用于测序的系统和方法与流程

用于测序的系统和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年8月21日提交的美国临时申请第62/890,003号的权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开大体上涉及用于操纵和分析核酸的系统和方法。


背景技术：

4.生物和医疗研究日益转向用于增强生物研究和医学的核酸测序。例如，生物学家和动物学家正转向用以研究动物迁移、物种进化和性状来源的测序。医学团体正使用测序来研究疾病的起因、对药品的敏感性和感染的起因。因此，测序在生物学、治疗学、诊断学、法医学和研究的许多方面都具有广泛适用性。
5.然而，测序的使用会受到测定可用性、测序运行时间、准备时间和成本的限制。另外，质量测序在历史上一直是一种昂贵的过程，因此限制了其实践。
6.因此，期望改进的测序系统。
附图说明
7.通过参考附图，可以更好地理解本公开，并且其众多特征和优点对于本领域技术人员来说是显而易见的。
8.图1包含示例测序系统的图示。
9.图2包含其中包含传感器阵列的示例系统的图示。
10.图3包含示例传感器和相关联孔的图示。
11.图4包含用于制备测序装置的示例方法的图示。
12.图5展示了用于制备珠粒组装体的示例示意图。
13.图6包含示例测序系统的图示。
14.图7包含示例仪器的图示。
15.图8包含示例仪器台板的图示。
16.图9包含仪器的示例试剂存储的图示。
17.图10包含示例消耗品的图示。
18.图11和图12包含示例盒系统的图示。
19.图13包含用于接收盒的示例对接站的图示。
20.图14和图15包含示例传感器装置的图示。
21.图16、图17和图18包含示例流体联接器的图示。
22.图19和图20包含传感器装置与流体联接器之间的示例互连的图示。
23.图21和图22包含与传感器装置交互的示例机械系统的图示。
24.图23和图24包含与机械系统一起使用的示例滑块机构的图示。
25.图25包含在流体联接器与传感器装置之间提供流体连接的示例机械组合件的图示。
26.图26和图27包含示例流体歧管的图示。
27.图28包含用于使用机械系统与传感器装置交互的示例方法的流程框图。
28.图29包含示例磁性装置系统的示意图。
29.图30示意性地展示了含有磁性珠粒的溶液相对于磁性包以第一速度进行的移动。
30.图31示意性地展示了含有磁性珠粒的溶液相对于磁性包以第二速度进行的移动。
31.图32示意性地展示了含有磁性珠粒的溶液相对于磁性包在相反方向上的移动。
32.图33展示了其上装载有珠粒的微芯片。
33.图34示意性地展示了磁性装置模型。
34.图35、图36、图37和图38包含示例装载装置的图示。
35.图39是总体上展示了本发明教导的流体多路复用器块的分解视图。
36.图40是总体上展示了流体多路复用器块如图1的流体多路复用器块的流体多路复用器单元的等距视图。
37.图41是总体上展示了本发明教导的流体多路复用器单元与多泳道传感器装置的所选泳道之间的流体集成的示意性表示。
38.图42是总体上展示了流体多路复用器块夹具组合件的后等距视图，所述流体多路复用器块夹具组合件包含其中安装有流体多路复用器块组合件的流体多路复用器块夹具。
39.图43是总体上展示了电极集成到流体多路复用器单元中的截面视图。
40.图44是总体上展示了流体多路复用器块夹具组合件的前等距视图，所述流体多路复用器块夹具组合件包含其中安装有流体多路复用器块组合件的流体多路复用器块夹具。
41.图45是总体上展示了安装到定位在传感器装置安装组合件中的多泳道传感器装置的流体多路复用器块夹具中的流体多路复用器块的组合件的截面视图。
42.图46是总体上展示了流体多路复用器块安装到多泳道传感器阵列装置的扩展等距视图。
43.图47是总体上展示了本发明教导的测序系统的流控系统的示意性表示。
44.图48包含示例电子接口的图示。
45.图49示出了服务器系统组件的示意图。
46.图50是分析流水线的框图。
47.图51是生成测定定义文件的示意图。
48.图52是测定定义文件打包的实例的示意图。
49.图53、图54、图55、图56、图57、图58和图59包含用于接种载体的方案的图示。
50.图60包含指示由各种扩增方法产生的读段的总数的曲线图。
51.图61a-f包含说明响应于模板拷贝数的参数的曲线图。
52.在不同附图中使用相同的附图标记来表示类似或相同的项。
具体实施方式
53.在一实施例中，测序系统包含自动测序仪器，所述自动测序仪器适于从一组样品多核苷酸中确定多核苷酸和变异识别的序列。所述系统可以利用靶向测定来生成扩增子或
靶多核苷酸文库，其被测序以在期望时间内提供比对的序列表和任选地变异识别。
54.自动测序仪器的实施例包含用于制备靶向多核苷酸文库的制备台板。在一实例中，将靶向多核苷酸接种到基板上，如聚合物或水凝胶珠粒。自动测序仪器可以进一步包含装载装置以将接种的基板施加到传感器装置上，并且可以包含测序仪，例如以执行合成测序反应，从而检测核苷酸掺入。自动测序仪器可以进一步包含计算装置以利用来自测序仪的数据来确定碱基识别、比对读段和变异识别。另外，所述系统可以包含用户接口或网络接口以将与碱基识别、比对读段或变异识别相关联的报告传送给用户。
55.定义
56.如本文所使用的，在本文与术语“多核苷酸”可互换使用的术语“核酸”和其变体是指核苷酸的聚合物，并且包含例如脱氧核糖核酸和核糖核酸。核酸包含但不限于dna、cdna、rna、嵌合rna/dna和核酸类似物。
57.如本文所使用的，引物是任何单链核酸分子(例如，寡核苷酸)，一旦与互补核酸序列杂交，就可以引发或启动核酸合成。通常，这种核酸合成以依赖模板的方式发生，并且在这种核酸合成过程中核苷酸聚合到引物的至少一端。引物通常具有游离的3'羟基，然而在一些实施例中，引物端被封端(例如，以防止从3'端延伸)或引物是融合引物，其中引物的不同部分被设计为结合到不同的配偶体。在涉及引物延伸的反应(例如，预接种扩增)中，在封端的融合引物的3'端处的封端部分可以降低引物二聚体形成的水准。在一些实施例中，封端或未封端的引物是带尾引物，其中5'端包含与靶核酸不互补的序列，引物的其余部分与所述靶核酸互补。此5'尾可以用作引物延伸的模板。在本文提供的方法的各个实施例中，核酸分子包含第一引物结合序列和任选地第二引物结合序列。在一些实施例中，本文所描述的反应包含分别结合正向引物结合序列和反向引物结合序列的第一引物群体和任选地第二引物群体。在一些实施例中，第一和第二引物被称作引物对。在一些实施例中，第一引物或第二引物是通用引物。第一引物可与正向引物结合序列或反向引物结合序列结合，且第二引物可与正向引物结合序列或反向引物结合序列结合。因此，术语“第一”和“第二”在本文中关于引物使用时是相对术语，并且每个都可以指正向或反向引物，这取决于它们使用的上下文。
58.如本文所使用的，核酸扩增是指通过核苷酸聚合合成核酸的新链的过程，并且涉及以下的一个或多个循环：将双链核酸分离，例如变性或解离成单链、引物与分离的双链核酸的单链的退火，例如杂交以及杂交引物的延伸。如本文所用，术语“引物延伸”及其变体涉及用于催化核苷酸掺入核酸分子末端的任何方法。在一些实施例中，扩增循环包含(a)双链核酸的链的部分、不完全或完全变性或解离，(b)引物与部分或完全单链核酸的杂交或退火以及(c)引物延伸以形成延伸的引物链。在一些实施例中，扩增循环任选地包含：(a)第一引物与模板核酸链杂交，(b)引物延伸以形成第一延伸核酸链以及(c)来自模板链的延伸链部分或不完全变性。任选地，来自步骤(c)的模板链的变性部分任意与下一扩增循环中的不同引物杂交。在一些实施例中，扩增循环中的引物延伸涉及从双链体的另一条链置换双链体核酸的一条链或从模板链置换第一条延伸链。可包含与第一延伸链的3'端杂交的第二引物。
59.许多核酸扩增方法是本领域已知的。一些实例包含重组酶-聚合酶扩增(rpa)、模板步行和聚合酶链式反应(pcr)扩增。在rpa反应中，在引物和核苷酸存在下，使用重组酶、
聚合酶和任选地重组酶辅助蛋白来扩增核酸分子。重组酶和任选地重组酶辅助蛋白可解离至少一部分的双链模板核酸分子，以使得引物杂交，随后聚合酶可结合以开始复制。重组酶辅助蛋白的实例是防止解离的核酸分子再杂交的单链结合蛋白(single-stranded binding protein；ssb)。通常，rpa反应是等温的，并且在等温温度下进行。在一些情况下，rpa反应可以在乳液内进行。在模板步移反应中，在允许至少一部分的双链模板核酸分子解离使得引物可杂交和聚合酶可随后结合以启动复制的反应条件中，在引物和核苷酸存在下，使用聚合酶来扩增模板核酸分子。在pcr中，通常通过热循环使双链模板核酸分子解离。冷却后，引物与互补序列结合并可以用于聚合酶的复制。在本文提供的方法的实施例中的一些实施例中，在反应混合物中进行预接种或模板化反应，所述反应混合物是由扩增模板核酸分子所必需的组分形成。在所公开的方面中的任何方面中，反应混合物包含以下中的一些或全部：模板核酸分子群体、聚合酶、具有所连接的第一引物群体的一种或多种载体或表面(例如，固体载体)、核苷酸或如二价阳离子等辅因子。在一些实施例中，反应混合物进一步包含第二引物和任选地扩散限制性药剂。在一些实施例中，模板核酸分子群体包括与和第一或第二引物杂交的至少一个衔接子序列接合的模板核酸分子。在一些实施例中，如在乳液rpa或乳液pcr中，反应混合物形成乳液。在涉及rpa的反应中，反应混合物包含重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。本文中进一步详细论述反应混合物的各种组分。
60.如本文中所使用的，术语“同一性”和“相同的”和其变化形式，当关于两种或更多种核酸序列使用时，是指两种或更多种序列(例如，核苷酸或多肽序列)的序列类似性。在两种或更多种同源序列的情况下，序列或其子序列的同一性或同源性百分比指示相同(即，约70％同一性，优选地75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的全部单体单元(例如，核苷酸或氨基酸)的百分比。当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，百分比同一性可以在指定区域上。当氨基酸水平或核苷酸水平存在至少约80％或至少约85％同一性时，序列被称为“基本上相同”。在一些情况下，当氨基酸水平或核苷酸水平存在至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性时，序列“基本上相同”。优选地，同一性存在于至少约20、25、50或100个残基长的区内或至少一个所比较的序列的整个长度上。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或其补体在严格杂交条件下彼此杂交。
61.如本文中所使用，术语“互补”和“补体”以及其派生词指可在反平行定向中(如在杂交双螺旋中)的两个或更多个独立相应位置经历累积碱基配对的任何两个或更多个核酸序列(例如部分或全部模板核酸分子、靶序列或引物)。此类碱基配对可根据任何现有规则集合进行，例如根据沃森-克里克碱基配对规则(watson-crick base pairing rules)。任选地，在第一与第二核酸序列之间可存在“完全”或“总体”互补，其中在第一核酸序列中的每个核苷酸可进行与第二核酸序列上的对应的反平行位置中的核苷酸的稳定化碱基配对相互作用。“部分”互补描述一个核酸序列的至少20％但少于100％的残基与在另一个核酸序列中的残基互补的核酸序列。在一些实施例中，一个核酸序列的至少50％但少于100％的残基与在另一个核酸序列中的残基互补。在一些实施例中，一个核酸序列的至少70％、80％、90％、95％或98％但少于100％的残基与在另一个核酸序列中的残基互补。当一个核酸序列中的至少85％的残基与另一个核酸序列中的残基互补时，序列被称为“基本上互
补”。在一些实施例中，两个互补或基本上互补序列能够在标准或严格杂交条件下彼此杂交。“不互补”描述其中一个核酸序列的少于20％的残基与在另一个核酸序列中的残基互补的核酸序列。当一个核酸序列中的少于15％的残基与在另一个核酸序列中的残基互补时，序列被称为“基本上不互补”。在一些实施例中，两个不互补或基本上不互补序列不能在标准或严格杂交条件下彼此杂交。“错配”存在于不互补的两个相对核苷酸中的序列中的任何位置。互补核苷酸包含在生理条件下在dna复制期间通过与彼此相对的dna聚合酶有效并入的核苷酸。
62.如本文所使用的，术语“单克隆”和其变体，当用于提及一种或多种多核苷酸群体时，是指多核苷酸群体，其中约50-99％或至多100％或100％的群体成员在核苷酸序列水平上具有至少80％同一性或至少85％同一性或至少90％同一性或至少95％同一性或至少99％同一性或约100％同一性或100％同一性。如本文所用，当提及一种或多种多核苷酸群体使用时，短语“基本上单克隆”和其变化形式是指一种或多种多核苷酸群体，其中一个多核苷酸分子，例如所扩增的模板多核苷酸分子是群体中单一最普遍的多核苷酸。因此，单克隆或基本上单克隆群体的所有成员不一定完全相同或彼此互补。例如，可扩增或复制多核苷酸模板的不同部分，以产生所得单克隆群体的成员；类似地，可在初始模板的扩增期间发生一定数量的“差错”或不完全延伸，由此生成其个别成员可在其自身中呈现序列可变性的单克隆或基本上单克隆群体。在一些实施例中，可在核酸扩增反应期间发生低或非基本上水准的非同源多核苷酸的混合，且因此基本上单克隆群体可含有少数的一种或多种多核苷酸(例如小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％或小于0.001％的多种多样的多核苷酸)。在某些实例中，群体中的至少90％的多核苷酸与用作扩增基础的初始单一模板至少90％相同，以产生基本上单克隆群体。在某些实施例中，模板多核苷酸的扩增产生多核苷酸群体，其中至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多核苷酸群体成员与生成群体的模板核酸共享至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施例中，模板多核苷酸的扩增产生多核苷酸群，其中足够的大部分多核苷酸共享足够的序列同一性，以允许使用高通量测序系统对扩增模板的至少一部分进行测序。
63.在一些实施例中，至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％的与模板化载体连接的核酸分子的成员将与模板核酸分子具有大于90％、95％、97％、99％或100％同一性。在一些实施例中，使用任一种扩增方法产生的核酸群体的成员在高严格杂交条件下彼此进行杂交。
64.在一些实施例中，包含例如用于模板化核酸的扩增方法的本文提供的扩增方法以及涉及所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒生成基本上单克隆核酸分子群体，其包含足够少的多克隆污染物，因此它们可以在高通量测序方法中被成功测序。例如，扩增方法可以生成基本上单克隆核酸分子群体，其提供使用特定测序系统检测的信号(例如，测序信号、核苷酸掺入信号等)的产生。此类信号包含指示核苷酸聚合的任何可检测信号，包含但不限于光学或光学可检测信号、非光学信号(或可通过非光学检测技术检测的信号)、离子(例如，氢离子)浓度、ph、电信号、电压和任何此类信号的波动变化。任选地，随后可分析信号以正确地确定存在于群体的任何核酸分子内的任何一种或多种核苷酸的序列或碱基
同一性。用于检测或分析此类信号的合适测序系统的实例包含但不限于包含离子传感器的系统，例如场效应晶体管(fet)，例如chemfet或isfet。“chemfet”或化学场效应晶体管包含充当化学传感器的场效应晶体管类型。chemfet的结构类似于mosfet晶体管，其中通过化学工艺施加栅电极上的电荷。“isfet”或离子敏感性场效应晶体管用于测量溶液中的离子浓度；当离子浓度(如h
+
)改变时，通过晶体管的电流因此改变。包含fet传感器的系统的非限制性实例为ion torrent测序系统，如ion torrent pgm
tm
序列系统，包含314、316和318系统；ion torrent proton
tm
测序系统，包含proton i(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific,waltham,ma))；以及ion torrent proton
tm
测序系统，包含ion s5和s5xl(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)。在一个实施例中，本文详细描述了用于检测或分析信号的基于isfet的测序系统。在一些实施例中，基本上单克隆核酸群体允许在并入了fet传感器的系统，例如ion torrent测序系统上对至少5个连续核苷酸残基进行准确测序。
65.如本文所使用的，术语“克隆扩增”和其变体是指由此通过扩增多核苷酸产生单克隆或基本上单克隆多核苷酸群体的任何方法。在克隆扩增的一些实施例中，扩增两种或更多种多核苷酸以产生至少两个单克隆或基本上单克隆多核苷酸群体。
