促进丹参根系发育及丹参酮合成的卷枝毛霉及其用途的制作方法

本发明涉及一种丹参根系内生真菌及其用途——用于促进丹参根系发育和丹参酮类成分的合成。

背景技术：

丹参(salviamiltiorrhizabunge.)是唇形科鼠尾草属植物，常以其干燥根或茎根入药，具有活血化瘀，凉血消痈、止痛、清心除烦等多种功效。根据其传统功效，丹参在现代广泛用于心脑血管疾病的治疗，疗效显著。丹参的药用成分包括水溶性的丹酚酸类和脂溶性的丹参酮类成分。水溶性的丹酚酸类合物，主要有丹酚酸a、b、c、咖啡酸、丹参素等，具有抗血栓形成、抗氧化、保护细胞、抗凝血及调节血脂等作用。脂溶性的丹参酮类成分主要包括丹参酮i、二氢丹参酮(二氢丹参酮i)、丹参酮iia、丹参酮iib、隐丹参酮、羟基丹参酮等，具有抗炎、抗菌及改善血液循环等功效。

近年来，丹参的市场需求量日益增加，而野生资源日益减少，栽培品种退化严重。人工栽培存在引种困难和环境制约等因素，栽培丹参的产量低下且有效成分产率不高，不同产地之间的品质差异较大，药材的质量得不到保证。因此，如何利用新的技术和手段大幅提高活性产物含量，更有效、可持续和低成本的获得丹参中有效化学成分，已成为丹参资源及活性产物研究的重要内容和发展方向。

内生菌是促进药用植物有效成分积累的重要诱导子资源。中国专利文献cn104830717a公开了具有诱导丹酚酸b积累作用的丹参内生菌耐冷假单胞菌(pseudomonaspsychrotolerans)lg4，其保藏号为：cctccno.m2015085，可促进丹参毛状根中酚酸类物质(丹酚酸b)含量的积累。中国专利文献cn106801014a公开了能提高丹参产量及其有效成分含量的内生真菌，为球毛壳菌(chaetomiumglobosum)d68，其保藏号为cgmccno.12622，可以提高宿主丹参生物量及丹参酮类和酚酸类成分含量。

卷枝毛霉(mucorcircinelloides)是全球首个利用微生物商业化生产油脂的真菌，能产生γ-亚麻酸(gla)，具有治疗心血管疾病、缓解炎症等功能。卷枝毛霉cbs277.49的全基因组测序也已被美国联合基因研究所(jointgenomeinstitute，jgi)完成，是研究丝状真菌脂质积累机制的模式生物。此外，卷枝毛霉还具有较强的合成类胡萝卜素、番茄红素的能力。卷枝毛霉也可以作为诱导子促进其它宿主次生代谢物的合成，中国专利文献cn111218406a公开了一株从中药材土茯苓的微生物富集培养物中分离的卷枝毛霉(m.circinelloides)mf-8，其保藏号为gdmccno.60920，可以提高土茯苓中花旗松素的含量。

基于所见研究，植物内生真菌在对宿主根系发育和次生代谢产物积累上有至关重要的作用。目前，药用植物内生真菌的研究仍处于初级阶段，至今关于能产生植物源生物活性化合物的内生真菌诱导子对宿主植物次生代谢影响的报道较少，从药用植物中分离内生菌并且利用其进行发酵生产，或在药用植物中接种特定的微生物以得到某些重要的天然药物或某种道地药材，将对解决某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等引起的药源匮乏、生态破坏问题有指导意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种丹参内生真菌，并提供其用途，可促进丹参根系丹参酮合成。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种卷枝毛霉(mucorcircinelloides)df20，其保藏编号为cgmccno.20742。

作为本发明的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)df20的改进：其its碱基序列如seqidno：1所示。

本发明还同时提供了上述卷枝毛霉(mucorcircinelloides)df20的用途：促进丹参根系发育和丹参酮类成分合成。

作为本发明的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)df20的用途的改进：将丹参内生真菌df20与丹参无菌苗进行二元共培养；从而实现提高丹参根部丹参酮类成分的含量。

作为本发明的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)df20的用途的进一步改进，所述二元共培养为：在丹参无菌苗的根基部接种内生真菌df20菌悬液，于25±1℃进行组培间培养，培养时间为60±5天；即，该时间后观察植株根系发育情况，并测定其丹参酮类成分的含量。

作为本发明的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)df20的用途的进一步改进，：所述内生真菌df20菌悬液的浓度为10⁶-10⁷cfu/ml，每株丹参无菌苗的接种量为1ml。

