一种吡咯并吲哚类化合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于医药领域，涉及一种吡咯并吲哚类化合物及其在治疗和/或预防bet蛋白有关疾病的用途。

背景技术：

溴结构域和超末端结构域(bet)家族属于溴结构域蛋白家族，在多种肿瘤中bet家族表达上调，其与细胞生长、增殖分化、凋亡坏死等多种生物学过程相关，进而参与调控肿瘤发生发展的过程。人体bet家族包括brd2、brd3、brd4和brdt四个成员目前研究表明，bet家族主要通过结合到组蛋白尾部，发挥调控基因转录、调节细胞生长等作用，在人体组织广泛表达，参与肥胖、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病(copd)、癫痫等众多疾病的发生和发展，而近年研究发现，其还参与肿瘤的发生、浸润、转移等过程，如造血系统肿瘤(急性髓细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、b细胞急性淋巴白血病等)，通过干扰brd4与癌基因myc的结合，可以抑制myc的表达，进而引起肿瘤细胞凋亡。

bet家族的抑制剂主要包括二氮杂及其衍生物(jq1、ibet762、otx015)、喹啉酮类及其衍生物(pfi-1、rvx-208)、异噁唑类(ibet151)、四氢喹啉类(i-bet726)、萘啶类等，目前关于bet抑制剂的10余项ⅰ期药物临床实验正在进行中，且在血液系统肿瘤中已初见成效。虽然已经取得了不少成果，但bet抑制剂缺乏对于bet家族成员的选择性，耐药以及副作用都限制着其在临床的应用。目前已有10余种bet家族的抑制剂进入临床试验，但绝大多数都是非选择性的，特异性不佳，因此，研发对bet家族成员具有特异性的新型抑制剂可能成为目前的新方向。

本发明创新性的合成了一种吡咯并吲哚类化合物，具有良好的bet蛋白抑制活性，并且表现出优异的成药性质，以期得到可以用于治疗和/或预防bet蛋白有关疾病的全新化合物，现有技术并未见到相关结构的报道。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种吡咯并吲哚类化合物的制备方法和应用，此类化合物具有良好的bet蛋白抑制活性，具有良好的应用前景，可用于制备治疗和/或预防bet蛋白有关疾病的药物。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种吡咯并吲哚类化合物，其结构通式i如下：

式中：r1选自h或者cf3，r2选自h或者cf3。

本发明另一目的为提供吡咯并吲哚类化合物式i的合成路线为：

进一步地，上述合成路线中各步骤的合成方法如下：化合物ⅱ和通式ⅲ化合物在高温下、适宜的溶剂中反应5小时左右制得目标化合物ⅰ。

部分化合物的部分化合物的nmr数据如下：

化合物1：¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:2.43(s,6h),2.66(s,1h),6.22(s,1h),6.84(d,2h),7.22(d,2h),7.55(s,1h),7.73(s,1h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:13.53,13.97,99.43,103.93,111.02,111.79,115.60,118.82,125.77,126.99,128.63,128.80,129.64,132.90,133.70,139.04,147.10,157.07,165.63；

化合物2：¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:2.27(s,3h),2.49(s,3h),7.21(s,1h),7.26(m,1h),7.32(d,1h),7.38(d,1h),7.73(d,1h),9.72(s,1h),10.72(s,1h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:13.25,14.69,107.96,109.24,116.31,116.33,117.53,119.81,120.08,121.74,122.04,123.12,123.87,126.82,129.57,130.14,137.65,141.62,143.82,162.99,163.29,164.54。

本发明所述的一种吡咯并吲哚类化合物，具有良好的bet蛋白抑制活性，具有良好的应用前景，可用于制备治疗和/或预防bet蛋白有关疾病的药物，可以进行更加深入的研究。

所述的治疗和/或预防bet蛋白有关疾病的药物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备治疗和/或预防bet蛋白有关疾病药物的应用，特别是提供了一种吡咯并吲哚类化合物在治疗和/或预防bet蛋白有关疾病的应用。

具体来说，bet蛋白有关疾病为淋巴瘤、多发性骨髓瘤、b细胞急性淋巴白血病、肝癌、肾癌、神经胶质瘤、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌，类风湿性关节炎。

与现有技术比，本发明的有益效果如下：

本发明的化合物具有较好的bet蛋白抑制活性，有望开发为新一代高效低毒的bet蛋白抑制剂。

综上所述，将本发明所述的一种吡咯并吲哚类化合物用于制备治疗和/或预防bet蛋白有关疾病的药物具有很好的开发前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1：本发明所得吡咯并吲哚类化合物的brd4蛋白结合能力。