66.如本文所使用的，术语“预接种”，在本文中也被称为“接种”，是指涉及将多核苷酸连接到表面或载体的过程。在一些实施例中，预接种涉及将一种或多种核酸连接到表面或载体或连接到表面或载体上的一个或多个位点。预接种的表面或载体用于例如所连接的核酸的进一步操作或分析，例如核酸扩增(包含例如模板过程中的扩增)、测序或其它过程。在一些实施例中，预接种过程生成一个或多个表面或载体，所述表面或载体具有与其连接的一种或多种核酸分子。在一些实施例中，预接种生成一个或多个表面或载体，所述表面或载体具有与其连接的单个多核苷酸。具有与其连接的一种或多种核酸分子的一个或多个表面或载体可以包含在一群、多个或许多两个或更多个表面或载体中，其中一些、少数、大部分或基本上所有的表面或载体具有与其连接的一种或多种核酸分子。在一些实施例中，连接到不同表面或载体或连接到表面或载体上不同位点的一个或多个核酸分子是不同的。在一些实施例中，核酸分子(或基本上单克隆核酸)的多个(multiple)(或多个(aplurality of))基本上相同的拷贝连接到表面或载体上或者多个(或多个)不同的核酸连接到一个或多个在预接种过程中的表面或载体上的位点。在一些实施例中，在预接种过程中，将有限数量的基本上相同的多核苷酸(或基本上单克隆核酸)拷贝连接到表面或载体上以生成单克隆或基本上单克隆核酸群体。在一些实施例中，在不涉及核酸扩增的过程中，表面或载体的预接种包含核酸与表面或载体的连接，例如，通过核酸与和载体连接的互补多核苷酸的杂交。在一些实施例中，表面或载体的预接种包含核酸扩增，例如，核酸扩增(例如，pcr)或等温扩增的一个或多个循环。例如，可以在预接种过程中使用核酸扩增以生成能够连接(例如，通过杂交)到表面或载体的核酸的一个或多个拷贝。通常，生成连接有超过一个核酸或核酸的多个拷贝的表面或载体的预接种包含核酸扩增。在如本文提供的预接种或接种过程中生成的表面或载体被称为“预接种的”或“接种的”载体。
67.如本文所使用的，当指在预接种或模板化方法中连接到表面或载体的核酸(或基本上相同的拷贝或基本上单克隆核酸)的数量时，“有限数量”通常是指被控制用于各种目的的不同的核酸的数量。核酸的有限拷贝数量可以是，例如，足以在表面或载体上的核酸的
任何随后更大规模扩增(例如模板化)中提供拥挤效应以生成更大的基本上单克隆核酸群体，以便通过防止或减少模板在反应位点之间的迁移来防止或减少多克隆群体的形成的数量。此类有限数量的模板拷贝可以是有限的，以便使用相对较短的核酸扩增时间，例如，以防止或减少模板在反应位点之间的迁移，但生成足够数量的模板拷贝以在随后的扩增中提供拥挤效应。
68.如本文所用，术语“模板化”是指生成两个或更多个、或多个或一群基本上相同的多核苷酸或生成可以在核酸分析方法中用作模板的基本上单克隆的核酸群的过程，所述核酸分析方法包含例如对多核苷酸的核酸测序，如合成测序。在模板化过程中生成的多核苷酸通常被称为核酸模板。在一些实施例中，模板化涉及将多核苷酸模板连接到表面或载体上。在一些实施例中，模板化涉及生成两个或更多个、或多个单独的表面或载体或表面或载体上的离散位点，每个具有与其连接的两个或更多个、或多个或一群基本上相同的多核苷酸或基本上单克隆多核苷酸群体。在一些实施例中，模板化涉及生成一个或多个表面或载体或表面或载体上的离散位点，具有与其连接的基本上单克隆多核苷酸群体。在一些实施例中，模板化生成一个或多个表面或载体，所述一个或多个表面或载体具有至少50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或106或更多个与每个模板化表面或载体连接的模板核酸分子的基本上单克隆群体。在一些实施例中，模板化生成表面或载体，其具有介于约50,000与500,000个之间的与每个模板化表面或载体连接的模板核酸分子或例如介于约50,000与400,000个之间的模板核酸分子、介于约50,000与300,000个之间的模板核酸分子、介于约50,000与200,000个之间的模板核酸分子或介于约50,000与100,000个之间的与每个模板化载体连接的模板核酸分子的基本上单克隆群体。在一些实施例中，模板化生成一个或多个模板化表面或载体，其具有介于约100,000与400,000个之间的与每个模板化表面或载体连接的模板核酸分子、介于约100,000与300,000个之间的模板核酸分子、介于约100,000与200,000个之间的模板核酸分子或介于约150,000与300,000个之间的与每个模板化载体连接的模板核酸分子的基本上单克隆群体。在一些实施例中，模板从一个或多个预接种或接种的表面或载体开始进行。在此类实施例中，模板化可以生成一个或多个模板化表面或载体，其包含至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少1000倍、至少2500倍、至少5000倍、至少10,000倍、至少25,000倍、至少50,000倍、至少100,000倍、至少250,000倍、至少5000,000倍或至少106倍或更多的存在于预接种表面或载体上模板化表面或载体上的模板核酸分子。在一些实施例中，预接种载体上仅存在约1个或仅1个核酸分子。在一些实施例中，至少50,000、75,000或100,000个基本上单克隆模板核酸分子或介于约25,000与1,000,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子存在于预接种的表面或载体上，例如介于约25,000与500,000个之间、介于约25,000与250,000个之间、介于约25,000与125,000个之间或介于约25,000与100,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子存在于预接种的表面或载体，例如固体表面或载体上。
69.在一些实施例中，本文所提供的方法、以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒包含载体，例如固体载体或半固体载体，以约束、富集、掩蔽、分离、定位、扩
增或转移可用于分析方法中的核酸。固体表面或载体可以包含聚合物、玻璃或金属材料。固体载体的实例包含膜、平面表面、微量滴定板、珠粒、过滤器、测试条、滑块、盖玻片和管。固体表面或载体意指在其上合成、连接、接合或以其它方式固定寡聚物的任何固相材料。载体可任选地包含“树脂”、“相”、“表面”和「载体」。载体可包含例如有机聚合物，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物。载体也可是无机的，如玻璃、二氧化硅、受控孔玻璃(controlled-pore-glass；cpg)或反相二氧化硅。载体的构形可呈例如珠粒、球体、颗粒、细粒、凝胶或表面形式。例如，表面可以是平面的、基本上平面的或非平面的以及凹、凸或其任何组合。载体可以是多孔、半多孔或无孔的，且可具有溶胀或非溶胀特征。载体可塑形成包含一个或多个孔、凹陷或其它容器(container)、容器(vessel)、特征或位置。可以将一种或多种载体配置于阵列中的不同位置。载体任选地是可寻址(例如用于机械递送试剂)，或通过检测手段，包含利用激光照射扫描和共焦或偏光聚焦来寻址。可以将载体(例如珠粒)放置在另一载体内或上(例如第二载体的孔内)。珠粒材料的实例包含但不限于凝胶、水凝胶或丙烯酰胺聚合物。在一些实施例中，载体是离子球形颗粒(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)。固体载体的实例包含但不限于“微粒”、“珠粒”、“微珠粒”(任选地但不一定是球形)球体、过滤器、流通池、孔、槽、通道储存器、凝胶或毛细管的内壁。在一些实施例中，表面包含纹理(例如，蚀刻、形成空洞、孔、三维支架或凸块)。载体的大小包含但不限于载体的最小横截面长度(例如，直径)为50微米或更小、10微米或更小、3微米或更小、大约1微米或更小、大约0.5微米或更小，例如大约0.1、0.2、0.3或0.4微米或更小(例如小于1纳米，约1-10纳米、约10-100纳米或约100-500纳米)。还包含在表面或固体载体中的是磁性或顺磁性珠粒(例如，磁性或顺磁性纳米颗粒或微粒)。例如，顺磁性微粒包含与抗生蛋白链菌素连接的顺磁性珠粒(例如，来自加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(invitrogen,carlsbad,ca)的dynabeads
tm m-270)。颗粒可以具有铁芯，或可以是水凝胶或琼脂糖(例如，sepharose
tm
)。微粒(例如dynabead，dynal，挪威奥斯陆)可由各种无机或有机材料制成，所述无机或有机材料包含但不限于玻璃(例如受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化钛、乳胶、聚苯乙烯等。磁化可促进在扩增之后微粒连接的试剂(例如多核苷酸或连接酶)聚集和浓缩，且也可促进另外步骤(例如洗涤、试剂去除等)。珠粒表面可以被功能化以连接一个或多个、或多个或一群引物。在一些实施例中，珠粒是可以放入反应室中的任何大小。例如，一个珠粒可以放入反应室中。在一些实施例中，多于一个珠粒放入反应室中。在一些实施例中，本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒包含具有与其连接的一个、两个或更多个、多个或一群寡核苷酸(例如，引物)的载体或表面。载体或表面可涂覆有用于连接核酸分子(例如第一引物或第二引物)的丙烯酰胺、羧酸或胺化合物。例如，可以将氨基修饰的核酸分子(例如引物)与涂覆有羧酸的载体连接。可将引物与涂覆在表面上的丙烯酰胺化合物连接。颗粒可涂覆有抗生物素蛋白样化合物(例如抗生蛋白链菌素)以结合生物素标记的核酸。在一些实施例中，与载体或表面连接的寡核苷酸基本上相同或包含在所有寡核苷酸中基本上相同的引物序列。在一些实施例中，两个或更多个不同的寡核苷酸与载体或表面连接。在一些实施例中，表面已连接第一引物群体，群体中的第一引物共享共有第一引物序列。在一些实施例中，表面已连接第一引物群体和第二引物群体，群体中的第一引物共享共有第一引物序列，且第二引物群体中的第二引物共享共有第二引物序列。在一些实施
例中，已在表面上固定有第一引物群体。在其它实施例中，已在表面上固定有第一引物群体和第二引物群体。
70.概述
71.在图1中，含有流体回路102的系统100通过入口连接到至少两个试剂储存器(104，106，108，110或112)、连接到废液储存器120，并且通过将流体节点130与生物传感器134的入口138连接以实现流体连通的流体通路132连接到生物传感器134。来自储存器(104，106，108，110或112)的试剂可以通过多种方法，包含压力、如注射器泵等泵、重力供给等驱动到流体回路102，并且通过对阀114的控制进行选择。来自流体回路102的试剂可以通过从控制系统118接收信号的阀114而被驱动到废液容器120。来自流体回路102的试剂也可以通过生物传感器134而被驱动到废液容器136。控制系统118包含用于阀114的控制器，所述控制器生成用于通过电连接件116断开和闭合的信号。
72.控制系统118还包含用于系统的其它组件的控制器，如通过电连接件122连接到控制器系统的洗涤溶液阀124和参考电极128。控制系统118还可以包含用于生物传感器134的控制和数据采集功能。在一种操作模式中，流体回路102在控制系统118的经编程控制下，将一系列所选试剂1、2、3、4或5递送到生物传感器134，使得在所选试剂流之间，流体回路102得到灌注和洗涤，并且生物传感器134得到洗涤。进入生物传感器134的流体通过出口140离开并且通过对夹紧阀调节器144的控制沉积在废液容器136中。阀144与生物传感器134的传感器流体输出140流体连通。
73.包含对由第一入口和第二入口形成的孔进行限定并且暴露传感器垫的介电层的装置尤其适用于检测化学反应和副产物，例如检测响应于核苷酸并入的氢离子的释放，用于遗传测序等其它应用。在特定实施例中，测序系统包含其中设置有传感阵列的流通池，包含与传感阵列电子连通的通信电路，并且包含与流通池流体连通的容器和流体控制器。在一实例中，图2示出流通池200的扩大的横截面图并且示出了流动室206的一部分。试剂流208流过孔阵列202的表面，其中试剂流208流过孔阵列202的孔的开口端。孔阵列202和传感器阵列205一起可形成形成流通池200的下壁(或底板)的集成单元。参考电极204可以流动地联接到流动室206。进一步地，流通池盖230包封流动室206以将试剂流208容纳在限定区域内。
74.图3展示了如图2的210处所示的孔301和传感器314的扩展视图。孔的体积、形状、纵横比(如基底宽度与孔深度之比)和其它尺寸特征可基于所发生的反应的性质以及所采用的试剂、副产物或标记技术(如果有的话)来选择。传感器314可以是化学场效应晶体管(chemfet)，更具体来说离子敏感fet(isfet)，其具有浮动栅极318，所述浮动栅极具有任选地通过材料层316与孔内部分离的传感器板320。传感器314可响应于与传感器板320相对的材料层316上存在的电荷324的量(并且生成与所述量相关的输出信号)。材料层316可为陶瓷层，尤其例如锆、铪、钽、铝或钛的氧化物，或钛的氮化物。或者，材料层316可由例如钛、钨、金、银、铂、铝、铜或其组合等金属形成。在一实例中，材料层316的厚度可在5nm到100nm范围内，如10nm到70nm范围内，15nm到65nm范围内或甚至20nm到50nm范围内。
75.尽管材料层316被示出为延伸超过所示出的fet组件的界限，但材料层316可沿孔301的底部延伸以及任选地沿孔301的壁延伸。传感器314可响应于与传感器板320相对的材料层316上存在的电荷324的量(并且生成与所述量相关的输出信号)。电荷324的改变可引
起chemfet的源极321与漏极322之间的电流改变。进而，chemfet可以直接使用以提供基于电流的输出信号，或间接与额外的电路系统一起使用以提供基于电压的输出信号。反应物、洗涤溶液和其它试剂可通过扩散机构340进入和离开孔。
76.孔301可由壁结构界定，所述壁结构可由一个或多个材料层形成。在一实例中，壁结构可具有从孔的下表面延伸到上表面，0.01微米到10微米范围，例如0.05微米到10微米范围、0.1微米到10微米范围、0.3微米到10微米范围或0.5微米到6微米范围内的厚度。特别地，厚度可以在0.01微米至1微米的范围内，诸如0.05微米至0.5微米的范围内，或0.05微米至0.3微米的范围内。阵列202的孔301的特征直径可以不大于5微米，如不大于3.5微米、不大于2.0微米、不大于1.6微米、不大于1.0微米、不大于0.8微米或甚至不大于0.6微米，所述特征直径定义为4乘以横截面积(a)除以π的平方根(例如，sqrt(4*a/π))。在一实例中，孔301可具有至少0.01微米的特征直径。在另一实例中，孔301可界定0.05fl到10pl范围内的体积，例如0.05fl到1pl范围、0.05fl到100fl范围、0.05fl到10fl范围或甚至0.1fl到5fl范围内的体积。
77.在一实施例中，在孔301中进行的反应可以是用来标识或确定所关注的分析物的特性或性质的分析反应。这些反应可以直接或间接生成影响邻近传感器板320的电荷量的副产物。如果此类副产物以少量产生或迅速衰减或与其它成分反应，那么可以同时在孔301中分析相同分析物的多个拷贝，以便增加生成的输出信号。在实施例中，分析物的多个拷贝可以在沉积到孔301中之前或之后连接到固相载体312上。固相载体312可以是包括凝胶或类似物的微粒、纳米颗粒、珠粒、固体或多孔。为了简单和易于解释，固相载体312在本文中也称为颗粒或珠粒。对于核酸分析物，可以通过滚环扩增(rca)、指数rca或类似技术制备多个连接的拷贝，以产生扩增子而不需要固体载体。
78.特别地，诸如珠粒载体的固相载体可以包含多核苷酸的拷贝。在图4所展示的特定实例中，聚合物颗粒在测序技术期间可用作多核苷酸的载体。例如，此类亲水性颗粒可固定用于使用荧光测序技术测序的多核苷酸。在另一个实例中，亲水性颗粒可固定用于使用离子传感技术测序的多核苷酸的多个拷贝。可替代地，上文所描述的处理可提高聚合物基质与传感器阵列表面的粘合。聚合物基质可以捕获分析物，诸如用于测序的多核苷酸。
79.珠粒载体可包括有机聚合物，诸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物。载体也可是无机的，如玻璃、二氧化硅、受控孔玻璃(cpg)或反相二氧化硅。载体的构型可以是珠粒、球、颗粒、细粒、凝胶或表面形式。载体可以是多孔的或非多孔的，并且可以具有溶胀或非溶胀特征。在一些实施例中，载体是离子球体颗粒。在标题为“亲水性聚合物颗粒及其制备和使用方法”的us 9,243,085和标题为“由羧基官能丙烯酰胺形成的聚合物基板”的us 9,868,826中公开了珠粒载体的实例，其各自通过引用并入本文。
80.在一些实施例中，固体载体是“微粒”、“珠粒”、“微珠粒”等，(形状任选地但未必是球形)，其具有50微米或更小的最小横截面长度(例如直径)，优选地10微米或更小、3微米或更小、大致1微米或更小、大致0.5微米或更小，例如大致0.1、0.2、0.3或0.4微米或更小(例如小于1纳米、约1-10纳米、约10-100纳米或约100-500纳米)。在实例中，载体为至少0.1微米。微粒或珠粒载体可由多种无机或有机材料制成，所述无机或有机材料包含但不限于玻璃(例如受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、
二氧化钛、胶乳、聚苯乙烯等。磁化可以促进扩增后微粒连接的试剂(例如多核苷酸或连接酶)的收集和浓缩，并且还可以促进附加的步骤(例如洗涤、试剂去除等)。在某些实施例中，使用具有不同形状大小和/或颜色的微粒群体。微粒可以任选地例如用量子点编码，使得每个微粒或微粒组可以被单独地或唯一地识别。
