtacttgg360

gcccattttcggaacaaactccatcgtacctgacaggtgaattccccggtgactatgggt420

gggacacggccgggctatcggcagacccagagacatttgccaagaaccgtgaactcgaag480

tgatccactgcagatgggccatgcttggtgcactgggctgtgtcttccctgaaatccttt540

ccaagaacggaatcaaattcggcgaggcagtctggttcaaggccggagcccaaatcttct600

cggaaggtgggctcgactatcttggcaacccaaacctggtccatgcccagagcatcctag660

caatttgggctgttcaagttgtgctcatgggctttgtcgagggatacagagtcggcggag720

gcccacttggcgaaggactcgataaactttacccaggcggagcctttgacccgcttggat780

tggcggatgatccagaggcatttgcagaattgaaggtgaaggagataaagaatggaaggc840

tggcaatgacttctatgtttggattctttgtgcaggctattgttactggaaagggcccgg900

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<210>2

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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151015

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202530

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