图2：本发明所得吡咯并吲哚类化合物对白血病细胞mv4-11的体外抗肿瘤活性结果。

图3：本发明所得吡咯并吲哚类化合物对急性白血病细胞中brd4蛋白的影响。

具体实施方式

下列合成实例、生物测试结果可用来进一步说明本发明，但不意味着限制本发明。

合成实例

实施例1、化合物ⅱ的合成

向盛有thf(100ml)的反应瓶中加入2-甲基吡咯-1-溴化镁(210mmol)的甲苯溶液，溶液变黑色，然后滴加3,4-二溴-1-甲基吡咯烷-2,5-二酮(100mmol)的甲苯溶液，约40分钟内滴加完毕，溶液呈红黑色，然后在回流条件下反应约7小时，反应完全后，降温至室温，加入饱和氯化铵水溶液(400ml)淬灭反应，用乙酸乙酯萃取(3×200ml)，合并有机相，减压蒸去溶剂，用柱层析分离(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝3:1，硅胶200-300目)，得到红色固体1-甲基-3,4-双(5-甲基-1h-吡咯-3-基)吡咯烷-2,5-二酮，20.38g，产率为75.1％。

¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:2.29(s,6h),3.22(s,3h),5.27(s,2h),5.94(s,2h),6.64(s,2h),7.62(s,2h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:13.05,23.65,47.50,103.18,123.19,125.12,130.74,175.83.lc-ms(esi,pos,ion)m/z:272[m+h]。

在250ml圆底烧瓶中加入1-甲基-3,4-双(5-甲基-1h-吡咯-3-基)吡咯烷-2,5-二酮(50mmol)，并加入丁酮(200ml)使其溶解，再加入碳酸钾(200mmol)和氯化铜(90mmol)，将反应装置于85℃的油浴中反应，反应过程中tlc跟踪监测，6小时基本反应完全，然后冷却至室温，抽滤，少量丁酮洗涤，用0.1mol/l的盐酸溶液清洗有机相，然后水洗，用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏蒸去溶剂，用石油醚打浆得到浅黄色固体2,5,8-三甲基-1,9-二氢-4h-二吡咯并[3,4-e:3',2'-g]吲哚-4,6(5h)-二酮，11.04g，产率为82.6％。

¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:2.44(s,6h),3.05(s,3h),6.22(s,2h),7.73(s,2h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:13.97,24.48,99.43,117.18,125.84,128.16,139.04,172.30.lc-ms(esi,pos,ion)m/z:268[m+h]。

在-78℃的n2气氛下，将2,2,2-三氟乙酸酐(50mmol)逐滴加入2,5,8-三甲基-1,9-二氢-4h-二吡咯并[3,4-e:3',2'-g]吲哚-4,6(5h)-二酮(50mmol)和三乙胺(50mmol)在ch2cl2(100ml)的溶液中，然后使反应在1小时内升温至室温。室温反应两小时后，在减压下蒸发溶剂，通过使用己烷/etoac＝7/3为洗脱剂的硅胶色谱纯化，得到黄色固体2,5,8-三甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢-4h-二吡咯并[3,4-e:3',2'-g]吲哚-4,6(5h)-二酮，11.95g，产率为65.8％。

¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:2.43(s,6h),3.05(s,3h),6.22(s,1h),7.58(s,1h),7.73(s,1h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:13.53,13.97,24.48,99.43,103.93,111.05,111.79,126.42,128.14,129.30,130.17,132.90,136.48,139.04,157.07,172.30.lc-ms(esi,pos,ion)m/z:364[m+h]。

在圆底烧瓶中加入2,5,8-三甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢-4h-二吡咯并[3,4-e:3',2'-g]吲哚-4,6(5h)-二酮(50mmol)，将质量浓度为10％的氢氧化钾溶液(50ml)滴加入其中，磁力搅拌下于90℃的油浴锅中回流反应约6小时，tlc跟踪监测至反应完全。降温至室温后，用摩尔浓度为2mol/l的盐酸溶液淬灭反应，烧瓶内出现大量黄色固体，至溶液呈中性后，在室温下搅拌1小时，抽滤，水洗，得到黄褐色固体2,8-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢呋喃并[3,4-e]吡咯并[3,2-g]吲哚-4,6-二酮(化合物ⅱ)，15.97g，产率为91.2％。

¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:2.43(s,6h),6.22(s,1h),7.73(s,1h),7.85(s,1h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:13.53,13.97,99.43,103.93,110.36,111.79,118.86,120.11,121.64,127.82,129.85,132.90,139.04,157.07,164.80.lc-ms(esi,pos,ion)m/z:351[m+h]。

实施例2、化合物1的合成

将2,8-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢呋喃并[3,4-e]吡咯并[3,2-g]吲哚-4,6-二酮(50mmol)加入甲醇(60ml)中，加入对肼氯苯(51mmol)，加热回流反应约5小时，然后降温到20～30℃，减压蒸出溶剂，残余物用石油醚打浆2.5小时，过滤，石油醚洗涤，然后在50℃下真空干燥，得到类白色固体5-((4-氯苯基)氨基)-2,8-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢-4h-二吡咯并[3,4-e:3',2'-g]吲哚-4,6(5h)-二酮,21.72g，产率为91.5％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:475[m+h]。

实施例3、化合物2的合成

将2,8-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢呋喃并[3,4-e]吡咯并[3,2-g]吲哚-4,6-二酮(50mmol)加入甲醇(60ml)中，加入(4-氯-2-三氟甲基-苯基)肼(51mmol)，加热回流反应约5小时，然后降温到20～30℃，减压蒸出溶剂，残余物用石油醚打浆2.5小时，过滤，石油醚洗涤，然后在50℃下真空干燥，得到类白色固体5-((4-氯-2-三氟甲基-苯基)氨基)-2,8-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢-4h-二吡咯并[3,4-e:3',2'-g]吲哚-4,6(5h)-二酮,23.75g，产率为87.5％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:543[m+h]。