81.磁性珠粒(例如，来自dynal、oslo、norway的dynabeads)可具有1微米至100微米范围内的大小，所述范围例如2微米至100微米。磁性珠粒可以由无机或有机材料形成，包含但不限于玻璃(例如受控孔玻璃)、二氧化硅、氧化锆、交联聚苯乙烯、聚苯乙烯或其组合。
82.在一些实施例中，珠粒载体被官能化以连接第一引物群体。在一些实施例中，珠粒是可以放入反应室中的任何大小。例如，一个珠粒可以放入反应室中。在一些实施例中，多于一个珠粒放入反应室中。在一些实施例中，珠粒的最小横截面长度(例如，直径)是约50微米或更小、或约10微米或更小、或约3微米或更小、大致1微米或更小、大致0.5微米或更小，例如大致0.1、0.2、0.3或0.4微米或更小(例如小于1纳米、约1-10纳米、约10-100纳米或约100-500纳米)。
83.一般来说，可以将珠粒载体处理成包含生物分子，包含核苷、核苷酸、核酸(寡核苷酸和多核苷酸)、多肽、糖、多糖、脂质或其衍生物或类似物。例如，聚合物颗粒可以结合或连接到生物分子上。生物分子的末端或任何内部部分可与聚合物颗粒结合或连接。使用连接化学方法，聚合物颗粒可与生物分子结合或连接。连接化学方法包含共价或非共价键，包含离子键、氢键、亲和力键、偶极-偶极键、范德华键(van der waals bond)和疏水性键。连接化学方法包含结合配偶体之间的亲和力，例如以下之间的亲和力：抗生物素蛋白部分与生物素部分；抗原表位与抗体或其免疫反应性片段；抗体与半抗原；地高辛部分(digoxigen moiety)与抗地高辛抗体；荧光素部分与抗荧光素抗体；操纵子与抑制子；核酸酶与核苷酸；凝集素与多醣；类固醇与类固醇结合蛋白；活性化合物与活性化合物受体；激素与激素受体；酶与基板；免疫球蛋白与蛋白a；或寡核苷酸或多核苷酸与其对应互补体。
84.如图4所展示的，可以将多个珠粒载体404以及多个多核苷酸402(靶多核苷酸或模板多核苷酸)置于溶液中。可以将多个珠粒载体404活化或以其它方式制备以与多核苷酸402结合。例如，珠粒载体404可以包含与多个多核苷酸402中的一多核苷酸的一部分互补的寡核苷酸(捕获引物)。在另一个实例中，使用技术，如生物素-抗生蛋白链菌素结合，珠粒载体404可以被修饰具有靶多核苷酸402。
85.在一些实施例中，模板核酸分子(模板多核苷酸或靶多核苷酸)可以衍生自可来自天然或非天然来源的样品。样品中的核酸分子可以是来源于活生物体或细胞。可使用任何核酸分子，例如样品可以包含覆盖来自活生物体或细胞的部分或全部基因组、mrna或mirna的基因组dna。在其它实施例中，模板核酸分子可以是合成的或重组的。在一些实施例中，样品含有具有基本上一致序列或具有不同序列的混合物的核酸分子。通常使用在活细胞内生成且由活细胞生成的核酸分子来进行说明性实施例。此类核酸分子通常是直接从天然来源，如细胞或体液分离，无需任何活体外扩增。因此，样品核酸分子直接用于后续步骤中。在一些实施例中，样品中的核酸分子可以包含具有不同序列的两种或更多种核酸分子。
86.方法任选地可包含在文库制备之前、期间或之后且在预接种反应之前的靶标富集步骤。可例如通过多重核酸扩增或杂交来富集包含靶基因座或所关注区域的靶核酸分子。多种方法可用于进行多重核酸扩增以生成诸如多重pcr的扩增子，并且所述多种方法可用
于实施例中。在将模板核酸分子加入到预接种反应混合物中之前，可以在通过任何方法富集后进行通用扩增反应。本发明教导的任一实施例可以包含富集多个至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个靶核酸分子、靶基因座或所关注区域。在任一所公开的实施例中，靶基因座或所关注区域可以为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1,000个核苷酸长，并且包含模板核酸分子的一部分或全部。在其它实施例中，靶基因座或所关注区域的长度可以在约1至10,000个核苷酸之间，例如长度在约2至5,000个核苷酸之间、在约2至3,000个核苷酸之间或在约2至2,000个核苷酸之间。在本发明教导的任一个实施例中，多重核酸扩增可以包含生成至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个各靶核酸分子、靶基因座或所关注区域的拷贝。
87.在一些实施例中，在文库制备和任选的富集步骤之后，可以将模板核酸分子文库模板化到一个或多个载体上。一个或多个载体可以在两个反应中模板化，即生成预接种固体载体的接种反应和使用一个或多个预接种载体进一步扩增连接的模板核酸分子的模板化反应。预接种反应通常是扩增反应，并且可使用各种方法进行。例如，预接种反应可以在rpa反应、模板步移反应或pcr中进行。在rpa反应中，在引物和核苷酸存在下，使用重组酶、聚合酶和任选地重组酶辅助蛋白来扩增模板核酸分子。重组酶和任选地重组酶辅助蛋白可解离至少一部分的双链模板核酸分子，以允许引物杂交，随后聚合酶可结合以启动复制。在一些实施例中，重组酶辅助蛋白可以是防止解离的模板核酸分子再杂交的单链结合蛋白(single-stranded binding protein；ssb)。通常，rpa反应可在等温温度下进行。在模板步移反应中，在允许至少一部分的双链模板核酸分子解离使得引物可杂交和聚合酶可随后结合以启动复制的反应条件中，在引物和核苷酸存在下，使用聚合酶来扩增模板核酸分子。在pcr中，通过热循环使双链模板核酸分子解离。冷却后，引物与互补序列结合并可以用于聚合酶的复制。在本发明教导的任一个方面中，可以在预接种反应混合物中进行预接种反应，所述预接种反应混合物是由扩增模板核酸分子所必需的组分形成。在任何公开的方面中，预接种反应混合物可以包含以下的一些或全部：模板核酸分子群体、聚合酶、具有所连接的第一引物群体的一种或多种固体载体、核苷酸以及诸如二价阳离子的辅因子。在一些实施例中，预接种反应混合物可以进一步包含第二引物和任选地扩散限制性药剂。在一些实施例中，模板核酸分子群体包括与同第一或第二引物杂交的至少一个衔接子序列接合的模板核酸分子。在一些实施例中，如在乳液rpa或乳液pcr中，反应混合物可以形成乳液。在通过rpa反应进行的预接种反应中，预接种反应混合物可以包含重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。本文中进一步详细论述反应混合物的各种组分。
88.在接种的特定实施例中，使亲水性颗粒和多核苷酸经受聚合酶链式反应(pcr)扩增或重组酶聚合酶扩增(rpa)。在一实例中，颗粒404包含与模板多核苷酸402的一部分互补的捕获引物。模板多核苷酸可以与捕获引物杂交。捕获引物可以延伸以形成包含与其连接的靶多核苷酸的珠粒406。其它珠粒可以保持不与靶核酸连接，且其它模板多核苷酸可自由
浮动于溶液中。
89.在一实例中，包含靶多核苷酸的珠粒载体406可以与磁性珠粒410连接以形成珠粒组装体412。具体地，通过双链多核苷酸连接，将磁性珠粒410与珠粒载体406连接。在一实例中，包含接头部分的另外的探针可以与珠粒载体406上的靶多核苷酸的一部分杂交。接头部分可以与磁性珠粒410上的互补接头部分连接。在另一实例中，用于形成与珠粒406连接的靶核酸的模板多核苷酸可以包含与磁性珠粒410连接的接头部分。在另一实例中，从修饰具有与磁性珠粒410连接的接头的引物，可以生成与和珠粒载体406连接的靶多核苷酸互补的模板多核苷酸。
90.连接于多核苷酸的接头部分和连接于磁性珠粒的接头部分可以彼此互补和连接。在一实例中，接头部分具有亲和力并且可以包含：抗生物素蛋白部分与生物素部分；抗原表位与抗体或其免疫反应性片段；抗体与半抗原；地高辛部分与抗地高辛抗体；荧光素部分与抗荧光素抗体；操纵子与抑制子；核酸酶与核苷酸；凝集素与多醣；类固醇与类固醇结合蛋白；活性化合物与活性化合物受体；激素与激素受体；酶与基板；免疫球蛋白与蛋白a；或寡核苷酸或多核苷酸与其对应互补体。在特定实例中，连接于多核苷酸的接头部分包含生物素，并且与磁性珠粒连接的接头部分包含链霉抗生物素蛋白。
91.珠粒组装体412可以施加在包含孔418的测序装置的基板416之上。在一实例中，可向基板416施加磁场以将珠粒组装体412的磁性珠粒410牵拉向孔418。珠粒载体406进入孔418。例如，磁体可平行于基板416的表面移动，由此使得将珠粒载体406置放于418孔中。
92.可以使珠粒组装体412变性，以去除磁性珠粒410，将珠粒载体406留在孔418中。例如，可使用热循环或离子性溶液使珠粒组装体412的杂交的双链dna变性，以释放磁性珠粒410和具有与磁性珠粒410连接的接头部分的模板多核苷酸。例如，可以用低离子含量水溶液如去离子水处理双链dna，以使链变性和分离。在实例中，泡沫洗涤可以用于移除磁性珠粒。
93.任选地，可以扩增靶多核苷酸406(在本文称为模板化)，同时在孔418中，提供具有靶多核苷酸的多个拷贝的珠粒载体414。具体地，珠粒414具有靶多核苷酸的单克隆群体。这种扩增反应可以使用聚合酶链式反应(pcr)扩增、重组聚合酶扩增(rpa)或其组合进行。可替代地，可以在将珠粒载体414沉积在孔中之前进行扩增。
94.在特定实施例中，酶(如聚合酶)存在、结合于或紧密靠近于颗粒或珠粒。在一实例中，聚合酶存在于溶液中或孔中以促进多核苷酸的复制。多种核酸聚合酶可用于本文描述的方法中。在示例实施例中，聚合酶可以包含可催化多核苷酸复制的酶、其片段或亚基。在另一实施例中，聚合酶可以是天然存在的聚合酶、重组聚合酶、突变体聚合酶、变体聚合酶、融合或其它工程聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子，或其类似物、衍生物或片段。酶、溶液、组合物和扩增方法的实例可见于wo2019/094,524，标题为“用于操纵核酸的方法和组合物”，其通过引用整体并入本文。
95.尽管珠粒载体414的多核苷酸示出为在表面上，但多核苷酸可延伸在珠粒载体414内。具有相对于水的低浓度聚合物的水凝胶和亲水性颗粒可以包含珠粒载体414的内部上和整个中的多核苷酸区段，或多核苷酸可存在于孔和其它开口中。具体地，珠粒载体414可以允许用于监测反应的酶、核苷酸、引物和反应产物扩散。每个颗粒的大量多核苷酸产生更好的信号。
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测序仪可以包含待测序的多个模板多核苷酸，各模板设置在阵列中的各个测序反应孔内。阵列的孔各自与至少一个离子传感器联接，所述离子传感器可以检测h+离子的释放或作为核苷酸并入的副产物产生的溶液ph的变化。离子传感器包括联接到离子敏感检测层的场效应晶体管(fet)，其可以感测h+离子的存在或溶液ph的变化。离子传感器可提供指示核苷酸并入的输出信号，其可以表示为电压变化，其大小与各自的孔或反应室中的h+离子浓度相关。不同的核苷酸类型可连续流入反应室，且可以通过聚合酶以模板序列确定的顺序并入延伸引物(或聚合位点)中。每个核苷酸并入可以伴随着反应孔中h+离子的释放，以及局部ph的变化。h+离子的释放可由传感器的fet记录，所述fet产生指示核苷酸并入发生的信号。在特定核苷酸流动期间未并入的核苷酸可能不产生信号。来自fet的信号的振幅也可以与并入到延伸核酸分子中的特定类型的核苷酸的数量相关，从而准许均聚物区被解析。因此，在测序仪运行期间，多个核苷酸流入反应室同时并入，通过多个孔或反应室监测可以允许仪器同时解析许多核酸模板的序列。
105.可以通过各种方法进行接种珠粒载体和磁性珠粒捕获。例如，转到图5的502处，模板多核苷酸(b'-a)可以被与珠粒载体510连接的捕获探针(b)捕获。与模板多核苷酸互补的捕获探针(b)可以延伸。任选地，可以使所得双链多核苷酸变性，由此去除模板核酸(b'-a)且留下与珠粒载体510连接的单链(b-a')。如504处所展示的，可以使修饰具有接头部分(如生物素)的引物(a)与和珠粒载体510连接的核酸(b-a')的部分(a')杂交。任选地，引物(a)可以延伸，以形成互补核酸(a-b')。
106.如图506所展示的，可以将磁性珠粒512引入溶液中。磁性珠粒512可以包含与和引物(a)连接的接头部分互补的接头。例如，与引物(a)连接的接头可以是生物素，且磁性珠粒512可以涂覆有抗生蛋白链菌素。如上文所描述的，磁性珠粒512可以用于清洁溶液和帮助将珠粒载体510和所连接的核酸(b-a')置放到测序装置的孔中。如508所展示的，可以使双链多核苷酸变性，使得从与珠粒载体510连接的核酸(b-a')脱杂交出核酸(b'-a)。因此，将珠粒载体510放置到测序装置的孔中，且所述珠粒载体具有单链靶核酸(b-a')。可替代地，接头修饰的探针(a)可以不延伸，以形成具有一定长度的多核苷酸(b-a')的互补多核苷酸。可使用聚合酶链式反应(pcr)、重组酶聚合酶扩增(rpa)或其它扩增反应来进行延伸反应。
107.仪器
108.图6包含示例性测序仪器系统600的图示，所述示例性测序仪器系统包含与制备台板604、装载站606和测序站608通信的控制器602。制备台板604可以包含移液机器人612，移液机器人可以访问样品614、试剂和溶液616、热循环仪618和其它装置620，如磁力分离器或离心机。在制备台板604处制备的靶序列可以提供给装载站606。例如，制备台板604可以提供包含靶序列的接种基板，所述靶序列被提供给装载站606以装载到传感器装置上。
109.一旦装载，包含靶序列的传感器装置可以利用滑块机构610运输到测序站608。测序站608可以包含流体和电子接口以与传感器装置交互以在合成测序反应期间感测核苷酸的添加。从传感装置收集的数据可以提供给可以执行碱基识别、读段比对和变异识别的测序计算机622。
110.控制器602可以进一步与如监测器、键盘、鼠标、触摸屏或其任何组合等用户接口624以及其它接口通信。进一步地，控制器602可以与可以访问局域网、广域网或全球网络的网络接口通信。网络接口626可以是使用各种标准通信协议的有线接口或无线接口。进一步
地，所述系统可以由电源628供电。
111.图7包含并入三轴移液机器人的示例仪器700的图示。在一实例中，仪器700可以是并入了样品预制备平台的测序仪。例如，仪器700可以包含上部部分102和下部部分104。上部部分可以包含用于接近样品、试剂容器和其它消耗品所放置的台板710的门706。下部部分可以包含用于储存另外的试剂溶液和仪器700的其它部件的柜子。另外，仪器包含如触摸屏显示器708等用户接口。
112.在特定实例中，仪器700可以是测序仪器。在一些实施例中，测序仪器包含顶部区段、显示屏和底部区段。在一些实施例中，顶部区段可以包含测序仪器和消耗品的台板支撑组件，消耗品包含样品制备区段、测序芯片和试剂条管以及载体。在一些实施例中，底部区段可以容纳用于测序的试剂瓶和废物容器。
113.在一些实施例中，安装在仪器的顶部区段的柜子中的一个或多个相机被定向成朝向台板，以便在准备测序运行时监测哪些物品在适当位置。相机可以按时间间隔获取视频或图像。例如，可以以1至4秒的间隔或任何合适的间隔获取图像。在另一实例中，可以以诸如0.5秒至4秒的范围内的间隔来提取视频流的帧。计算机或处理器分析图像以检测用户完成任务。计算机或处理器可以经由显示屏为准备中的下一个任务提供反馈和指令。显示屏可以呈现仪器部件和消耗品的图形表示，以便为用户示出指令。
114.实例仪器搁板710在图8中展示为仪器搁板800。在一个或多个相机的视图中，台板800容纳在仪器的顶部区段中。样品制备台板可以包含被配置成用于容纳试剂条、供应物、测序芯片以及其它消耗品的多个位置。如本文所使用的，消耗品是由仪器使用的部件，它们在使用时定期更换。例如，消耗品包含试剂和溶液条或容器、移液管吸头、微孔阵列和流通池以及相关传感器，以及不是仪器的永久组件的一部分的其它一次性组件。
115.在一实例中，系统800包含移液机器人802，其存取各种试剂条和容器、移液管吸头、微孔阵列和其它消耗品以实施测试。进一步地，系统可以包含用于执行测试的机构804。示例机构804包含机械输送机或滑块和流控系统。
116.在一实例中，台板800包含托盘806或808，以收纳特定配置的溶液或试剂条。在测序仪器的实例中，托盘806可以用于适当配置的条中的文库和模板溶液，并且托盘808可以收纳适当配置的文库和模板试剂。
117.进一步地，仪器可以被配置成在搁板上的特定位置处收纳微孔阵列810和812。例如，样品可以在孔阵列中提供，如微孔阵列812。在另一个实例中，系统可以被配置成以不同的条配置收纳额外的试剂814。在另一个实例中，试剂溶液可以提供在阵列816中。在另外的实例中，容器阵列820可以与如热循环仪等仪器仪表结合提供。进一步地，系统可以包含其它仪器仪表，如离心机，其可以设有如管等消耗品。进一步地，可以提供托盘以收纳移液吸头822。
118.可通过包含一个或多个相机的视觉系统来监测这些位置中的每一个中的消耗品的适当供应。台板可以设有一个或多个相机，以跟踪试剂和其它消耗品的供应和固定。当用于执行一个计划的试剂缺失时或当试剂消耗品以使用状态存在时，可以通过用户界面提示用户。
119.图9包含用于存储较大体积试剂和溶液容器的试剂存储柜子704的图示。例如，柜子存储器704包含用于容纳试剂盒的接口902。在另一实例中，储存器704可以为容器904或
906提供空间。在另外的实例中，储存器704可以包含用于废物容器808的空间。
120.在图10中展示了被配置成装配在槽1002中的如溶液或试剂条等示例消耗品。在一实例中，所述条包含基部1002和联接到所述基部1002的顶部1004。所述顶部1004包含窗口1006，所述窗口使得可以接近孔1010或1012。任选地，顶部1004可以提供窗口1008，所述窗口使得可以接近插入到基部1002的管托座中的管1014。
