一种重编程NK细胞的培养方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种重编程nk细胞的培养方法。

背景技术：

基于crispr/cas9技术将t细胞重编程成为nk细胞，有利于克服主要组织相容性复合体(mhc)对t细胞的限制性，已成为细胞免疫治疗领域的研究热点。重编程nk细胞具有t细胞和nk细胞的双重功能，相较于t细胞或nk细胞具有显著提高的肿瘤杀伤功能，在癌症治疗中展现出了巨大的潜力。

将重编程nk细胞应用于免疫治疗的一大障碍是难以生产大量功能完全的重编程nk细胞，同时缺少体外扩增重编程nk细胞的标准方法。目前常用的nk细胞的培养方法包括血液细胞分离法、细胞因子或化学药品刺激法和饲养细胞法，但是这些方法普遍存在着操作繁琐、成本高、周期长、数量无法满足需求的问题，且不十分适用于重编程nk细胞的培养。

因此，有必要根据重编程nk细胞的特有属性，建立一种简单高效的培养方法，以期在短期内获得大量的重编程nk细胞。

技术实现要素：

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种重编程nk细胞的培养方法，所述方法采用表达膜固定il-12和cd19的人工抗原呈递细胞培养重编程nk细胞，显著提高了重编程nk细胞的数量和扩增效率，增强了重编程nk细胞的肿瘤杀伤活性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种重编程nk细胞的培养方法，所述方法包括：

构建表达膜固定il-12和cd19的人工抗原呈递细胞，将重编程nk细胞与所述人工抗原呈递细胞共培养。

本发明中，将il-12和cd19表达于哺乳动物细胞表面构建人工抗原呈递细胞，通过与重编程nk细胞表面的受体结合用于活化重编程nk细胞，显著提高了重编程nk细胞的扩增数量，并促进了重编程nk细胞的肿瘤细胞毒性。

优选地，所述il-12包括il-12a和il-12b，所述il-12通过il-12b与cd8α跨膜区形成融合蛋白、表达在所述人工抗原递呈细胞表面。

优选地，所述il-12a包括如seqidno:1所示的氨基酸序列；

seqidno:1：

mwppgsasqpppspaaatglhpaarpvslqcrlsmcparslllvatlvlldhlslarnlpvatpdpgmfpclhhsqnllravsnmlqkarqtlefypctseeidheditkdktstveaclpleltknesclnsretsfitngsclasrktsfmmalclssiyedlkmyqvefktmnakllmdpkrqifldqnmlavidelmqalnfnsetvpqkssleepdfyktkiklcillhafrira。

优选地，所述il-12b包括如seqidno:2所示的氨基酸序列；

seqidno:2：

mchqqlviswfslvflasplvaiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsacpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirkpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryy。

优选地，所述cd19包括seqidno:3所示的氨基酸序列；

seqidno:3：

mppprllffllfltpmevrpeeplvvkveegdnavlqclkgtsdgptqqltwsresplkpflklslglpglgihmrplaiwlfifnvsqqmggfylcqpgppsekawqpgwtvnvegsgelfrwnvsdlgglgcglknrssegpsspsgklmspklyvwakdrpeiwegeppclpprdslnqslsqdltmapgstlwlscgvppdsvsrgplswthvhpkgpksllslelkddrpardmwvmetglllprataqdagkyychrgnltmsfhleitarpvlwhwllrtggwkvsavtlaylifclcslvgilhl。

优选地，所述cd8α跨膜区包括seqidno:4所示的氨基酸序列；

seqidno:4：

iyiwaplagtcgvlllslvitlyc。

优选地，所述人工抗原呈递细胞的构建方法包括：

构建包括il-12a编码基因、il-12b和cd8α跨膜区融合蛋白编码基因或cd19编码基因中的任意一种或至少两种的组合的慢病毒载体，利用慢病毒系统将il-12a编码基因、il-12b和cd8α跨膜区融合蛋白编码基因和cd19编码基因导入k562细胞。

优选地，所述重编程nk细胞的制备方法包括：将靶向bcl11b基因的rnp复合物电转入活化的t细胞，得到重编程nk细胞，其中，所述rnp复合物包括靶向bcl11b基因的crrna、tracrrna和cas9蛋白。

优选地，所述crrna包括seqidno:5所示的核酸序列；

seqidno:5：gaagcagtgtggcggcagctgttttagagcta。

优选地，所述tracrrna包括seqidno:6所示的核酸序列；

seqidno:6：tagcaagttaaaataaggctagtcatttatcacattgaaaatctggcaccgagtcggtg。

优选地，所述电转的电压为800～2500v，例如可以是800v、900v、1000v、1100v、1200v、1300v、1400v、1500v、1600v、1700v、1800v、1900v、2000v、2100v、2200v、2300v、2400v或2500v。

优选地，所述重编程nk细胞与所述人工抗原递呈细胞的数量比为(0.25～1):1，例如可以是0.25:1、0.3:1、0.35:1、0.4:1、0.45:1、0.5:1、0.55:1、0.6:1、0.65:1、0.7:1、0.75:1、0.8:1、0.85:1、0.9:1、0.95:1或1:1。

优选地，所述共培养的时间为3～14天，例如可以是3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天。

优选地，所述方法还包括对共培养的重编程nk细胞与人工抗原递呈细胞进行辐照的步骤。

优选地，所述辐照的剂量为50～500gy，例如可以是50gy、100gy、150gy、200gy、250gy、300gy、350gy、400gy、450gy或500gy。

