一种水绵乙醇提取物的制备方法和应用与流程

本发明属于海洋生物技术领域，尤其涉及一种水绵乙醇提取物的制备方法和应用。

背景技术：

水绵属(spirogyra)属于绿藻门，绿藻植物纲(chloropsida)，双星藻目(orderzygnematales)，双星藻科(familyzygnemaceae)。水绵是水绵属绿藻的总称，又名水青苔、石衣、水衣、水苔等，是一种普遍生活在淡水里的真核多细胞藻类，是一种单列的长筒状细胞构成的丝状体，在水中多呈团状，世界上大概有超过400种水绵，广布于池塘、沟渠、河流、湖泊和稻田。水绵以丝状体断裂再生或行接合生殖，由孢子萌发成新的个体，随水传播，水绵生命力和繁殖力极强。

水绵可作为某些鱼类的饵料，晒干可作为食物。目前国内对水绵的研究主要集中在环境保护方面，如水绵的水质净化、减轻水体富营养化作用；而关于水绵药用作用的相关报道较为少见。《中华本草》记载可以以水绵叶状体入药，味甘，性平，具有清热解毒、利湿的作用，可用于治疗丹毒、烫火伤、痈肿和漆疮。罗群等发表的论文“水绵有效成分的提取及其抑菌作用”公开了水绵水提取物对大肠杆菌具有明显的抑制作用，而不同体积分数的乙醇、不同提取时间提取得到的水绵乙醇超声提取物性质不稳定，其中，不同体积分数乙醇的水绵提取物对大肠杆菌均无明显的抑制作用；与其他体积分数乙醇的水绵提取物相比较，60％乙醇的水绵提取物对枯草芽孢杆菌的抑制作用最为明显；而95％乙醇提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均无明显的抑制作用。

经检索，未见有关于水绵具有抗氧化和抗衰老作用方面的报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种水绵乙醇提取物的制备方法。本发明制备得到的水绵乙醇提取物具有显著的抗氧化和抗衰老作用，可应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和药品。

本发明的技术方案将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

一种水绵乙醇提取物的制备方法，包括如下步骤：

s1、取新鲜的水绵湿藻，在温度为-20℃～-40℃的条件下冷冻10～12小时，室温融化10～12小时，反复冻融3～5次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心10～15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中加入体积分数为70％～99％的乙醇超声提取2～4次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心10～15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，即得水绵乙醇提取物。

优选地，步骤s2中按沉淀与乙醇的固液比0.8～1.5g/ml加入乙醇进行超声提取。

优选地，步骤s2中超声提取的频率为35～40khz，温度为4℃。

优选地，步骤s2中每次超声提取的时间为10～30min。

本发明制备得到的水绵乙醇提取物具有显著的抗氧化和抗衰老作用，可应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和药品。

此外，本发明发明人在进一步的研究中，意外地发现，对上述制备水绵乙醇提取物过程中，分离水绵乙醇提取物后，对剩余的沉淀进行进一步处理得到的水绵水提取物，同样具有显著的抗氧化、抗衰老作用，可应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和药品。其中，所述水绵水提取物的制备方法包括如下步骤：

s1、取新鲜的水绵湿藻，在温度为-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融3次，在转速为5000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为70％的乙醇超声提取4次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为20min，在转速为5000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s3、用一级水洗涤步骤s2所述的沉淀2次，在转速为10000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，去上清液，向沉淀中按湿藻与一级水的固液比1g/ml加入一级水在温度为70℃的条件下提取5次，每次60min，在转速为10000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取上清液，加一级水调节其相对于水绵(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示水绵湿藻)，即得水绵水提取物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)在整体动物水平上以氧化应激模型及衰老相关模型进行试验的试验结果表明，本发明提供的水绵乙醇提取物可以显著延长氧化胁迫条件下和自然条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命，具有显著的抗衰老作用。

(2)本发明提供的水绵乙醇提取物能促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)水平，具有显著的抗氧化作用。

(3)本发明提供的水绵乙醇提取物的制备方法具有周期短，有机溶剂消耗少，工艺简单，安全无毒，稳定高效等特点，适合工业化生产。

附图说明

图1水绵乙醇提取物对自然条件下秀丽隐杆线虫平均寿命的影响。

图2水绵乙醇提取物对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响

图3水绵乙醇提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响。

图4水绵水提取物对自然条件下秀丽隐杆线虫平均寿命的影响。

图5水绵水提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明所述水绵(spirogyrasp.)由中国科学院水生生物研究所提供，其在中国科学院淡水藻种库中的编号为fachb-738。

本发明人在对水绵进行研究的过程中，进行了大量的试验，意外发现对水绵湿藻反复冻融，离心取上清后剩余的沉淀进行乙醇超声提取制得到的水绵乙醇提取物，有效成分稳定，70％～99％乙醇的水绵乙醇提取物均能够延长自然条件下和氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命，促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)的水平，具有显著的抗氧化和抗衰老作用，可应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和药品。

本发明水绵乙醇提取物可单独或与其他活性成分合用，作为唯一或主要活性成分应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能功能的保健食品和药品，所述保健食品和药品的剂型优选为片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。

本发明所述的抗氧化、抗衰老作用是指对以病理或生理条件下因发生氧化应激反应所产生的变化为主要特征的衰老及衰老相关疾病的防治作用。

本发明实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中所述sbasal溶液和smedium溶液的制备方法如下：

sbasal溶液：称取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于试剂瓶中，加入750ml去离子水，完全溶解后定容至1l，灭菌30min，冷却至40-50℃备用。

smedium溶液：取1l灭菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml胆固醇乙醇溶液，边加变振摇，使其充分溶解(溶液由无色透明转为微乳白透明，无明显沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m柠檬酸钾溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常温放置备用。