121.所述顶部可以进一步包含抓握件1016。例如，抓握件1016可以用于当插入试剂容器1000或从分析装置取出所述试剂容器时固持试剂容器1000。进一步地，顶部1004可以定义端部结构1018或1020，所述端部结构被配置成接合仪器上的互补结构并且限制所述条相对于仪器内的位置的朝向。进一步地，如条形码或qr码等代码1022可以存在于顶部1004上。
122.流通初始化
123.在用于在测序装置中制备试剂溶液的示例系统中，初始溶液的来源可以连接到盒内的容器。初始溶液可以包含盐、表面活性剂和防腐剂。
124.盒可以包含储存待用于测序反应的试剂浓缩物的容器。例如，容器可以包含浓缩核苷酸、浓缩修饰核苷酸或核苷酸共混物。在另一实例中，容器可以包含用于测序的辅因子和酶。
125.浓缩核苷酸可以与初始溶液共混，产生待储存在单独的容器中的核苷酸溶液。具体地，试剂储存容器可以是图1所展示的系统的一部分，具有试剂储存容器104、106、108、110或112。
126.来源可以是用于促使流动通过盒的加压系统。可替代地，可以将溶液从来源泵送到盒。在另一实例中，可以在容器中抽真空以将溶液吸取通过盒并且进入容器中。在另一实例中，可以通过抽真空和加压或泵送来促使流动。
127.图11展示了包含盒1102和对接站1104的示例盒系统。盒1102可以装配在对接站1104的主平台1110的对接区域1122中。具体地，对接站1104可以包含如轨道1116等引导件，所述引导件与其它引导件如盒1102上的轨道1118协作，以将盒1102定位在对接站1104中，例如如图12所展示的。盒1102可以进一步包含用于帮助插入盒1102和从对接座1104移除盒1102的手柄1120。
128.对接站1104包含可相对于第一平台1110移动的第二平台1112。例如，平台1112可以通过如马达或螺钉机构等驱动器1124相对于平台1110驱动。具体地，平台1112可以由引导件1126上下引导。
129.平台1112包含流体联接器1114，所述流体联接器可以与顶侧上的管道连接并且与盒1102的容器1106接口。当盒1102插入对接座1104并且由平台1110固定时，驱动器1124可以向下或朝向平台1110驱动平台1112，使得流体联接器1114可以接合盒1102的容器1106。具体地，引导件1126可以确保流体联接器1114相对于盒1102的定位。
130.盒1102包含多个容器1106。例如，盒可以包含至少等于核苷酸的数量的多个容器1106(即，4个)。如所展示的，盒1102具有5个容器并且可以具有多于或少于5个。盒1102可以进一步包含另外的试剂浓缩容器，例如包含核苷酸、其它离子组合物、酶或表面活性剂的组合。
131.盒1102还包含用于在接合对接座1104时引导盒1102的展示为轨道的引导件1118。盒还可以包含用于帮助插入盒和从对接站1104移除盒的手柄1120。进一步地，盒可以包含
定位特征，如凹口，用于确保流体联接器1114正确定位以接合容器1106。
132.如图13所展示的，容器1106包含接收器、夹子和密封件。所述密封件包含中心孔1310和至少一个从中心孔1310径向向外定位的外围孔1308。
133.在横截面中，容器1106可以进一步包含安置在接收器的腔体中的筛板1312。筛板1312可以包含与密封件的中心孔1310对齐的中心孔。腔体也可以与外围开口1308流体连通。可以将流体施加到中心孔1310，其向下流动通过筛板1312并且进入腔体。然后流体流出外孔1308并且进入密封件的通道中。
134.筛板1312可以包含在顶表面处的突起，所述突起被配置成接合密封件的中心孔。具体地，筛板的突起可以在密封件的突起处进入密封件的中心孔。筛板可以是流体可渗透的。例如，筛板1312可以由如多孔陶瓷或金属材料等多孔材料形成。在另一实例中，筛板1312可以由多孔聚合物材料或水可渗透聚合物或纤维材料形成。筛板1312可以包含至少部分地延伸到筛板1312中或完全穿过筛板1312的中心孔。另外，筛板1312在顶部处包含较大的表面积，溶液可以通过所述较大的表面积流动通过所述筛板以从所述筛板中去除浓缩核苷酸溶液或试剂溶液并且进入接收器的腔体。
135.如图13所展示的，当盒1102插入对接座1104并且平台1112定位成接近平台1110时，流体联接器1114接合容器，并且具体地是容器1106的密封件。流体联接器1114的中心管进入密封件的中心孔1310。外同心环1360在通道的径向外侧接合密封件，从而封闭通道。流体联接器1114进一步包含用于接合管1364和1366的开口。在一实例中，开口1364定位于流体联接器1114的轴向中心，并且第二开口1366从流体联接器1114的中心轴线径向向外地安置。
136.在特定实例中，流体可以流入开口1364并且被驱动沿着管1360向下进入密封件的中心孔1310。流体流动通过筛板1312并且进入接收器的腔体。流体可以流动通过开口1308进入由流体联接器1114封闭的通道中。流体可以通过连接到开口1366的孔1368离开通道。可替代地，可以反向流动。
137.芯片和滑块机构
138.在一实例中，生物传感器和流通池是传感器装置的实例。图14和图15展示了示例传感器装置1400，如包含流通池的微芯片。例如，传感器装置1400包含紧固裸片1404的基板1402，所述裸片具有与传感器阵列成流体连通的多个微孔。流通池1406紧固于基板底之上，从而提供裸片1404之上的体积。
139.在一实例中，流通池1406包含一组流体入口1408和一组流体出口1410。具体地，流通池1406可以划分成泳道1412。每个泳道由相应流体入口1408和流体出口1410单独接达。
140.如所展示的，传感器装置1400包含四个泳道1412。可替代地，传感器装置1400可以包含少于四个泳道或多于四个泳道。例如，传感器装置1400可以包含介于1个与10个之间的泳道，如介于2个与8个之间的泳道，或4到6个泳道。泳道1412可以彼此流体隔离。因此，根据运行计划的各方面，可以在单独时间、同时期或同时使用泳道1412。
141.传感器装置1400可以进一步包含引导结构1414，例如，形成为流通池1406的一部分，以接合流体联接器上的互补结构。此类引导结构1414帮助使流体入口1408和流体出口1410与流体联接器上的相关联端口对齐。
142.图16、图17和图18包含示例流体联接器1600的图示。流体联接器1600包含限定了
端口组之间的流体路径的主体1614。进一步地，流体联接器1600可以包含用于接合机械组合件并且帮助相对于机械组合件定位流体联接器1600的连接器部分1612。在另一个实例中，流体联接器1600可以包含翼部1616，所述翼部限定参考孔1610以接合机械组合件的导杆，进一步帮助相对于传感器装置定位流体联接器1600。
143.流体联接器1600的主体1614可以限定与第一组端口1604流体连通的开口1602。开口1602的尺寸可以设计成接收移液管尖端的一端并且允许将流体组合物移取到开口1602中。开口1602与一组端口1604流体连通，所述端口被配置成接合传感器装置1400的入口1408(图14)。流体联接器1600可以进一步限定第二组端口1606，所述第二组端口可以接合传感器装置1400的出口1410(图14)并且提供与其的流体连通。
144.如图18所展示的，系统可以进一步包含与第二组端口1606流体连通的第三组端口1818。第三组端口1818可以与机械组合件的流体歧管接合，如图26和图27中所展示的流体歧管2540。任选地，流体联接器1600可以包含第四组端口1820，所述第四组端口可以与流体歧管连接或者可以根据机械组合件的配置被封闭。
145.端口1604、1606、1818或1820可以由弹性材料形成，如橡胶或弹性体聚合物。在一实例中，端口可以使用弹性材料形成为包覆模制。
146.返回到图16，流体联接器1600的主体1614可以进一步包含与传感器装置1400的引导特征1414(图14)互补的引导特征1608。
147.如图19和图20所展示的，流体联接器1600可以接合传感器装置1400。流体联接器1600的主体1614可以与传感器装置1400的基板1402对齐，以允许流体联接器1600的第一组端口1604与传感器装置1400的入口1408流体连通。进一步地，第二组端口1606可以与传感器装置1400的出口1410流体连通。例如，引导结构1414和1608可以接合以将端口与入口和出口对齐。任选地，第三组端口1818可以与歧管流体连通。在另外的实例中，任选地与第二组端口1608流体连通的一组流体端口1820可以与流体歧管流体连通。
148.因此，流体组合物可以被移取到与第一组端口1604流体连通的开口1602中，所述开口通过流通池1406的入口1408向传感器装置1400的流通池1406提供流体组合物。在处理之后，流体组合物的剩余部分可以通过第二组端口1606和第三组端口1818从传感器装置1400的出口1410吸取到流体歧管中。
149.图21和图22包含用于在系统内的各个站之间移动传感器装置的示例机械系统2100的图示。例如，滑块机构2102可以沿着轨道2104移动以在站2106、2108与2110之间引导传感器装置(例如，图14中的传感器装置1400)。例如，传感器装置可以在站2106处插入到滑块机构2102中。在一实例中，传感器装置可以以竖直朝向插入，其中入口和出口指向一侧而不是向上。传感器2112可以检测传感器装置的存在并且当传感器装置存在时允许滑块机构2102移动。例如，滑块机构2102可以将传感器装置移动到站2108，在所述站处，可以如通过上文关于图4描述的磁性装载方法将样品装在到传感器装置中。具体地，可以将流体联接器插入到由机械组合件2114提供的空间2116中，所述空间可以将流体联接器压靠在传感器装置上并且使流体联接器与歧管接合。当磁性装载技术完成时，机械组合件2114可以与流体联接器分离，并且滑块2102可以将传感器装置移动到随后的站2110，如针对测序提供试剂和其它条件的流体站。
150.如图22所展示的，如螺钉驱动器等驱动器2218可以包含螺钉2220，所述螺钉接合
离合器2222以移动滑块2102，并且因此移动站2106、2108与2110之间的传感器装置。
151.如图23所展示的，滑块2102可以定位在台2106处，其中止动柱2332在特征2354处接合滑块2102。进一步地，滑块2102可以从站2106向前移动到站2108，在所述站处可以接合螺线管止动柱2334，并且滑块向后移动(如图所展示的左侧)以使螺线管止动件2334与特征2354接合。另外，滑块2102可以沿着轨道2104移动以接合图24所示的前进止动件2436，从而将滑块和传感器托座2324与站2110对齐。为了使滑块2102返回站2106，螺线管止动柱2334可以脱离接合以允许滑块2102通过。
152.当传感器装置在站2106处插入托座2324中时，传感器2112可以通过开口2356感测托座2324中传感器装置的存在。例如，传感器装置2112可以是光学传感器，所述光学传感器通过开口2356光学地检测托座2324内传感器装置的存在。
153.离合器2222可以用于提供抵靠止动件2324或2334的向后力(展示为向左)和抵靠止动件2436的向前力(展示为向右)。例如，离合器系统2222包含螺母2326以接合螺钉驱动机构2218的螺钉2220。螺母2326与具有中心孔的联接器2328接合，所述中心孔允许螺母2220穿过联接器2328。联接器2328使用销和弹簧系统2350与螺母2326连接。销可移动地连接到螺母，使得当销和弹簧系统2350的弹簧压缩时，销移动通过螺母2326。
154.联接器2328还使用销和弹簧系统2352连接到连接器板2330。当销和弹簧系统2352的弹簧被压缩时，销和弹簧系统2352的销可以被配置成移动通过连接器板2330。可替代地或另外，销和弹簧系统2352的销可以被配置成移动通过联接器2328。
155.连接器板2330联接到滑块2102，所述滑块响应于螺钉2220的旋转来回移动。当滑块2102抵靠止动件2332或2334向后移动(如图23中左侧所展示)时，销和弹簧系统2352的弹簧可以压缩，并且销可以移动通过连接器板2330或联接器2328。因此，螺钉2220的旋转提供了向后抵靠杆2332或2334的已知力，从而提供了传感器装置在托座2324内的精确定位。在另外的实例中，随着滑块2102向前移动以接合止动件2436，滑块2102停止移动。螺钉2220的另外旋转使螺母进一步向前移动(如图23右侧所展示)。销和弹簧系统2350的弹簧压缩，并且销和弹簧系统2350的销移动通过螺母2326，从而提供滑块2102抵靠前进止动件2436的已知力。此力和定位提供了传感器装置托座2324和传感器装置在站2110处的精确定位。
156.图25包含用于提供传感器装置与流体联接器之间的流体联接的示例机械组合件2114的图示。当滑块就位时，为传感器装置提供空间2538。进一步地，为流体联接器提供空间2116。当被机械组合件2114接合时，流体联接器被按压与传感器装置和歧管2540流体连通。利用例如带有螺钉2544的螺钉驱动器的驱动机构2542可以利用具有螺母2546并且通过销2564和弹簧2566联接到框架2548的离合器系统向前(在图25中展示为向上)和向后(在图25中展示为向下)移动机械组合件2114的框架2548。销2564可以与螺母2546可移动地联接，使得销2564的头部2578抵靠螺母2546定位，直到歧管2540被压靠在流体联接器上。螺母2546的另外向前移动导致销2564移动通过螺母2546，从而允许弹簧2566压缩。
157.框架组件2548可以响应于螺母2546的移动一起前后移动。杠杆2550在紧固件2552处可旋转地联接到框架2548。当组合件处于向后位置时，与杠杆2550连接的调节螺钉2586接合止动件2584，使杠杆2550的相对侧向后(如所展示的向下)枢转。随着螺母2546向前移动，调节螺钉2586逐渐从止动件2584中脱离接合，并且杠杆2550的相对侧例如在弹簧2582的推动下向前枢转。杠杆2550的枢转使导板2556相对于同样向前移动(如所展示的向上)的
框架2548向前移动。导板2556连接到导杆2558和2560，导杆与导板2556一起向前移动以接合流体联接器的参考孔。导杆2560可以进一步由接合歧管2540的一部分的引导件2562引导。随着导杆2560向前移动，它可以与传感器2576脱离接合，表明导杆2560正在接合流体联接器的参考孔。
158.当歧管2540以及导杆2558和2560接合流体联接器时，螺母2546可以继续向前，而框架2546保持静止。销2564可以移动通过螺母2546并且弹簧2566压缩，提供抵靠流体联接器并且抵靠与流体联接器流体连通的传感器装置的已知力。此力在传感器装置与流体联接器之间提供了期望的无泄漏流体联接。
159.包含传感器2572和2574的电路板2570可以连接到可移动框架2548，并且可以与框架2548一起移动。旗形件2568可以连接到螺母2546。从向后位置到歧管2540和框架2548与流体联接器连接的第二位置，旗形件2568的位置相对于位置传感器2572保持恒定。一旦歧管2540抵靠流体联接器和传感器装置定位，螺母2546就相对于框架2548向前移动。因此，旗形件2568朝着传感器2572向前移动。当传感器2572检测到旗形件2568时，可以停止螺母2546的向前驱动。因此，实现了对弹簧2566的已知压缩，并且对框架2548、歧管2540和流体联接器施加了已知力。
160.随着螺母2546从向前位置向后移动，旗形件2568从传感器2572脱离接合，直到其头部2578处的销2564抵靠螺母2546固定。随着螺母2546继续向后移动，框架2548和歧管2540与传感器电路板2570一起被向后拉。可调节螺钉2586接合止动件2584，将导杆2558和2560从流体联接器的参考孔中抽出。随着导杆从流体联接器中抽出，参考杆2560接合传感器2576，指示它已经从流体联接器的参考孔中抽出。传感器2574通过与框架2548连接的传感器电路板2570继续向后移动，直到传感器2574接合指示螺母2546处于最向后位置的旗形件2580。流体联接器与机械组合件2114脱离接合并且可以被移除。进一步地，滑块机构2102可以将传感器装置移动到下一站2110。
161.图26和图27包含与机械组合件2114一起使用的示例歧管2540的图示。歧管2540可以在前表面处包含槽2642以接收流体联接器。槽2642连同支撑结构2644和2646可以设置流体联接器的竖直位置，如图16中所展示的流体联接器1600。流体联接器1600的连接器部分1612可以在歧管2540之上朝着歧管的后表面延伸。歧管2540可以进一步包含与流体联接器1600的参考孔1610对齐的参考孔2650和2648。参考孔2650的大小可以设计成接收导杆2558。参考孔2648的大小可以设计成接收导杆2560和任选地接收引导件2562。
162.具体地，歧管2540包含用于接合流体联接器1600的第三端口1818(图18中示出)的一组流体开口2652。所述一组开口2652与安置在流体歧管2540的后表面上的一组端口2654流体连通。此类端口2654可以连接到真空，以允许流体通过端口2654、开口2652、流体联接器1600的第三组端口1818和流体联接器1600的第二组端口1606被吸取。任选地，可以提供另外的一组流体开口和流动端口以与流体联接器1600的第四组流体端口1820连接。
163.图28包含展示了用于流体接合传感器装置的方法2800的流程框图。例如，如框2802处所展示的，当滑块处于第一位置时，可以将传感器装置插入滑块的固持器或托座中。任选地，在允许滑块移动到第二位置之前，检测器可以确定传感器装置是否正确地定位在固持器或托座内。