作为优选技术方案，本发明提供了一种重编程nk细胞的培养方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建包括il-12a编码基因、il-12b和cd8α跨膜区融合蛋白编码基因或cd19编码基因中的任意一种或至少两种的组合的慢病毒载体，利用慢病毒系统将il-12a编码基因、il-12b和cd8α跨膜区融合蛋白编码基因和cd19编码基因导入k562细胞，构建表达膜固定il-12和cd19的人工抗原呈递细胞；

将靶向bcl11b基因的crrna、tracrrna和cas9蛋白组成的rnp复合物在800～2500v下电转入活化的t细胞，得到重编程nk细胞；

(2)将所述重编程nk细胞与所述人工抗原递呈细胞按照数量比为(0.25～1):1共培养3～14天，期间进行50～500gy辐照，进行重编程nk细胞扩增。

第二方面，本发明提供了一种重编程nk细胞，所述重编程nk细胞采用第一方面所述的方法培养得到。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用表达膜固定il-12和cd19的人工抗原呈递细胞与重编程nk细胞共培养，对重编程nk细胞具有活化作用，显著提高了重编程nk细胞的扩增数量，实现了短期内迅速获得大量高纯度重编程nk细胞的效果；

(2)本发明培养获得的重编程nk细胞杀瘤能力强、杀伤功能稳定、寿命长。

附图说明

图1为重编程nk细胞与il-12/cd19-k562共培养后的体外扩增能力；

图2为重编程nk细胞与il-12/cd19-k562共培养后的肿瘤细胞毒性。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1人工抗原呈递细胞的构建

人工合成t2a连接的il-12a编码基因、il-12b和cd8α跨膜区融合蛋白编码基因、cd19编码基因，构建融合基因，融合基因的两端添加ecori和bamhi酶切位点，经过ecori和bamhi酶切后，克隆入pcdh质粒，构建慢病毒载体；

将慢病毒载体和辅助质粒pmd2.g、pspax2与转染试剂pei混合后，导入293t细胞中，培养6h更换新鲜培养基，包装24h、48h和72h后，收取病毒上清进行1000g离心10min，0.45μm滤器过滤得到重组慢病毒；

将野生型k562细胞重悬于10mlopti-mem中，300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μl缓冲液中，加入重组慢病毒，并加入8μg/mlpolybrene和300iu/mlil-2，置于37℃、5％co2培养箱培养；24h后，300g离心5min，去上清，用含300iu/mlil-2的新鲜培养基重悬细沉淀，即得人工抗原呈递细胞。

实施例2rnp复合物的制备

根据bcl11b基因设计crrna(seqidno:5)和tracrrna(seqidno:6)，进行基因合成，将crrna、tracrrna和cas9蛋白按照1:2:2的比例混匀，采用opti-mem^tm配制得到浓度为40μmrnp混合溶液，待用。

实施例3重编程nk细胞的制备与扩增

(1)采用ficoll密度梯度离心试剂盒(ge公司)从全血中分离外周血单个核细胞(pbmc)，去除红细胞后，利用macspan-t磁珠分选出t细胞，分选出来的t细胞用macs激活试剂盒激活24小时，采用t细胞培养基稀释至细胞浓度为2.5×10⁶个/ml；

(2)300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μlopti-mem中，加入浓度为40μm的rnp复合物，混匀后转移至电lonza电击杯，将电击杯置于lonza4d-nucleofectortmxunit(单电击杯模块中)，进行电转，设定电转的电压为800v，时间为4ms；

(3)将电转后的细胞与实施例1制备的表达il-12和cd19的k562在1:1的比例下共培养3～14天，并进行50gy辐照，进行重编程nk细胞扩增。

本实施例同时设置以下对照组：

il-12对照组：rnp复合物电转后的细胞与il-12+k562共培养3～14天；

cd19对照组；rnp复合物电转后的细胞与cd19+k562共培养3～14天；

空白对照组：rnp复合物电转后的细胞与k562细胞共培养3～14天。

实施例4重编程nk细胞的体外扩增能力

对实施例3的重编程nk细胞进行生长状态检测，结果如图1所示，il-12+cd19+k562细胞对重编程nk细胞扩增的促进作用显著高于其他对照组，共培养14天后，重编程nk细胞的数量增长约40倍，说明采用il-12+cd19+k562细胞作为人工抗原呈递细胞，对经电转rnp复合物制备的重编程nk细胞具有促进体外扩增的作用。

实施例5重编程nk细胞的肿瘤细胞毒性

将实施例3的重编程nk细胞、t细胞和nk细胞分别与5×10³个卵巢癌细胞系skov3共培养于u型96孔板中，效应细胞与靶标细胞的比例(e:t)为1:1，每组实验重复3次；

经过18小时的共培养后，向96孔板中加入100μl/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定rlu(relativelightunit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较不同重编程nk细胞对skov3的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图2所示，重编程nk细胞的杀伤效率高于t细胞和nk细胞，而与il-12+cd19+k562细胞共培养获得的重编程nk细胞的杀伤效率更高。

综上所述，本发明采用表达膜固定il-12和cd19的人工抗原呈递细胞与重编程nk细胞共培养，得到的重编程nk细胞保留有t细胞和nk细胞的固有属性，同时具有增强的杀瘤能力，在细胞免疫治疗领域具有重要意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

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<110>广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120>一种重编程nk细胞的培养方法

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