实施例4、化合物3的合成

将2,8-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢呋喃并[3,4-e]吡咯并[3,2-g]吲哚-4,6-二酮(50mmol)加入甲醇(60ml)中，加入(4-氯-3-三氟甲基-苯基)肼(51mmol)，加热回流反应约5小时，然后降温到20～30℃，减压蒸出溶剂，残余物用石油醚打浆2.5小时，过滤，石油醚洗涤，然后在50℃下真空干燥，得到类白色固体5-((4-氯-3-三氟甲基-苯基)氨基)-2,8-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢-4h-二吡咯并[3,4-e:3',2'-g]吲哚-4,6(5h)-二酮,23.23g，产率为85.6％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:543[m+h]。

实施例5、化合物4的合成

将2,8-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢呋喃并[3,4-e]吡咯并[3,2-g]吲哚-4,6-二酮(50mmol)加入甲醇(60ml)中，加入(4-氯-2,5-二三氟甲基-苯基)肼(51mmol)，加热回流反应约5小时，然后降温到20～30℃，减压蒸出溶剂，残余物用石油醚打浆2.5小时，过滤，石油醚洗涤，然后在50℃下真空干燥，得到类白色固体5-((4-氯-2,5-二三氟甲基-苯基)氨基)-2,8-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,9-二氢-4h-二吡咯并[3,4-e:3',2'-g]吲哚-4,6(5h)-二酮,27.43g，产率为89.8％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:611[m+h]。

实验例1、本发明所得化合物对brd4蛋白结合能力的测定

本发明所得到的化合物均采取amplifiedluminscentproximityhomogeneousassay(alphascreen)法来检测brd4蛋白的活性。abbv-075作为阳性对照化合物。在ph值为7.4的室温条件下，每孔中配置50mmhepes、100mmnacl、0.1％bsa和0.05％chaps的混合缓冲溶液。配体从150μm以1:2的12比例连续稀释得到24个梯度的浓度，并在每孔中加入4μlhis标记brd4250nm；孔板培养30分钟后加入4μl生物素化肽(h4k5kac8kac12kac16ac)；再次培养30分钟后在弱光下加入25μg/ml的链霉亲和素包被的供体株4μl和25μg/ml的镍螯合物受体株4μl，然后在避光条件下培养60分钟后使用pherastarfsplatereader(bmglabtech,germany)设备读取光强，激发/发射光波长分别为680/570nm。以浓度的log值作为x轴，百分比抑制率为y轴，采用分析软件graphpadprism5的log(inhibitor)vs.response-variableslope拟合量效曲线，从而得出化合物对蛋白结合抑制的ic50值。

测试结果如图1表明，本发明所提供化合物均对具有bet蛋白具有显著的抑制效果。

试验例2、本发明所得化合物的体外抗肿瘤活性测定

用mtt法测定对白血病细胞株mv4-11肿瘤细胞株的抑制作用。abbv-075作为阳性对照化合物。将处于细胞对数生长期的要进行实验的肿瘤细胞按一定的细胞量接种于96孔培养板内，培养24h后加入所筛的样品(悬浮细胞接板后可直接加)，细胞在37℃、5％co2条件下继续培养48小时后，加入mtt继续培养4小时，用dmso溶解结晶，在酶标仪下进行检测，计算ic50值。

测试结果如图2表明，本发明所得化合物均对结白血病细胞mv4-11具有良好的体外抗肿瘤活性，尤其是化合物2，其ic50低于5nm。

试验例3、所得化合物对肿瘤细胞内bet蛋白的影响

采用蛋白质免疫印迹法测定所得化合物对肿瘤细胞内bet蛋白的影响。培养好的白血病细胞株mv4-11肿瘤细胞株接种至6孔板上(1x10⁶细胞/孔)。继续培养过夜后，将所得化合物2以100nm的工作浓度处理细胞。处理24小时和48小时后，收获细胞。培养的细胞收获后，使用全细胞裂解液(wholecelllysates，wcl)裂解后离心，加入样品缓冲液煮沸，进行sds-page电泳，电泳结束后将蛋白转移到pvdf膜上，5％bsa封闭后，一抗(bet)和内参蛋白(gapdh))孵育过夜，冲洗后hpr-标记的二抗室温孵育两个小时，冲洗后化学发光法检测enhancedchemiluminescence(ecl)detectionsystem，结果如图3所示。结果显示本发明所得化合物处理细胞24小时即可观察到显著的bet蛋白抑制作用。

bet蛋白体外活性测试表明，本发明所提供的化合物具有显著的bet蛋白结合能力。由于bet在肿瘤细胞生长增殖中具有关键性作用，且在细胞内有蛋白抑制活性，本发明所提供的化合物可以用于预防或治疗与bet蛋白抑制剂有关的疾病的药物中，尤其是肿瘤的药物中。