164.如框2804处所展示的，传感器装置和滑块可以移动到第二位置。在示例系统中，第
二位置可以表示样品被装载到传感器装置上的位置。例如，可以将流体联接器压靠在传感器装置的流通池上，如框2806处所展示的。流体联接器可以包含开口，所述开口允许将流体组合物吸移到开口中并且通过流体联接器的与传感器装置的流通池的入口接合的端口。
165.例如，移液管可以吸取流体组合物的等分试样，如框2808处所展示的。等分试样可以施加到流体联接器的开口，如框2810处所展示的。等分试样可以穿过流体联接器的开口、第一组端口和传感器装置的入口并且进入传感器装置的流通池。
166.在一实例中，流体组合物可以在流通池内进行处理，如框2812处所展示的。例如，可以应用磁性装载技术将样品装载到传感器装置的孔内。
167.如框2814处所展示的，可以从传感器装置的流通池中吸取流体组合物的剩余部分。例如，邻接到压靠流体联接器并且与流通池的出口流体连通的歧管的真空可以从流通池吸取流体组合物的剩余部分。可以重复移取流体组合物的等分试样、施加等分试样、处理流体组合物和吸取流体组合物的剩余部分的过程，例如，以施加另外的样品或清洗流通池。
168.一旦装载过程完成，传感器装置可以从机械组合件中释放，如框2816所展示的。例如，可以将机械组合件拉到向后位置，释放传感器装置和流体联接器，并且允许传感器装置移动到随后的站。
169.滑块和传感器装置可以移动到第三位置，如框2818所展示的。例如，传感器装置可以移动到系统的测序部分。
170.磁性装载
171.图29是示例磁性装置系统的示意图。具体地，图29示出了支撑芯片表面2910和流通池2920的基板2900。磁性包2950布置在基板2900附近的托盘2960中。
172.磁性包2950示出为具有两个磁体2952和2954。虽然图29的实施例示出了磁体2952和2954，但所公开的原理不限于此，并且可以包含比图29中所示更多或更少的磁体。磁体2952、2954可以用惰性材料2953分开。惰性材料2953可以充当非导电绝缘体。在某些实施例中，磁体2952和2954可以布置成使得磁体2952的北极直接与磁体2954的南极相对。通过这种布置，基板2900同时暴露于磁体2952和2954的北极和南极。在其它实施例中，磁体2952和2954可以布置成使得基板2900仅暴露于磁体的北极或南极。
173.基板2900可以包括被配置成接收微芯片2910(可互换地，芯片或传感器装置)的任何材料。微芯片2910可以包括具有多个托座的顶表面，如微孔、腔体、凹陷区、凹坑或其它托座，被配置成接收一个或多个测序珠粒。在一个实施例中，芯片2900可以包括被配置为接收测序珠粒的微孔。一个此类示例微芯片由ion作为ion 541 chip
tm
提供。参考图14讨论了示例微芯片。
174.流通池2920定位于微芯片2910的上表面之上，以使流体能够与微芯片的表面流体连通。流体可以通过形成在芯片2910顶部上的端口2922和2924连通。磁性珠粒和测序珠粒(未示出)可以与一种或多种试剂一起通过端口2922和2924连通到微芯片2910的表面。一旦测序珠粒被装载到微芯片2910的表面上，洗涤试剂可以通过端口2922和2924连通以去除不需要的颗粒或试剂。
175.托盘2960(和磁性包2950)可以相对于基板2900移动，如箭头2962所指示的。虽然基板的移动和朝向被展示为水平的，但在替代性实例中，基板可以竖直朝向，并且移动可以是向上和向下的。移动可以由致动器2970与指定托盘2960的移动速度和方向的可编程处理
器或控制器2980组合来布置。致动器2970可以包含例如由控制器2980控制的马达或螺线管，所述控制器具有处理器电路系统和存储器电路系统中的一个或多个。控制器2980可以是可编程控制器。在本公开的一个实施例中，控制器2980可以被配置成从辅助源接收输入信息2982以指示托盘2962何时应该相对于基板2900(其可以是静止的)移动。信息2982还可以包含与托盘2960的移动速度相关的数据，作为装载到芯片上的颗粒类型的函数。此类数据可以存储在与控制器2980相关联的一个或多个存储器电路系统中。
176.图30示意性地示出了含有磁性珠粒的溶液相对于磁性包以第一速度进行的移动。在图30中，微芯片3010的上表面暴露于试剂(或溶液)3050。试剂3050可以包含磁性珠粒以及测序珠粒。磁性珠粒可以包括具有亲和力或对磁场有反应性的任何珠粒。在一个实施例中，选择磁性珠粒大小以使其不进入微孔、腔体或形成在微芯片表面上的凹陷处。示例磁性珠粒可以是直径为约1μm到100μm的基本上球形。
177.磁体3052和3054被惰性材料3053分开以形成磁性包。箭头3059示出磁性包3050相对于微芯片3010的移动方向。试剂3050安置在微芯片3010的顶部上。试剂3050可以包括一个或多个联接到测序珠粒的磁性珠粒。试剂3050可以是液体、凝胶或任何具有变性和粘性以在固体表面之上移动的材料。多个磁性珠粒(未示出)可以以使得磁性珠粒可以相对于彼此自由移动或旋转的方式安置在试剂3050中。
178.图31示意性地示出了含有磁性珠粒的溶液相对于磁性包以第二速度进行的移动。图31示意性地示出了相对于图31更快的磁体运动(如箭头3060所示出)。尽管试剂3050的形状示出试剂3050(含有磁性珠粒)的相对较宽的分散，但试剂3056的形状表明更窄且紧密堆积的试剂(含有磁性珠粒)。图30和31还示出，当相对移动缓慢时，试剂/珠粒前缘与滞后磁体的内缘或前缘对齐。当相对运动快时，试剂/珠粒堆落在滞后磁体的前缘后面。
179.图32示意性地示出了含有磁性珠粒的溶液相对于磁性包相反方向的移动。箭头3062示出了磁体移动方向的反转。如图32所示，当磁体切换移动方向时，试剂/珠粒堆保持在相同位置处直到被新滞后磁体(3054)的内边缘拾取。反转磁体移动的方向可能有助于将珠粒装载到微孔中或允许试剂堆多次横向扫描微芯片上的阵列表面。
180.在一实例中，磁体可以在5到50次扫描之间循环(横向和向后)，如5到35次扫描或10到30次扫描。在一实例中，每次扫描需要1分钟到5分钟，如1分钟到3分钟。一旦珠粒载体装载到孔中，可以使珠粒组装体变性并且可以用泡沫洗涤表面以去除磁性珠粒。
181.当在微芯片上实施时，将包含珠粒复合物的悬浮液沉积到微芯片表面之上的流通池中。图33展示了根据本公开的一个实施例的其上装载有磁性珠粒的微芯片。更具体地，图33示出了具有定位于其上的流通池3312的微芯片3302。流通池3312包含用于接收和丢弃试剂的端口3322和3324。流通池3312可以具有超过两个的端口，例如，如图14所展示的。微芯片3302放置在基板3310之上。一个或多个磁体(未示出)放置在基板3310下方。磁体产生磁场，所述磁场导致在微芯片3302的表面上形成一行磁性珠粒3350。磁体的移动导致行3350(即，磁性珠粒)沿着微芯片3302的表面移动。随着磁性珠粒沿着表面移动，联接到试剂中磁性珠粒的测序珠粒进入微芯片3302表面上的孔或腔体。
182.图34示意性地展示了磁性珠粒装置模型。在图34中，微芯片表面3402示出为具有多个微孔3410。流3420尤其含有与磁性珠粒3430连接的测序珠粒3432、3434。如图34所展示的，测序珠粒3432和3434可以具有比磁性珠粒3430更小的直径。微孔3410的大小设计成接
收测序珠粒3432、3434。每个微孔3410可以被配置成接收至少一个测序珠粒3432、3434并且不包含磁性珠粒3430。尽管未示出，但每个微孔3410可以联接到包括一个或多个电极的感测电路系统，以及被配置成检测微孔3410中分析物的存在的电子电路系统。分析物可以联接到测序珠粒或可以由于孔内的一种或多种反应而释放。表面3450示意性地展示了具有输入和输出端口(未示出)的流通池表面。
183.测序珠粒可以具有不同的大小。在一个实施例中，选择测序珠粒3432、3434使得至少一个测序珠粒可以进入微孔。换言之，测序珠粒直径可以选择为小于微孔开口。虽然微孔3410示出为具有锥形侧壁，但要求保护的实施例不限于此，并且微孔可以具有不同的形状和形式而不背离所公开的原理。
184.如所示出的，流3420可以包括多个珠粒。磁性珠粒3430可以包含磁性特性。在某些实施例中，流3420可以包括除了珠粒之外的其它试剂。磁性珠粒3430可以包括由赛默飞世尔科技公司提供的m-270或m-280，珠粒直径为约2.8μm。每个磁性珠粒3430可以具有例如用于与生物素化的核酸、抗体或其它生物素化的配体和靶标联接的链霉抗生物素蛋白。可以使用此类生物素/链霉抗生物素结合将磁性珠粒1530连接到测序珠粒3432、3434。
185.此类装载方法可以在具有水平或竖直配置的硬件中实施。例如，硬件可以固持基板，珠粒水平地沉积在所述基板上。在另一实例中，硬件可以竖直地固持基板，其中基板的平面大致平行于重力。如本文所使用的，竖直是指基板的主表面的平面更接近于平行于重力而不是垂直于重力的朝向。在图35、图36、图37和图38所展示的实例中，磁性装载系统3500包含板3502和沿着板3502引导磁体的磁体固持器3504。在所展示的实例中，板3502固定到竖直结构3514，所述竖直结构固定到水平结构3516。磁体固持器3504可以沿着板3502上下移动磁体，以促进将如测序珠粒等珠粒载体装载到安置在板3502相对侧上的基板的孔中。
186.在特定实例中，驱动机构3506可以促进磁体固持器3504沿着板3502上下移动。例如，驱动机构3506可以旋转螺纹螺钉3518以沿着螺钉3518上下驱动连接器板3510。连接器板3510连接到磁体固持器3504。任选地，连接器板3510可以联接到导板3508。导板3508可以沿轨道3512滑动，为连接器板3510和磁性固持器3504的移动提供稳定性。
187.如图36所展示的，基板固持器3620(例如，图26或图27的歧管)为基板或传感器装置提供空间3622，如具有流通池的微芯片，以插入并且保持抵靠板3502。随着连接到固持器3504的磁体沿着板3502的竖直表面上下移动，连接到溶液中的磁性珠粒的珠粒载体沉积到基板的孔中。在一实例中，基板是具有流通池的测序芯片，溶液安置在流通池中。
188.如图37所展示的，板3502可以任选地包含用于接收加热器3724的凹部。加热器3724可以用于控制板3502和任选地定位于板3502表面附近的基板的温度。可替代地，加热器3724可以用于促进双链核酸的熔解或控制扩增温度。
189.磁性固持器3504可以包含一个或多个磁体。例如，如图38所展示的，磁性固持器3504可以包含磁体3828和磁体3830。磁体3828或3830可以被空气分开。可替代地，磁体可以由顺磁性材料或绝缘材料分开。
190.在一实例中，磁体被配置成使得磁体的不同磁极抵靠板3502定位。例如，磁体3828可以被配置成具有邻近板3502定位的北极，并且磁体3830可以被配置成具有邻近板3502的
南极。可替代地，磁体3828的南极和磁体3830的北极可以邻近板3502定位。在另外的替代方案中，每个磁体的相同磁极可以邻近板3502定位。
191.所述系统可以进一步包含传感器3826，所述传感器检测磁体的位置，例如，下边界。如图38所展示的，当磁体处于其较低位置时，导板3508可以干扰光学传感器3826。可替代地，可以使用其它传感器来确定板和相关联磁体的位置。
192.在将珠粒装载到传感器装置或微芯片的孔中之后，测序珠粒上的多核苷酸可以被扩增以在测序珠粒上形成单克隆多核苷酸群体。可以使用例如基于离子的测序技术对单克隆多核苷酸群体进行测序。
193.多泳道流体
194.图39总体上展示了流体多路复用器块39100的分解视图，所述流体多路复用器块作为集成式下一代测序系统的流控系统的组件可以提供在分析期间使用的各种溶液到多泳道传感器阵列装置的分配。根据本发明教导，本文所公开的流控系统的各个实施例被配置成执行一系列流体操作，以在下一代测序分析过程中将各种溶液依序递送到多泳道传感器阵列装置。示例性流体操作包含洗涤、灌注和通过流体多路复用器块如图39的流体多路复用器块39100进行核苷酸试剂递送。此种流体多路复用器块被配置成向用于在分析期间进行检测的多泳道传感器阵列装置的每个泳道提供独立的流体分配。根据本发明教导，在分析期间可以使用任何数量的泳道或泳道的任何组合，使得在分析期间，可以在运行期间单独地使用任何位置中的一个泳道，可以在运行期间同时使用所有四个泳道，或者可以在运行期间同时使用泳道的任何组合。使用本发明教导的用于在一系列流体操作期间将流体分配到多泳道传感器阵列装置的流体多路复用器块可以避免在分析期间使用的溶液在各个流体隔室中的交叉污染，以及在分析期间提供试剂流体流之间的急剧转变。另外地，本发明教导的流控系统的各个实施例可以为参考电极提供恒定的电解质流体环境，由此针对多泳道传感器阵列装置提供恒定的稳定参考电压。
195.如图39中所描绘的，流体多路复用器块4100包含流体多路复用器单元4200a到4200d以及第一端盖4105a和第二端盖4105b。根据本发明教导，每个流体多路复用器单元具有形成在流体多路复用器单元的主体内的流体多路复用器电路。因此，如图39中所描绘的，流体多路复用器单元4200a到4200d中的每个流体多路复用器单元具有形成在每个流体多路复用器单元的主体内的流体多路复用器电路4215a至4215d。如本文将更详细地公开的，流体多路复用器块100中的每个流体多路复用器单元独立地与多泳道传感器阵列装置的流通池泳道中的每个流通池泳道之一可控制地流体连通。因此，多泳道传感器阵列装置的第一泳道可以流体集成到流体多路复用器单元4200a，而第二泳道可以流体集成到流体多路复用器单元4200b，并且第三泳道可以流体集成到流体多路复用器单元4200c，而第四泳道可以流体地集成到流体多路复用器单元4200d。此外，在分析期间可以使用任何数量的泳道或泳道的任何组合，使得在分析设置期间，最终用户可以选择在运行期间单独地使用的任何位置中的一个泳道、在运行期间同时使用的所有四个泳道或在运行期间同时使用的泳道的任何组合。
196.图40总体上展示了流体多路复用器单元4200的实施例，所述流体多路复用器单元容纳四种输入试剂和五个流体支路中的每个流体支路中的校准溶液，并且具有用于洗涤溶液的分配通道。流体电路4215形成在具有第一表面4201和相对的第二表面4203的基板4205
中。如图40中所描绘的，第一表面4201和相对的第二表面4203基本上彼此平行。流体多路复用器单元4200可以具有第一流体接口侧4202以及相对的第二流体接口侧4204。如图40中所描绘的，第三流体接口侧4206在一侧将第一接口边缘和第二接口边缘连接，而第四流体接口侧4208在相对侧将第一接口边缘和第二接口边缘连接。基板4205可以由如玻璃、陶瓷和塑料等多种材料构成。示例性聚合物材料包含聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚醚酰亚胺和聚酰亚胺。试剂入口端口4210、4216、4222和4228以及校准溶液入口端口4234分别与入口通道4211、4217、4223、4229和4235流体连通。入口通道4211、4217、4223、4229分别与五个流体支路中的每一个的曲线通道4213、4219、4225、4231和4235流体连通。最后，洗涤溶液入口端口4240与洗涤溶液通道4242流体连通。
197.如图40中所描绘的，每个入口通道与每个曲线通道形成三通接头，使得每个曲线通道由两个支路组成。图40中描绘了形成两个支路的此种三通接头，其中入口通道4211三通到曲线通道4213中，从而形成第一支路通道4212和第二支路通道4214。类似地，入口通道4217三通到曲线通道4219中，从而形成第一支路通道4218和第二支路通道4220，而入口通道4223三通到曲线通道4225中，从而形成第一支路通道4224和第二支路通道4226。另外地，入口通道4229三通到曲线通道4231中，从而形成第一支路通道4230和第二支路通道4232。最后，入口通道4235三通到曲线通道4237中，从而形成第一支路通道4236和第二支路通道4238。五个流体支路中的曲线通道4213、4219、4225、4231和4237的第一支路通道4212、4218、4224、4230和4236分别与中心通道4250流体连通。如图40中所描绘的，中心通道4250与传感器接口入口连接器端口4260流体连通，所述传感器接口入口连接器端口与传感器入口端口(未示出)流体连通。另外地，洗涤溶液入口端口4240与洗涤溶液通道4242流体连通，所述洗涤溶液通道也与传感器接口入口连接器端口4260流体连通。传感器接口出口连接器端口4262与传感器出口端口(未示出)以及传感器废物通道4244流体连通。传感器废物通道4244与传感器废物托座(未示出)流体连通，所述传感器废物托座通过传感器废物端口出口4264连接到流体多路复用器单元4200。曲线通道4213、4219、4225、4231和4237的第二支路通道4214、4220、4226、4232和4238中的每个第二支路通道分别与主废物通道4246流体连通，所述主废物通道与通过主废物出口端口4266连接到流体多路复用器单元4200的主废物托座(未示出)流体连通。
198.图41总体上展示了具有多泳道传感器装置的图39的流体多路复用器块4100的流体多路复用器单元4200的流体集成的示意性表示。