作为本发明的卷枝毛霉(mucorcircinelloides)df20的用途的进一步改进，所述丹参酮类成分包括：隐丹参酮，二氢丹参酮，丹参酮i，丹参酮iia。

本发明的菌株df20的保藏信息如下：

保藏名称为：卷枝毛霉mucorcircinelloides，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmccno.20742，保藏时间2020.10.14。

本发明的菌株df20(丹参内生真菌)是从唇形科鼠尾草属植物丹参(s.miltiorrhizabunge.)根系中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为卷枝毛霉(mucorcircinelloides)。具体分离方法为：

1)截取丹参根段，进行冲洗与震荡，制成悬浮液。

2)将悬浮液涂布于pda培养基上，于28℃培养，直至获得单菌落；

3)挑取单菌落于相同的pda平板划线纯化，于28℃培养3-5天；

4)重复步骤3)，直至获得纯培养物。

本发明的提高丹参根部丹参酮类成分的含量的方法，是将上述的菌株df20(丹参内生真菌)与丹参植株共培养。

所述的共培养，在丹参无菌苗根部接触基质的地方接种菌悬液1ml(浓度10⁶～10⁷cfu/ml左右)，置于25℃组培间培养，8周后观察植株生长情况。

本发明所用的培养基包括：

a)内生真菌培养基：pda培养基配方：马铃薯浸出粉6.0g；葡萄糖20.0g；琼脂20.0g；蒸馏水1000ml；ph自然；

b)丹参无菌苗培养基：ms培养基，ph5.8～6.0；

上述培养基均为常规培养基，使用前需进行常规的灭菌。

c)内生真菌与丹参共培养基质：为泥炭：蛭石：珍珠岩＝3：1：l的培养基质；

共培养器皿：1300mlpp塑料组培瓶；

温室培养温度：25℃；

所述的共培养具体包括以下步骤：

(a)取本发明的丹参内生真菌菌种df20，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的100mlpda液体培养基中，于28℃活化培养3-5天；

(b)在丹参无菌苗根部接触基质的地方接种菌悬液1ml(浓度10⁶～10⁷cfu/ml)，8周后观察植株生长情况；所述的丹参内生真菌与丹参共培养基质为泥炭：蛭石：珍珠岩＝3：1：l的混合栽培基质。

共培养后，将丹参根在45℃烤箱干燥，直至恒重，然后研磨成粉，用甲醇提取(20mg丹参根粉末溶于2ml70％甲醇(v/v))，在超声下处理60分钟，甲醇提取物应用高效液相色谱(hplc)系统进行丹参酮类有效成分的分析。

所述的丹参酮类有效成分包括：隐丹参酮，二氢丹参酮，丹参酮i，丹参酮iia。

隐丹参酮，别称：隐丹参醌，英文名：cryptotanshinone，分子式：c19h20o3，cas：35825-57-1，化学结构式如下：

二氢丹参酮，英文名：dihydrotanshinone，分子式：c18h14o3，cas：20958-18-3，化学结构式如下：

丹参酮i，英文名：tanshinonei，分子式：c18h12o3，cas：568-73-0，化学结构式如下：

丹参酮iia，英文名：tanshinoneiia，分子式：c19h18o3，cas：568-72-9，化学结构式如下：

本发明具有如下技术优势：

本发明所述的菌株df20(丹参内生真菌)，通过和丹参植株共培养能够有效地促进丹参根系发育，还可有效促进丹参酮类成分的生物合成与积累，具有较大的应用价值。

附图说明

图1的a，b，为本发明所述丹参内生真菌在pda平板培养基上的形态图；

图1的c，为本发明所述丹参内生真菌在光学显微镜40×10倍下形态图。

图2是基于its序列采用邻接法构建的本发明所述菌株df20的系统发育树。

图3是本发明所述丹参内生真菌菌丝作用于丹参植株8周后丹参植株根部发育情况(ck为对照，df20为本发明内生真菌处理组)。

图4本发明所述丹参内生真菌df20作用于丹参植株8周后，丹参根部的隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮i、丹参酮iia的含量(ck为对照，df20为本发明内生真菌处理组)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：卷枝毛霉(m.circinelloides)df20的分离培养、鉴定与保藏：