实施例1水绵乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的水绵湿藻，在温度为-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融4次，在转速为10000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按沉淀与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为80％的乙醇超声提取3次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为25min，在转速为10000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于水绵(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示水绵湿藻)，即得水绵乙醇提取物。

实施例2水绵乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的水绵湿藻，在温度为-20℃的条件下冷冻12小时，室温融化10小时，反复冻融5次，在转速为5000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按沉淀与乙醇的固液比0.8g/ml加入体积分数为70％的乙醇超声提取3次，超声提取的频率为35khz，温度为4℃，每次超声的时间为30min，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于水绵(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示水绵湿藻)，即得水绵乙醇提取物。

实施例3水绵乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的水绵湿藻，在温度为-30℃的条件下冷冻10小时，室温融化12小时，反复冻融4次，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按沉淀与乙醇的固液比1.5g/ml加入体积分数为90％的乙醇超声提取2次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为20min，在转速为8000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于水绵(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示水绵湿藻)，即得水绵乙醇提取物。

实施例4水绵乙醇提取物对自然条件下秀丽隐杆线虫平均寿命的影响

向同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)(由美国明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传信息保藏中心提供)中加入终浓度为100mga/ml的实施例1制备的水绵乙醇提取物，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养，然后每隔1天统计秀丽隐杆线虫的存活情况，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的寿命以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图1所示。

图1结果显示，与对照组相比，水绵乙醇提取物相能够延长自然条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命。试验结果表明本发明提供的水绵乙醇提取物具有延缓衰老进程的作用。

实施例5水绵乙醇提取物对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响

取实施例1制得的水绵乙醇提取物，按终浓度100mga/ml加入到成虫初期的野生型秀丽隐杆线虫(n2)中，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，加入终浓度为50mm的百草枯进行氧化胁迫造模，然后每隔12h统计秀丽隐杆线虫存活的比例，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的存活率以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图2所示。

百草枯，学名甲基紫精，是一种强氧化剂，可诱导体内大量产生活性氧自由基(ros)，使机体处于氧化胁迫环境，进而出现早衰现象。图2结果显示，水绵乙醇提取物能够延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率。试验结果表明本发明提供的水绵乙醇提取物能够缓解由氧化胁迫引起的早衰现象，具有显著的抗氧化和抗衰老作用。

实施例6水绵乙醇提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响

取24孔培养板，设试验组和对照组，每组设两个孔，每孔终体积为1ml，试验组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和实施例1制得的水绵乙醇提取物，水绵乙醇提取物的终浓度100mga/ml，对照组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和与试验组水绵乙醇提取物等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，每孔加入百草枯至终浓度为2mm，继续培养48h后，收集各组秀丽隐杆线虫，将其分别在冰浴条件下匀浆，将匀浆液在4℃、10000g条件下离心5min，收集上清液，向上清液中加入终浓度为50μm的dcfh-da探针(购于sigma公司，cas号：2044-85-1)溶液，利用荧光酶标仪在485nm激发波长和538nm发射波长下检测荧光强度，室温检测2h，每10min测一次。结果如图3所示。

图3结果显示，与对照组相比，经水绵乙醇提取物饲喂后，秀丽隐杆线虫体内ros水平显著下降。试验结果表明本发明提供的水绵乙醇提取物能够促进体内ros的清除，显著降低体内ros水平，具有显著的抗氧化能力。

实施例7水绵水提取物的制备

s1、取新鲜的水绵湿藻，在温度为-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融3次，在转速为5000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为70％的乙醇超声提取4次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为20min，在转速为5000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s3、用一级水洗涤步骤s2所述的沉淀2次，在转速为10000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，去上清液，向沉淀中按湿藻与一级水的固液比1g/ml加入一级水在温度为70℃的条件下提取5次，每次60min，在转速为10000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取上清液，加一级水调节其相对于水绵(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示水绵湿藻)，即得水绵水提取物。

实施例8水绵水提取物对自然条件下秀丽隐杆线虫平均寿命的影响

向同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)中加入终浓度为100mga/ml的实施例7制备的水绵水提取物，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养，然后每隔1天统计秀丽隐杆线虫的存活情况，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的寿命以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图4所示。

图4结果显示，与对照组相比，水绵水提取物相能够延长自然条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命。试验结果表明本发明提供的水绵水提取物具有延缓衰老进程的作用。

实施例9水绵水提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响

取24孔培养板，设试验组和对照组，每组设两个孔，每孔终体积为1ml，试验组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和实施例7制得的水绵水提取物，水绵水提取物的终浓度100mga/ml，对照组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和与试验组水绵水提取物等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，每孔加入百草枯至终浓度为2mm，继续培养48h后，收集各组秀丽隐杆线虫，将其分别在冰浴条件下匀浆，将匀浆液在4℃、10000g条件下离心5min，收集上清液，向上清液中加入终浓度为50μm的dcfh-da探针溶液，利用荧光酶标仪在485nm激发波长和538nm发射波长下检测荧光强度，室温检测2h，每10min测一次。结果如图5所示。

图5结果显示，与对照组相比，经水绵水提取物饲喂后，秀丽隐杆线虫体内ros水平显著下降。试验结果表明本发明提供的水绵水提取物能够促进体内ros的清除，显著降低体内ros水平，具有显著的抗氧化能力。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。