199.关于用于在多泳道传感器阵列装置如图41的传感器阵列装置10上执行各种分析的流体递送和控制，流体多路复用器单元4200的流体电路4215可以与传感器阵列装置10的一个流通池泳道流体连通。出于说明的目的，图41中示出了一个流体多路复用器单元与一个流通池泳道流体集成。然而，最终用户可以在分析期间选择任何数量的泳道或泳道的任何组合，因为每个泳道都与流体多路复用器单元如图39的流体多路复用器单元4200a至4200d之一流体集成。作为非限制性实例，第一流通池泳道如图41的传感器阵列装置10的流通池泳道4a可以与第一流体多路复用器如图39的流体多路复用器单元4200a流体集成，而第二流通池泳道如图41的传感器阵列装置10的流通池泳道4b可以流体集成到第二流体多路复用器如图39的流体多路复用器单元4200b。类似地，第三流通池泳道如图41的传感器阵列装置10的流通池泳道4c可以与第三流体多路复用器如图39的流体多路复用器单元4200c
流体集成，而第四流通池泳道如图41的传感器阵列装置10的流通池泳道4d可以流体集成到第四流体多路复用器如图39的流体多路复用器单元4200d。在这方面，本文出于说明性目的对图41所描述的内容总体上公开了每个流体多路复用器单元41200如何与多泳道传感器装置的对应流通池泳道中的每一个流体集成。
200.因此，在分析设置期间，最终用户可以选择在运行期间单独地使用的任何位置中的一个泳道、在运行期间同时使用的所有四个泳道或在运行期间同时使用的泳道的任何组合。如随后将更详细公开的，本发明教导的测序仪的流控系统可以包含提供用于在分析过程中使用的多种溶液的多个溶液容器。例如，各种溶液可以包含用于分析的各种核苷酸试剂、校准溶液、稀释剂(洗涤)溶液和清洁溶液。在分析过程中使用的各种溶液可以通过流通池入口如图41的流通池泳道4a的流通池入口3a与传感器阵列装置10的任何流通池泳道可控制地流体连通。本发明教导的测序仪的流控系统可以包含来自每个溶液容器的试剂流体管线，所述试剂流体管线可以选择性地放置成与流体电路4215的入口通道如入口通道4211、4217、4223、4229、4235和4242流体连通。另外，如图41中所描绘的，在分析过程中使用的各种溶液中的每种溶液的流体流动可以由阀如分别用于试剂流体管线l1至l4中的每个试剂流体管线以及用于校准溶液管线l5和洗涤溶液管线l6的流体管线阀v1至v6来控制。应当注意，除了在运行启动以对被选择在运行期间使用的传感器阵列进行校准之前的校准序列期间之外，校准流体管线阀v5通常处于关闭位置中。因此，校准流体管线阀v5在测序运行期间是关闭的。
201.与在分析过程中使用的各种溶液的可控制流动结合，图41的流体多路复用器单元4200可以执行流体操作，所述流体操作包含例如但不限于向传感器阵列装置10的流通池泳道提供所选试剂递送、对流体多路复用器电路4215以及流通池如传感器阵列装置10的流通池泳道4a进行洗涤和用所选试剂灌注流体多路复用器电路4215。此类流体操作可以提供试剂到流通池如图41的流通池泳道4a的无交叉污染的递送，可以提供试剂流体流之间的急剧转变，以及为在图41中示出与中心通道4250流体连通的参考电极4275提供恒定的电解质流体环境，由此向传感器阵列装置10提供恒定的稳定参考电压。
202.例如，图41的流体多路复用器单元4200可以选择性地提供试剂流体管线l1到l4中的任何试剂流体管线与第一流通池泳道4a的第一流通池入口3a之间的流体连通，由此提供通过传感器阵列装置10的第一流通池泳道4a的选择性的试剂流动。本发明教导的非限制性说明性试剂流体路径是通过试剂递送操作给出的，在所述试剂递送操作中，洗涤溶液流体管线阀v6处于关闭状态，并且试剂流体管线阀v1至v4之一处于打开状态，条件是所选试剂之一与流体多路复用器电路4215流体连通。在此种条件下，所选试剂可以流动通过流体多路复用器电路4215并且然后通过废物通道4246废弃。另外地，所选试剂可以流动通过流体多路复用器电路4215到第一流通池泳道4a的第一流通池入口3a，所述所选试剂可以然后在所述第一流通池入口处流动通过第一流通池泳道4a到第一出口端口5a，并且最后通过流通池出口管线(参见图40)到流通池废物容器。
203.关于对洗涤溶液的流体控制，图41的流体多路复用器单元4200可以选择性地提供洗涤溶液与第一流通池泳道4a之间的流体连通。因此，在洗涤溶液流体管线阀v6处于打开状态的情况下，洗涤溶液管线l6可以与流体多路复用器废物通道4246以及流通池废物通道(参见图39)流体连通，条件是可以进行对流体多路复用器电路4215和第一流通池泳道4a的
洗涤。本发明教导的非限制性说明性洗涤溶液流体路径是通过洗涤操作给出的，在所述洗涤操作中，洗涤溶液流体管线阀v6处于打开状态，并且试剂流体管线阀v1至v4中的每个试剂流体管线阀均处于关闭状态，条件是洗涤溶液可以流动通过洗涤溶液流体通道4242到具有中心通道4250的三通接头。由于中心通道4250通过流体多路复用器电路4215与废物通道4246流体连通，因此洗涤溶液可以通过废物通道4246流动到流体多路复用器废物。如本文将更详细地公开的，洗涤溶液可以通过第一流通池泳道4a从第一入口端口3a到第一出口端口5a，并且然后到流通池废物容器。
204.根据本发明教导，可以例如依序在洗涤操作之后并且在所选试剂被放置成与图41的第一流通池泳道4a流体连通之前进行用所选试剂灌注流体多路复用器单元4200的流体多路复用器电路4215。说明试剂灌注的非限制性实例是通过试剂灌注操作给出的，在所述试剂灌注操作中，溶液流体管线阀v6处于打开状态，并且试剂流体管线阀v1至v4之一被选择处于打开状态，条件是所选试剂之一与流体多路复用器单元4200的流体多路复用器电路4215流体连通。在此种操作下，相对于试剂的流动速率选择洗涤溶液的流动速率，使得洗涤溶液流动通过洗涤通道4242并通过传感器阵列装置10的第一流通池泳道4a到芯片废物。在此类条件下，所选试剂循环通过流体多路复用器电路4215，因为所述所选试剂被流动通过传感器阵列装置10的洗涤溶液阻止流动通过所述装置。因此，所选试剂流动通过流体多路复用器电路4215通过废物通道4246到主废物。因此，当启动如本文先前所描述的试剂递送操作时，在试剂灌注操作中选择的试剂与第一流通池入口3a直接流动连通。
205.因此，本发明教导的流控系统的各个实施例被配置成执行一系列操作，以在下一代测序分析过程中将各种溶液依序递送到传感器阵列装置。例如，一系列操作可以包含洗涤、灌注和通过流体多路复用器块单元将核苷酸试剂递送到传感器阵列装置，如图41中所描绘的。使用本发明教导的用于在一系列流体操作期间将流体分配到传感器阵列装置的流体多路复用器块可以避免试剂在各个流体隔室中的交叉污染，以及提供试剂流体流之间的急剧转变。另外地，如本文将更详细地公开的，本发明教导的流控系统的各个实施例可以为参考电极提供恒定的电解质流体环境，由此针对传感器阵列装置提供恒定的稳定参考电压。
206.图42是总体上展示了流体多路复用器块夹具组合件4150的后等距视图。如图42中所描绘的，流体多路复用器块夹具组合件4150包含其中安装有流体多路复用器块组合件4110的流体多路复用器块夹具4400。流体多路复用器块夹具4400可以包含安装在电极适配器流体接口块4340的一侧4342上的电极连接安装板4410。电极连接安装板4410实现电引线4412和接地引线4414到流体多路复用器块夹具组合件4150的电极适配器流体接口块4340的连接。流体多路复用器块夹具4400还包含带肩螺钉4420、4422和4424以及放置在带肩螺钉4424和相对的带肩螺钉4422下方的第四带肩螺钉。流体多路复用器块夹具4400的带肩螺钉上的力被设置成向安装在其中的流体多路复用器块提供四度移动，以提供流体多路复用器块与多泳道传感器阵列装置对接的灵活性。
207.关于安装在流体多路复用器块夹具4400中的流体多路复用器块组合件4110，如图42中所描绘的，流体多路复用器块4100和流体块连接的取向示出了流体接口块4312在流体多路复用器块夹具组合件4150的顶部处安装到流体多路复用器块4100，而流体接口块4302在流体多路复用器块夹具组合件4150的底部处安装到流体多路复用器块4100。如图42中所
描绘的，第一柔性管组4314和第二柔性管组4316的取向同样从流体多路复用器块夹具组合件4150的顶部发出，而第一柔性管组4304和第二柔性管组4306的取向同样从流体多路复用器块夹具组合件4150的底部发出。类似地，流体接口块4332在流体多路复用器块夹具组合件4150的背部和电极适配器流体接口块4340下方安装到流体多路复用器块4100。如图42中所描绘的，第一柔性管组4334和第二柔性管组4336的取向同样从流体多路复用器块夹具组合件4150的背部发出。最后，流体接口块4322在流体多路复用器块夹具组合件4150的背部和电极适配器流体接口块4340上方安装到流体多路复用器块4100。如图42中所描绘的，第一柔性管组4324和第二柔性管组4326的取向同样从电极适配器流体接口块4340的顶部发出。
208.图43是总体上展示了流体多路复用器块4100在其安装在流体多路复用器块夹具组合件中时的取向以及电极到流体多路复用器单元中的集成的截面视图。流体多路复用器块第一面4102被描绘为具有安装在其上的流体接口块4302并且具有连接到流体接口块4302的第一柔性管组4304和第二柔性管组4306，而流体多路复用器块第二面4104被描绘为具有安装在其上的流体接口块4312并且具有连接到流体接口块4312的第一柔性管组4314和第二柔性管组4316。类似地，流体多路复用器块第三面4106被描绘为具有安装在其上的流体接口块4332并且具有连接到流体接口块4332的第一柔性管组4334和第二柔性管组4336。另外地，流体多路复用器块第三面4106被描绘为具有安装在其上的电极适配器流体接口块4340。如图43中所描绘的，流体接口块4322安装在电极适配器流体接口块4340上，使得连接到流体接口块4332的第一柔性管组4324和第二柔性管组4326分别与电极适配器流体接口块入口通道4342和4344流体连通。在这方面，电极适配器流体接口块4340安装到流体多路复用器块第三面4106，使得电极适配器流体接口块入口通道4342和4344分别联接和密封到传感器废物出口端口4264和洗涤溶液入口端口4240。最后，如图43所描绘的，流体多路复用器块第四面4108具有传感器接口入口连接器端口4260和传感器接口出口连接器端口4262。如本文先前所公开的，流体多路复用器块第四面4108具有用于流体多路复用器块4100的每个流体多路复用器单元的一组对应的传感器接口入口连接器端口和传感器接口出口连接器端口。如本文随后将更详细地公开的，传感器接口入口连接器端口4260和传感器接口出口连接器端口4262分别联接并且密封到多泳道传感器装置的入口端口和出口端口。
209.关于提供到每个流体多路复用器单元的电极连接，所述电极连接向多泳道传感器阵列装置提供恒定、稳定的参考电极电压，图43描绘了其上安装有电极连接安装板4410的电极适配器流体接口块4340的截面视图。图43描绘了在电极适配器流体接口块入口通道4344的截面中的放大孔中的电极4275，所述电极提供通过与洗涤溶液通道4242流体连通的电极适配器流体接口块入口通道4344的流体流通。电极4275通过电引线4412和接地引线4414(参见图42)电联接到连接到电极连接安装板4410的电压源。如本文先前所公开的，第二柔性管组4326与稳定电解质组合物的洗涤溶液的源流体连通。因此，电极4275处于向多泳道传感器阵列装置提供恒定、稳定的参考电极电压的流体环境中。
210.图44是总体上展示了流体多路复用器块夹具组合件4150的前等距视图，所述流体多路复用器块夹具组合件包含其中安装有流体多路复用器块组合件4110的流体多路复用器块夹具4400。如图44中所描绘的，流体多路复用器块4100的流体多路复用器块第四面
4108分别具有用于每个流体多路复用器单元4200a、4200b、4200c和4200d的传感器接口入口连接器端口4260a至4260d和传感器接口出口连接器端口4262a至4262d。第一流体歧管单元4200a的第一对准凹口4107a和第四流体歧管单元4200d的第二对准凹口4107b被配置成有助于流体多路复用器块夹具组合件4150相对于多泳道传感器阵列装置的对准和密封过程。如本文先前所公开的，流体多路复用器块夹具4400向安装在其中的流体多路复用器块提供四度移动，以提供流体多路复用器块与多泳道传感器阵列装置对接的灵活性。另外地，第一对准凹口4107a和第二对准凹口4107b被配置成提供多泳道传感器阵列装置与多泳道传感器阵列装置的自对准，使得传感器接口入口连接器端口和传感器接口出口连接器端口如传感器接口入口连接器端口4260a至4260d和传感器接口出口连接器端口4262a至4262d的密封可以相对于多泳道传感器阵列装置的相应入口端口和出口端口进行。
211.图45是总体上展示了安装到多泳道传感器装置10如图41中示意性描绘的多泳道传感器装置10的流体多路复用器块组合件4110的截面视图。如图45中所描绘的，安装到传感器装置安装和定位组合件4450的多泳道传感器装置10。流体多路复用器块组合件4110的流体接口块4302、4312、4322和4332的位置在图45的截面视图中也很明显。当流体多路复用器块组合件4110安装到多泳道传感器装置10时，对于多泳道传感器阵列装置的每个泳道，分别进行每个传感器接口入口连接器端口和每个传感器接口出口连接器端口与每个对应的传感器阵列入口端口和每个传感器阵列出口端口的联接和密封。在这方面，图46是总体上展示了流体多路复用器块到多泳道传感器阵列的安装和密封的扩展等距视图。如图46中所描绘的，传感器阵列装置10具有泳道4a至4d，每个泳道具有入口端口和出口端口，如针对具有入口端口3a和出口端口5a的泳道4a所例示的。在图46中，传感器阵列装置10的第一对准销12a和流体多路复用器块4100的第一对准凹口4107a的并置示出互补对如何接合以将传感器阵列装置10与流体多路复用器块4100对准。另外，图46描绘了传感器阵列装置10的每个入口端口和每个出口端口可以如何联接和密封到流体多路复用器块4100的每个对应的传感器接口入口连接器端口和每个传感器接口出口连接器端口。在图46中，这是针对泳道4a所例示的，其中一旦传感器阵列装置10和流体多路复用器块4100已经彼此完全接合，第一入口端口3a与传感器接口入口连接器端口4260a和第一出口端口5a与传感器阵列装置接口出口连接器端口4262a的并置就可以联接和密封到每个。
212.图47是总体上展示了本发明教导的测序系统的流控系统41000的示意性表示。如图47中所描绘的，流控系统41000具有气动控制系统4500以及液体处理控制系统，如溶液处理歧管4600和试剂分配歧管组合件4700。
213.在这方面，气动控制系统4500通过经由阀4501控制的第一气动入口管线与第一洗涤溶液容器4520流体连通，通过经由阀4503控制的第二气动入口管线4504与第二洗涤溶液容器4522流体连通，并且通过经由阀4505控制的第三气动入口管线4506与清洁溶液容器4524流体连通。类似地，气动控制系统4500通过经由阀4507控制的第四气动入口管线4508与试剂容器组合件4670流体连通。关于流控系统控制，气动控制系统4500通过经由阀4509控制的第五气动入口管线4510与溶液处理歧管4600流体连通。最后，气动控制系统4500通过经由阀4511控制的第六气动入口管线4512与夹紧歧管4800流体连通。如本文将更详细地公开的，气动控制系统4500和夹紧歧管4800连同流量传感器4610提供溶液输入源与废物之间的系统调节和控制。根据本发明教导，流控系统41000的流控系统调节和控制在溶液输入
源如第一洗涤溶液容器4520、第二洗涤溶液容器4522、清洗溶液容器4524和试剂容器组合件4670与废物容器4550之间提供限定和可控的压差。因此，限定且受控的压力差提供了在分析过程中使用的各种溶液通过流控系统41000的各个液体电路的限定且受控的流量。流量可以包含：对于单泳道芯片流动，大约15μl/s的速率；对于单泳道芯片和主废物流动，45μl/s的速率；对于全芯片和主废物流动，180μl/s的速率；或在系统清洁操作期间超过300μl/s的速率。
214.溶液处理歧管4600提供对清洁和填充中使用的各种溶液的分配的控制。如图47中所描绘的，溶液处理歧管4600具有与流量传感器4610流体连通的溶液处理歧管管线4620。根据本发明教导，流量传感器4610向气动控制系统4500提供动态输入，以用于使用夹紧歧管4800校准流控系统41000的各个液体路的限定流量，并且以用于在填充核苷酸容器时提供确定的流量。关于液体输入源，第一洗涤溶液容器4520通过第一洗涤溶液出口管线4530与溶液处理歧管4600流体连通，而第二洗涤溶液容器4522通过第二洗涤溶液出口管线4532与溶液处理歧管4600流体连通，并且清洁溶液容器4524通过校准溶液出口管线4534与溶液处理歧管4600流体连通。
215.为了为在下一代测序期间执行的大规模并行处理提供足够的试剂体积，流控系统41000被配置成提供在分析过程中使用的大量各种溶液。在这方面，试剂浓缩物盒4660与洗涤溶液容器4520和4522流体连通。如本文所用，洗涤溶液是稳定电解质组合物的水基溶液，其可以在制备校准溶液和测序试剂时用作溶剂，用于如本文先前所描述的洗涤操作，以及用于不断地更新参考电极周围的电解质溶液。试剂浓缩物盒4660可以包含校准溶液浓缩物容器4661，而其余的浓缩物是核苷酸试剂浓缩物。例如，第一核苷酸试剂浓缩物容器4663可以含有脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)试剂浓缩物，而第二核苷酸试剂浓缩物容器4665可以含有脱氧胞苷三磷酸(dctp)试剂浓缩物，并且第三核苷酸试剂浓缩物容器4667(例如，图11的盒)可以含有脱氧腺苷三磷酸(datp)试剂浓缩物，而第四核苷酸试剂浓缩物容器4669可以含有脱氧胸苷三磷酸(dttp)试剂浓缩物。试剂浓缩物盒4660还与试剂容器组合件4670流体连通。试剂容器组合件4670的每个容器容纳大量校准溶液和dntp试剂，用于本发明教导的高通量下一代合成测序分析系统。每个试剂容器可以具有大约225ml的体积，以支撑大约150ml的稀释溶液体积。在制备散装校准溶液和散装核苷酸试剂时，浓缩试剂在试剂容器中混合时被稀释约100倍。