本发明的内生真菌菌株df20由以下步骤分离获得：

1)挑选大小合适、生长健康种植于室内的唇形科鼠尾草属植物丹参(s.miltiorrhiza)植株，截取长约5cm丹参根部，并尽可能将附着在根表面的土壤清除干净。

2)将截取的丹参根段用灭菌的pbs溶液冲洗2次后再用无菌水冲洗2次。然后将丹参根段浸泡在200ml已灭菌的pbs溶液中，超声震荡10min。

pbs溶液(生工生物)配方：nacl136.89mm；kcl2.67mm；na2hpo48.1mm；kh2po41.76mm；121℃，15min，灭菌。

3)取出丹参根，无菌水(50-100ml)冲洗5次，将冲洗液与上一步超声震荡后的pbs溶液均匀混合，制成悬浮液。

4)取500μl悬浮液均匀涂布于pda平板上，28℃培养24h后，进行常规的无菌检测。检测合格的，继续进行培养。

5)挑取所产生的单菌种于相同培养基划线纯化分离，置于28℃培养3-5天，继续挑取单菌落；重复上述操作直至得到纯培养为止。

6)将步骤5)所得到的单菌落进行its测序，经序列比对，确定菌株，并保藏，得到菌株卷枝毛霉(m.circinelloides)df20。

该菌株df20的保藏信息如下：

保藏名称为：卷枝毛霉mucorcircinelloides，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmccno.20742，保藏时间2020.10.14。

卷枝毛霉(m.circinelloides)df20的菌落和菌丝体特征，如图1所示：菌落质地干燥，呈白色絮状，平铺在培养基表面。菌丝体发达且无隔多核，无假根和匍匐枝，生长速率快。

本发明所述的丹参内生真菌的rrna基因序列测定结果，its序列片段如图2所示。将测序结果于ncbi网站进行序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，与卷枝毛霉(mucorcircinelloides)1232的相似性为99.33％。

实施例2：丹参无菌苗的获得

所用丹参无菌苗通过以下步骤获得：

1)选取丹参饱满的种子，经流水冲洗、75％酒精处理、无菌水漂洗、5％naclo溶液处理、无菌水漂洗后，用无菌滤纸吸去多余水分，置于28℃组培间催芽培养，培养基为ms培养基(ph5.8～6.0)，培养条件为温度25～28℃，光照强度2800～3000lx，光照时间14h/d。

2)增殖苗培植：等种子出芽长成3-4叶的无菌苗后，此无菌苗可直接用于下述实施例3，也可剪取1.5～2.0cm的带叶片茎段置入增殖培养基中进行扩繁，增殖培养基为ms培养基，扩繁培养条件同步骤1)，直至获得足够数量的3-4叶丹参无菌苗。

实施例3：丹参内生真菌和无菌苗的二元共培养

1)取实施例1所得的卷枝毛霉(m.circinelloides)df20，在无菌条件下，挑取一接种环的菌丝，接种于100ml无菌pda液体培养基中，置于28℃，150rpm摇床培养3-5天，取适量菌液用无菌pda培养基稀释成菌悬液(10⁶～10⁷cfu/ml)。

2)取实施例2所获的3-4叶龄丹参无菌苗，移栽至装有100mlms培养基的无菌培养基质(泥炭：蛭石：珍珠岩＝3：1：1)中，25℃组培室培养10～15天，取1ml步骤1)所得的df20菌悬液接种于丹参苗根部，并以接种1ml同等条件下摇床培养的无菌pda液体培养基作为对照。

实施例4：丹参根系发育状况的观测

将实施例3所得的df20菌悬液接种后的丹参苗、以及作为对照的丹参苗，继续于25℃组培室共培养8周后，将丹参植株从基质中小心取出，洗去根表的基质。如图3所示，本发明所述的内生真菌df20能够促进丹参主根增粗(df20处理的根径为1.38±0.25mm，ck为0.76±0.21mm)，根部表面颜色变红，表明该菌株能在一定程度上促进根系发育和丹参酮类有效成分的合成。

实施例5：丹参内生真菌对丹参植株丹参酮生物合成的影响

将实施例4所获的两种丹参(df20菌悬液接种后的丹参、以及作为对照的丹参)的根45℃干燥至恒重并研磨成粉，用甲醇提取，20mg丹参根粉末溶于2ml70％甲醇(v/v)，在超声下处理60分钟，用高效液相色谱(hplc)对隐丹参酮，二氢丹参酮，丹参酮i，丹参酮iia等丹参酮类有效成分进行分析。

如图4所示，丹参内生真菌df20对丹参植株根部丹参酮合成的影响非常显著，df20处理8周后，丹参根部的二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮i，丹参酮iia分别为对照组的7.53倍，25.42倍，7.71倍和22.7倍，表明df20可有效促进丹参根部丹参酮类成分的合成与积累。

现有的卷枝毛霉mf-8按照上述方法进行实验，发现其对丹参植株根部丹参酮合成无明显影响。处理8周后，丹参根部的二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮i，丹参酮iia均约为对照组1.2～1.5倍。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江理工大学

<120>促进丹参根系发育及丹参酮合成的卷枝毛霉及其用途

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>610

<212>dna

<213>卷枝毛霉(mucorcircinelloides)

<400>1

gttttcataattttggctcgtccattattatctatttactgtgaactgtattattacttg60

acgcttgagggatgctccactgctataaggataggcggtggggatgttaaccgagtcata120

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