216.在测序运行启动之前，可以进行校准溶液和核苷酸试剂的散装制备。关于校准溶液的散装制备，在溶液处理歧管4600的阀4602和4621打开并且所有其它溶液处理歧管阀关闭的情况下，洗涤溶液容器4520中的洗涤溶液可以通过洗涤溶液出口管线4530流动到溶液处理歧管管线4620中并通过校准浓缩物管线4631流动到校准溶液浓缩物容器4661中，并且然后通过校准溶液入口管线4641流动到校准溶液容器4671中。洗涤溶液可以继续流动通过校准溶液浓缩物容器4661到校准溶液容器4671达到校准溶液容器4671的预定填充体积，此时校准溶液浓缩物容器4661已经有效地排出校准溶液浓缩物。
217.接下来，第一核苷酸溶液的散装制备可以通过使溶液处理歧管4600的阀4602和4623打开并且所有其它溶液处理歧管阀关闭来进行，使得洗涤溶液容器4520中的洗涤溶液可以流动到溶液处理歧管管线4620中并通过第一核苷酸试剂浓缩物管线4633流动到第一核苷酸试剂浓缩物容器4663中并且然后通过第一核苷酸试剂入口管线4643流动到第一核
苷酸试剂容器4673中，直到第一核苷酸试剂容器4673被填满为止。
218.在第一核苷酸溶液的散装制备完成之后，第二核苷酸溶液的散装制备可以通过使溶液处理歧管4600的阀4602和4625打开并且所有其它溶液处理歧管阀关闭来进行，使得洗涤溶液容器4520中的洗涤溶液可以通过洗涤溶液出口管线4530流动到溶液处理歧管管线4620中并通过第二核苷酸试剂浓缩物管线4635流动到第二核苷酸试剂浓缩物容器4665中并且然后通过第二核苷酸试剂入口管线4645流动到第二核苷酸试剂容器4675中，直到第二核苷酸试剂容器4675被填满为止。
219.在第二核苷酸试剂的散装制备之后，第三核苷酸溶液的散装制备可以通过使溶液处理歧管4600的阀4602和4627打开并且所有其它溶液处理歧管阀关闭来进行，使得洗涤溶液容器4520中的洗涤溶液可以通过洗涤溶液出口管线4530流动到溶液处理歧管管线4620中并通过第三核苷酸试剂浓缩物管线4637流动到第三核苷酸试剂浓缩物容器4667中并且然后通过第三核苷酸试剂入口管线4647流动到第三核苷酸试剂容器4677中，直到第三核苷酸试剂容器4677被填满为止。
220.最后，第四核苷酸溶液的散装制备可以通过使溶液处理歧管4600的阀4602和4629打开并且所有其它溶液处理歧管阀关闭来进行，使得洗涤溶液容器4520中的洗涤溶液可以通过洗涤溶液出口管线4530流动到溶液处理歧管管线4620中并通过第四核苷酸试剂浓缩物管线4639流动到第四核苷酸试剂浓缩物容器4669中并且然后通过第四核苷酸试剂入口管线4649流动到第四核苷酸试剂容器4679中，直到第四核苷酸试剂容器4679被填满为止。
221.通过为高通量下一代合成测序运行准备足够的校准溶液和核苷酸试剂，试剂分配歧管组合件4700可以控制试剂容器组合件4670中的各种溶液通过流体多路复用器块4100并且进入传感器阵列装置10，并且最后通过芯片废物管线4324或主废物管线4334(参见例如图43)进入废物4530的分配。
222.如图47中所描绘的，试剂分配歧管组合件4700可以包含试剂分配歧管4702、试剂分配歧管4712和试剂分配歧管4722。图47的加热器块4750可以与柔性管组4304、4306、4314、4316、4326和4336接触，以确保溶液和试剂在流动通过流体多路复用器块4100和传感器阵列装置10之前具有均匀温度。
223.试剂分配歧管4702可以具有阀块4704中的第一组阀，所述阀块可以单独控制溶液处理歧管管线4620与柔性管组4326之间的流体连通。如针对图43的流体多路复用器块组合件43110所描绘的，柔性管组4326的每个管连接到对应的流体多路复用器单元的对应的洗涤溶液入口端口，如图40的流体多路复用器单元40200的洗涤溶液入口端口40240。另外地，试剂分配歧管4702可以具有阀块4706中的第二组阀，所述阀块可以单独控制校准溶液管线出口4651与柔性管组4336之间的流体连通。如针对图43的流体多路复用器块组合件4110所描绘的，柔性管组4336的每个管连接到对应的流体多路复用器单元的对应的校准溶液入口端口，如图40的流体多路复用器单元4200的校准溶液入口端口4234。
224.为了提供通过多泳道传感器阵列装置的一个所选泳道或通过多个所选泳道的洗涤溶液流动，溶液处理歧管4600的阀4602或4604中的任一阀可以打开，而溶液处理歧管4600中的所有其它阀都关闭。试剂分配歧管4702的阀块4704中的一个阀、所有四个阀或阀的任何组合可以打开，因此来自任一容器4520和4522的洗涤溶液可以通过任一洗涤溶液出口管线4530或4532流动到溶液处理歧管管线4620中，以分别由对应的流体多路复用器块单
元分配到一个泳道、所有四个泳道或泳道的任何组合，这取决于对阀块4704中的阀的选择。为了提供通过多泳道传感器阵列装置的一个所选泳道或通过多个所选泳道的校准溶液流动，溶液处理歧管4600中的所有阀都关闭。试剂分配歧管4702的阀块4706中的一个阀、所有四个阀或阀的任何组合可以打开，因此来自校准溶液容器4671的校准溶液可以流动到校准溶液管线出口4651中，以由对应的流体多路复用器块单元分配到一个泳道、所有四个泳道或泳道的任何组合，这取决于对阀块4706中的阀的选择。
225.试剂分配歧管4712可以具有阀块4714中的第一组阀，所述阀块可以单独控制第一核苷酸试剂出口管线4653与柔性管组4304之间的流体连通。如针对图43的流体多路复用器块组合件4110所描绘的，柔性管组4304的每个管连接到对应的流体多路复用器单元的对应的第一核苷酸试剂入口端口，如图40的流体多路复用器单元4200的第一核苷酸试剂入口端口4210。另外地，试剂分配歧管4712可以具有阀块4716中的第二组阀，所述阀块可以单独控制第二核苷酸试剂出口管线4655与柔性管组4306之间的流体连通。如针对图43的流体多路复用器块组合件4110所描绘的，柔性管组4306的每个管连接到对应的流体多路复用器单元的对应的第二核苷酸试剂入口端口，如图40的流体多路复用器单元4200的第二核苷酸试剂入口端口4216。
226.为了提供通过多泳道传感器阵列装置的一个所选泳道或通过多个所选泳道的第一核苷酸试剂流动，溶液处理歧管4600中的所有阀都关闭。分配歧管4712的阀块4714中的一个阀、所有四个阀或阀的任何组合可以打开，因此来自第一核苷酸试剂容器4673的第一核苷酸试剂可以流动到第一核苷酸试剂出口管线4653中，以由对应的流体多路复用器块单元分配到一个泳道、所有四个泳道或泳道的任何组合，这取决于对阀块4714中的阀的选择。为了提供通过多泳道传感器阵列装置的一个所选泳道或通过多个所选泳道的第二核苷酸试剂流动，溶液处理歧管4600中的所有阀都关闭。分配歧管4712的阀块4716中的一个阀、所有四个阀或阀的任何组合可以打开，因此来自第二核苷酸试剂容器4675的第二核苷酸试剂可以流动到第二核苷酸试剂出口管线4655中，以由对应的流体多路复用器块单元分配到一个泳道、所有四个泳道或泳道的任何组合，这取决于对阀块4716中的阀的选择。
227.试剂分配歧管4722可以具有阀块4724中的第一组阀，所述阀块可以单独控制第三核苷酸试剂出口管线4657与柔性管组4314之间的流体连通。如针对图43的流体多路复用器块组合件4110所描绘的，柔性管组4314的每个管连接到对应的流体多路复用器单元的对应的第三核苷酸试剂入口端口，如图40的流体多路复用器单元40200的第三核苷酸试剂入口端口40222。另外地，试剂分配歧管4722可以具有阀块4726中的第二组阀，所述阀块可以单独控制第四核苷酸试剂出口管线4659与柔性管组4316之间的流体连通。如针对图43的流体多路复用器块组合件4110所描绘的，柔性管组4316的每个管连接到对应的流体多路复用器单元的对应的第四核苷酸试剂入口端口，如图40的流体多路复用器单元4200的第四核苷酸试剂入口端口4228。
228.为了提供通过多泳道传感器阵列装置的一个所选泳道或通过多个所选泳道的第三核苷酸试剂流动，溶液处理歧管4600中的所有阀都关闭。分配歧管4722的阀块4724中的一个阀、所有四个阀或阀的任何组合可以打开，因此来自第三核苷酸试剂容器4677的第三核苷酸试剂可以流动到第三核苷酸试剂出口管线4657中，以由对应的流体多路复用器块单元分配到一个泳道、所有四个泳道或泳道的任何组合，这取决于对阀块4724中的阀的选择。
为了提供通过多泳道传感器阵列装置的一个所选泳道或通过多个所选泳道的第四核苷酸试剂流动，溶液处理歧管4600中的所有阀都关闭。分配歧管4722的阀块4726中的一个阀、所有四个阀或阀的任何组合可以打开，因此来自第四核苷酸试剂容器4679的第四核苷酸试剂可以流动到第四核苷酸试剂出口管线4659中，以由对应的流体多路复用器块单元分配到一个泳道、所有四个泳道或泳道的任何组合，这取决于对阀块4726中的阀的选择。
229.可以执行对流控系统41000中的所有流体组件的清洁时间表。此种清洁通常在芯片的所有四个泳道都已测序之后或在系统上安装新芯片之前执行。可以在耗竭的试剂浓缩物盒和已使用的多泳道传感器阵列装置处于适当位置的情况下执行清洁。在阀4606打开的情况下，溶液处理歧管4600的阀4623至4629中的每个阀可以依序打开，并且分配歧管组合件4700的对应的阀块的一组阀中的所有阀可以打开。在针对如本文先前所描述的校准溶液和每种核苷酸试剂的每个流体路径依序执行此种流动路径的情况下，来自清洁溶液容器4524的清洁溶液可以依序流动通过流控系统41000的每个流体组件到废物容器4550。最后，进行干燥程序以使系统为下一次使用做好准备。对于干燥程序，阀4602、4604和4606关闭，并且溶液处理歧管4600的所有其它阀打开，并且试剂分配歧管组合件4700的所有阀打开。在所述配置中，清洁干燥空气穿过流控系统41000的液体处理组件以将其余的液体驱动到废物容器4550。
230.如本文先前所公开的，气动控制系统4500和夹紧歧管4800连同流量传感器4610提供溶液输入源与废物之间的系统调节和控制。夹紧歧管4800含有八个夹紧调节器，每个如us 9,375,716中所描述构造。这些装置基本上作为具有输入流体端口、输出流体端口和控制气动端口的三端口压力随动件进行操作。在夹紧调节器输出流体端口与废物容器4550之间连接有限定的废物管线流体阻力的情况下，不管输入流体端口上的压力如何，输出流体端口上的压力将大约等于夹紧调节器控制气动端口上的压力。然后，通过夹紧调节器的流动速率将等于输出流体端口压力除以废物管线流体阻力。为了精确校准流动速率，流体控制系统41000被配置成允许洗涤溶液流动到夹紧歧管4800上的期望的夹紧调节器。一组已知的气动压力施加到每个夹紧调节器气动控制端口，并且流动传感器4610测量对应于气动控制压力的精确流动速率。然后，针对每个夹紧调节器，存储流动速率对气动控制压力的表，仪器软件可以利用所述表精确递送任何期望的流动速率。
231.图48包含用于与传感器装置接口的示例性电子接口4802的图示。例如，电子接口4802可以包含与传感器装置的电子接口交互的销。任选地，接口4802可以包含使传感器装置与电子接口4802脱离接合的机构4804。例如，当流体歧管被压靠在传感器装置上时(如图46所展示)，机构4804可以压下。当流体歧管与传感器装置断开连接时，机构4804可以将传感器装置推离电子接口4802。任选地，所述系统可以进一步包含如散热器4806等用于控制温度的机构。散热器4806可以包含翅片。可替代地，散热器4806可以是液冷散热器。
232.具体地，流控系统和电子接口用于在合成测序反应期间检测核苷酸掺入。数据被收集并且提供给测序仪器服务器系统。
233.测序仪软件
234.在一些实施例中，核酸测序仪器可以与用于控制测序仪器的各个组件并且对来自测序仪器上的测序运行的数据输出进行处理的服务器系统接口连接。服务器系统软件可以包含web应用、数据库和分析流水线并且支持来自测序仪器的连接(例如，图6)。服务器系统
软件可以提供以下主要功能和应用程序接口(api)：
235.1.用于用户认证、试剂跟踪、运行信息和运行跟踪/记录的api。支持的仪器可以包含测序仪器和提取仪器。
236.2.用于创建样品、文库、计划运行和检索计划的运行状态的lims(实验室信息管理系统)的api。
237.3.支持对样品和运行数据的管理。
238.4.支持测定配置和执行分析流水线以进行数据分析和报告。
239.5.与用于软件更新和维护的软件更新服务器的接口。
240.6.支持配置连接到部署在基于云的系统或本地系统中的注释和报告系统，如来自赛默飞世尔科技公司的ion reporter，并且与基于云的系统建立安全和经过认证的连接，以传输经映射或未经映射的bam文件。
241.7.支持配置连接到云计算环境中的资源系统，如赛默飞世尔云，并且与云资源系统建立安全和经过认证的连接，以下载软件和系统内容并发送遥测数据。
242.图49示出了服务器系统组件的示意图。在一些实施例中，基础软件架构可以包括web接口、远程监测代理、数据库、与仪器的api、分析流水线、分析流水线的集装箱化(例如使用docker)、到注释和报告系统的连接(例如，来自赛默飞世尔科技公司的ion reporter)和基于云的支持和资源系统(例如赛默飞世尔云)。基于云的支持和资源系统或基于云的资源系统可以在云计算和存储系统中实施。基于云的支持和资源系统存储包含测定定义文件的内容。云计算和存储系统的服务器可以将如测定定义文件等内容下载到本地服务器系统。基于云的支持和资源系统可以从本地服务器系统接收遥测数据。服务器系统、本地服务器系统和用户的服务器系统在本文中可互换使用。
243.在一些实施例中，用户接口(ui)可以通过web应用软件实施。ui可以提供样品管理页面。样品管理ui页面允许用户将样品信息输入到系统中。样品信息包含唯一样品标识符(id)、样品名称和样品制备试剂跟踪信息。验证逻辑内置于将样品制备步骤锁定到预定义测定工作流的样品管理流中。ui可以提供测定管理页面。测定管理ui页面允许用户查看测定并创建测定。测定将工作流锁定到过程的每个步骤的预定义参数。可以内置有验证逻辑以确保测定配置。ui可以提供运行计划和监测器页面。运行计划和监测器ui页面允许用户对运行进行计划并监测正在进行的运行。ui可以提供输出数据页面。输出数据ui页面允许用户查看分析结果以及对所生成的结果的质量控制(qc)度量评价、日志和审计跟踪。ui可以提供配置页面。配置ui页面允许用户对系统进行查看和配置。
244.在一些实施例中，应用编程接口(api)可以通过java平台提供。例如，java平台可以包含可以用于针对基于web的应用构建web档案(war)文件的tomcat服务器。
245.在kepler工作流引擎的上下文中，用于分析流水线的各个步骤的代码模块可以被称为参与者(actor)。例如，用于分析步骤的代码模块可以由包含在参与者罐(actor jar)中的java程序二进制代码来实施。kepler工作流引擎将工作流的处理组件定义为“参与者”并将步骤链接起来以供算法或分析流水线的处理器执行。(https://kepler-project.org)。例如，可以使用kepler工作流引擎来配置图49中的分析流水线的工作流。
246.服务器系统可以包含一个或多个数据库。例如，服务器系统可以包含用于存储样品数据、运行数据和系统/用户配置的关系数据库。关系数据库可以包含两个独立的数据
库：分析开发数据库和dx数据库。测定开发数据库可以存储用于ruo或测定开发操作模式的样品数据、运行数据和系统/用户配置。dx数据库可以存储用于ivd或dx操作模式的样品数据、运行数据和系统/用户配置。
247.服务器系统可以包含用于存储注释源数据的注释数据库annotationdb。例如，注释数据库可以被实施为nosql或非关系数据库，例如mongodb数据库。每个注释源可以存储为具有指示源名称和版本的元信息的json(javascript对象表示法)串。每个注释源可以含有以注释id为关键字的注释列表。服务器系统可以包含用于存储变异信息的变异组数据库variomedb。例如，变异组数据库可以被实施为nosql或非关系数据库，例如mongodb数据库。variomedb可以存储特定样品的变异识别结果集合。例如，json格式的记录可以含有用于标识样品的元信息。
248.例如，annotationdb数据库可以存储以下注释源中的一个或多个注释源：
249.1.refgene模型：hg19_refgene_63，版本63
250.2.refgene功能规范转录物评分：hg19_refgenescores_4，版本4
251.3.dbsnp：dbsnp_138，版本138
252.4.规范refseq转录物：hg19_refgene_63，版本63
253.5.5000exomes：hg_esp6500_1，版本1
254.6.clinvar：clinvar_1，版本1
255.7.dgv：dgv_20130723，版本20130723
256.8.omim：omim_03022014，版本03022014
257.可以包含其它注释源。可以包含以上注释源的其它版本。注释源可以提供公共注释信息内容或专有注释信息内容。
258.对于变异组数据库中的每个识别，可以查询每个注释源以查找与变异匹配的注释，并且可以将匹配注释作为键值对与变异一起存储在变异组数据库中。带注释的变异可以包含在用户的结果文件，例如带注释的vcf文件中。vcf文件是用于存储基因序列变异的制表符分隔的文本文件。在一些实施例中，与本发明教导一起使用的注释方法可以包含在2016年1月28日公布的美国专利申请公开第2016/0026753号中描述的一个或多个特征，所述美国专利申请公开以全文引用的方式并入本文中。
259.在一些实施例中，服务器系统可以包含用于对在由测序仪器执行的测定的测序运行期间生成的测序数据进行处理的分析流水线。测序仪将测序数据文件和实验日志文件例如以原始.dat文件、产生逐块1.wells文件的已处理的.dat文件和缩略图数据的形式传输到服务器系统存储器。分析流水线访问来自存储器的数据文件并且针对运行开始数据分析。
260.在一些实施例中，可以使用docker容器和docker镜像来打包分析流水线和操作系统特定的二进制文件。docker是一种通过使用容器来创建、部署和运行应用的工具。容器使应用能够与其所需的所有部分，如文库和其它依赖项一起捆绑为一个包。这允许应用软件使用与主机系统相同的linux核。docker镜像文件可以与分析流水线代码所需的文库和二进制文件一起打包。docker可以用于使应用或算法适应操作系统(os)的新版本或不同版本，以创建与os版本兼容的应用的docker镜像。
261.在一些实施例中，服务器系统可以包含用于将数据从测序仪器传输到分析流水线
的爬虫服务(crawler service)。爬虫是一种可以使用java nio watcher api(应用编程接口)开发的基于事件的服务。nio(非阻塞i/o)是为密集型输入/输出(i/o)操作提供功能的java编程语言api的集合。爬虫可以监测为测序仪器配置的ftp目录，以将运行数据从测序仪器传输到分析流水线。
262.图50是根据一实施例的分析流水线的框图。测序仪器在测定的测序运行期间生成原始数据文件(dat或.dat文件)。信号处理可以应用于原始数据以生成如1.wells文件等与运行的日志信息一起传输到服务器ftp位置的文件的掺入信号测量数据。信号处理步骤可以导出对应于孔的背景信号。可以从对应孔的测得信号中减去背景信号。剩余的信号可以通过掺入信号模型拟合，以估计每个孔的每个核苷酸流处的掺入。来自以上信号处理的输出是可以存储在如1.wells文件等文件中的每个孔和每个流的信号测量结果。
263.在一些实施例中，碱基识别步骤可以进行相位估计、归一化，并且运行求解器算法以标识最佳部分序列拟合并进行碱基识别。序列读段的碱基序列存储在未经映射的bam文件中。碱基识别步骤可以生成读段总数、碱基总数和平均读长作为指示碱基识别质量的qc度量。碱基识别可以通过分析任何合适的信号特征(例如，信号振幅或强度)来进行。与本发明教导一起使用的信号处理和碱基识别可以包含2013年4月11日公布的美国专利申请公开第2013/0090860号、2014年2月20日公布的美国专利申请公开第2014/0051584号和2012年5月3日公布的美国专利申请公开第2012/0109598号中所描述的一种或多种特征，每个公开以全文引用的方式并入本文中。
264.一旦序列读段的碱基序列确定，就可以向比对步骤提供序列读段，例如以为未经映射的bam文件的形式。比对步骤将序列读段与参考基因组进行比对，以确定经比对的序列读段和相关映射质量参数。比对步骤可以生成一定百分比的可映射读段作为qc度量以指示比对质量。比对结果可以存储在经映射的bam文件中。与本发明教导一起使用的用于比对序列读段的方法可以包含2012年8月2日公布的美国专利申请公开第2012/0197623号中描述的一种或多种特征，该公开以全文引用的方式并入本文中。
265.bam文件格式结构在2014年9月12日的“序列比对/地图格式规范”中进行了描述(https://github.com/samtools/hts-specs)。如本文中所描述的，“bam文件”是指与bam格式兼容的文件。如本文中所述，“未经比对的”bam文件是指不含有经比对的序列读段信息和映射质量参数的bam文件，并且“经映射的”bam文件是指含有经比对的序列读段信息和映射质量参数的bam文件。
266.在一些实施例中，变异识别步骤可以包含检测单核苷酸多态性(snp)、插入和缺失(indel)、多核苷酸多态性(mnp)和复杂嵌段取代事件。在各个实施例中，变异识别器可以被配置成将针对样品基因组识别的变异以*.vcf、*.gff或*.hdf数据文件的形式进行传送。只要所识别的变异信息可以被解析或提取以用于分析，所识别的变异信息就可以使用任何文件格式传送。与本发明教导一起使用的变异检测方法可以包含2013年12月26日公布的美国专利申请公开第2013/0345066号、2014年10月2日公布的美国专利申请公开第2014/0296080号和2014年2月20日公布的美国专利申请公开第2014/0052381号以及2018年4月24日发行的美国专利第9,953,130号中所描述的一个或多个特征，所述专利中的每个专利通过引用整体并入本文。在一些实施例中，变异识别步骤可以应用于带分子标签的核酸序列数据。用于带分子标签的核酸序列数据的变异检测方法可以包含2018年11月22日公布的美
国专利申请公开第2018/0336316号中描述的一种或多种特征，所述美国专利申请公开通过引用整体并入本文。
267.在一些实施例中，分析流水线可以包含用于融合检测的融合分析流水线。融合检测方法可以包含2016年1月21日公布的美国专利申请公开第2016/0019340号中描述的一个或多个特征，所述美国专利申请公开通过引用整体并入本文。在一些实施例中，融合分析流水线可以应用于带分子标签的核酸序列数据。用于带分子标签的核酸序列数据的融合检测方法可以包含2019年3月21日公布的美国专利申请公开第2019/0087539号中描述的一个或多个特征，所述美国专利申请公开通过引用整体并入本文。
268.在一些实施例中，分析流水线可以包含用于检测拷贝数变异的拷贝数变异分析流水线。用于检测拷贝数变异的方法可以包含2014年9月11日公布的美国专利申请公开第2014/0256571号、2012年2月23日公布的美国专利申请公开第2012/0046877号和2016年4月14日公布的美国专利申请公开第us2016/0103957号中所描述的一种或多种特征，所述美国专利申请公开中的每个美国专利申请公开通过引用整体并入本文。
269.在一些实施例中，服务器系统软件可以支持封装的测定配置，其包含测定名称、测定类型、面板、热点文件(如果有的话)、参考名称、对照名称(如果有的话)、质量控制qc阈值、测定描述(如果有的话)、数据分析参数和值、仪器运行脚本名称和定义测定的其它配置。整套信息被称为测定定义。测定配置内容和对应的工作流可以作为测定定义文件(adf)中的模块化软件组件传送给用户。服务器系统软件可以导入含有测定配置的测定定义文件。导入过程可以通过包含加密的debian文件并触发安装过程的zip文件导入来启动。用户接口可以提供页面供用户选择要导入的adf。基于云的支持和资源系统中的应用商店可以存储可供用户选择以下载到用户的本地服务器系统的支持各种测定、面板和工作流的adf。
270.测定定义文件(adf)是定义用于分子测试或测定的配置的封装文件，其包含测定名称、技术平台配置(例如，下一代测序(ngs)、芯片类型、化学成分类型)、工作流步骤(样品制备、仪器脚本、分析、报告)、分析算法、监管标记(例如，仅供科研使用(ruo)、体外诊断(ivd)、中欧体外诊断(ce-ivd)、仅内部使用(iuo)等)、靶向标志物(面板)、参考基因组版本、消耗品、对照、qc阈值、报告基因和变体。adf提供了一种模块化方法来构建本地测序仪器的测定能力。测定软件可以由adf与测序仪器的平台软件分开提供。
271.使用adf进行测定配置的优点包含以下：
272.测定工作流和分析的封装
273.一键安装
274.由于docker实施的软件的模块化结构允许与平台软件分离，因此在软件更新后无需重新验证测定配置
275.多层加密确保安全传送
276.对原始设备制造商(oem)的测定配置的精简支持
277.精简的报告定制
278.支持区域调节要求
279.即插即用格式支持技术无关工作流
280.实现分子测试菜单的快速扩展和实验室的测定采用
281.在一些实施例中，测定定义文件(adf)可以包含用于以下步骤中的一个或多个步
骤的软件代码模块：1)文库制备；2)模板化；3)测序；4)分析；5)变异解释；和6)报告生成。对于文库制备和模板化的工作流步骤，adf可以包含用于制备文库、模板化和模板化珠富集的脚本。对于测序和分析的工作流步骤，adf可以包含用于关于图50所描述的分析流水线的算法二进制代码和参数的docker镜像包。对于变异解释的工作流步骤，adf可以包含可以用于对变异进行分析和注释的注释源列表。对于报告生成的工作流步骤，adf可以包含报告模板和镜像文件以供生成报告时使用。
282.adf可以包含用于控制测序仪器上的工作流步骤的仪器脚本。例如，脚本可以包含控制移取量和机器人控制的参数。仪器脚本可以针对特定测定进行定制。
283.例如，对于测序和分析步骤，adf可以包含端到端分析流水线的docker镜像。docker镜像可以包含用于分析流水线的每个步骤的算法的os特定文库和二进制文件。算法二进制文件可以包含分析流水线的步骤，包含信号处理、碱基识别、比对和变异识别，如关于图50所描述的那些步骤。在另一个实例中，adf debian文件可以打包用于特定测定的某些代码模块，如用于信号处理、碱基识别和rna计数的代码模块。
284.adf可以包含用于试剂盒配置的脚本。这些脚本支持计算测序运行所需的消耗品。adf中包含的配置脚本可以包含以下中的一项或多项：
285.条码集和芯片
286.文库试剂盒和消耗品，包含将样品控制配置(例如，样品在线控制)和其qc参数相关联的能力
287.模板试剂盒和消耗品，包含将内部对照和qc参数相关联的能力
288.测序试剂盒，包含将内部对照和qc参数相关联的能力
289.adf可以包含一个或多个参考基因组文件。参考基因组的实例包含hg19和grch38。参考基因组文件可以与工作流信息一起打包在主adf中。可替代地，参考基因组文件可以打包在作为主adf的补充的单独的adf中。
290.adf可以包含用于融合面板和融合目标区域面板的工作流的代码模块。adf可以包含用于分析的融合目标区域参考文件和热点文件。
291.adf可以包含用户可以配置的工作流的各个点处的测定参数。可配置参数可以在用户接口中显示以供用户调整。可以在任何参与者级别处添加新参数。可配置参数可以传递到分析流水线。可配置测定参数的输入格式可以包含一个或多个单串文本、布尔值(boolean)、多行文本、浮点、单选按钮、下拉菜单和文件上传。例如，文件上传可以使用如.properties和.json等文件格式。
292.adf可以包含用于质量控制的qc参数和工作流中各个点处的测定性能阈值。例如，qc参数的类型包含运行qc参数、样品qc参数、内部对照qc参数和测定特定qc参数。qc参数可以由数据类型(例如，整数、浮点数)、下限、上限和默认值中的一种或多种来定义。
293.adf可以包含针对给定测定选自数据库的结果呈现的指定数据选项卡列。所选择的数据选项卡列支持对结果的用户接口显示的配置以及要包含在用于测定的pdf报告中的列。adf可以包含给定测定的结果呈现的镜像文件。adf可以包含对pdf报告的多种语言的支持。adf可以包含要由分析流水线针对给定测定生成的任何文件的下载文件列表。样品或运行的文件列表可以在用户接口处显示。adf可以包含基因列表。基因列表可以用于在用户接口处和pdf报告中显示给定癌症类型的已知基因列表。
294.adf可以包含用于给定测定的一组插件。adf可以指定一组插件和其版本。如果adf没有指定插件的版本，则安装在服务器系统上的最新版本的插件可以用于给定测定。
295.adf可以包含新工作流模板以支持自定义测定创建。新工作流模板可以包含一组测定人字形步骤。可以显示步骤的参数。
296.adf可以包含注释源和集的列表以支持新注释集的配置。adf可以包含过滤器链以应用于由给定测定的分析流水线检测到的变异。adf可以包含用于注释变异的规则集。
297.adf可以被配置成支持多种不同类型的测定。实例包含但不限于肿瘤学相关测定(例如，来自赛默飞世尔科技公司的oncomine测定)、免疫肿瘤学相关测定(例如，t细胞受体(tcr)、微卫星不稳定性(msi)和肿瘤突变装载(tml))、感染病相关测定(例如，微生物组)、生殖健康相关测定和外显子组相关测定。adf也可以被配置用于定制测定。
298.图51是根据一实施例的生成测定定义文件的示意图。测定定义可以通过启动测定信息的文件复制和数据库填充以形成debian文件的build.sh、debscripts和makedeb.sh来生成。测定定义内容可以包含测定参数、bed文件(浏览器可扩展数据文件-bed文件-定义染色体位置或区域)、面板文件、基因列表、热点文件(定义基因中通常含有变异的区域的bed或vcf文件)和含有容许试剂的种子数据(seed data)。测定定义内容可以含有测定名称、描述和支持以不同语言显示测定信息的报告消息的本地化版本。测定定义文件可以支持新分析流水线的打包。adf可以包含可以基于测定类型执行变异识别、融合识别和cnv识别的任选的后处理脚本。adf可以包含用于对特定分析流水线的二进制文件进行更新的任选的docker容器镜像。docker容器镜像可以与adf一起打包，以确保平台更改，如操作系统或第三方文库不会影响测定结果或系统功能。
299.debian文件可以被序列化以防止未经授权的修改。序列化的测定定义可以使用高级加密标准(aes)进行进一步加密，高级加密标准是一种对称密钥算法。含有化测定元信息的文本文件也可以使用aes和相同的加密密钥进行加密。加密测定定义文件可以与加密元信息文件一起被压缩成zip格式。其它加密格式也可以应用于序列化测定定义信息。例如，元信息可以包含以下中的一项或多项：
300.分析流水线版本；
301.参考基因组文件位置的参考基因组路径；
302.测定唯一名称——用于检查系统中唯一出现的测定的内部名称；
303.docker镜像名称——用于启动分析和安装测定相关文件参考；
304.分析流水线启动所需的任何依存包名称。
305.图52是测定定义文件打包的实例的示意图。压缩格式的压缩化测定定义文件40可以包含序列化和加密测定定义debian打包41、序列化和加密元信息文本文件42以及序列化和加密的任选的docker镜像debian打包43。服务器系统可以在安装测定定义debian文件之前解密元信息文本文件42和测定定义序列化文件41。
306.服务器系统和模块化软件组件可以被配置成控制多种功能模式，包含ruo或ad模式和ivd或dx模式。参考图1，tomcat服务器可以被配置成包含用于ruo模式的web档案(war)文件和用于ivd模式的war文件。服务器系统可以被配置成包含用于通过ruo测定检测的变异的ruo变异组数据库和用于通过ivd测定检测的变异的ivd变异组数据库。服务器系统可以被配置成包含用于ruo模式和ivd模式的单独的分析流水线和相关联的kepler工作流引
擎。ruo测定的ruo docker镜像文件可以被配置为与ivd测定的ivd docker镜像文件分开的文件。关系数据库可以被配置成具有分离数据库：用于ruo模式的测定开发(ad)数据库和用于ivd模式的dx数据库。最初仅支持ruo模式的服务器系统可以被配置成通过软件更新支持ruo和ivd模式。
307.对于ruo模式测定和ivd模式测定，可以单独地生成adf。ruo模式adf可以包含研究中所使用的测定的测定定义。ruo模式adf可以由第三方开发。ivd模式adf包含符合区域诊断使用监管要求的测定定义。
308.测定
309.自动测序仪器可以适于与多种靶向测定一起使用。例如，靶向测定可以利用化学物质，如ion ampliseq、ion ampliseq hd以及其它化学物质。例如，自动测序仪器可以适于与测定如rna-seq、diff-seq或s1-seq以及其它文库制备测定一起使用。其它示例测定包含oncomine癌症测定，例如ocav3、oncomine焦点测定或oncomine tcrβ-lr测定等。
310.所述测定可以与来自拭子、血液、ffpe组织样品、cftna以及其它来源的核酸一起使用。核酸可以呈dna或rna的形式，任选地转化为cdna。
311.测定可以有许多引物对，例如在10到24000的范围内。在一实例中，引物对的数量可以在100到1000的范围，如100到500的范围或150到300的范围内。在另一实例中，引物对的数量在300到5000的范围，如400到4000的范围内。
312.所述测定可以产生平均扩增子大小在50到500的范围，如50到200的范围或75到125的范围内的文库。在另一实例中，扩增子大小可以在200到500的范围内，如200到400或200到300。
313.测定可以在单个池中进行或可以利用多个池。例如，测定可以使用单个dna池。在另一实例中，测定利用两个dna池。在另外的实例中，测定利用两个rna池。在特定实例中，测定利用两个dna池和两个rna池。
314.预接种(或接种)和模板化
315.通常，在对核酸进行分析(例如，测序)之前，增加核酸的量以对分析中生成的信号进行最佳检测。通常，通过扩增生成许多核酸拷贝，称为扩增子。这些拷贝通常被称为分析模板。例如，在合成测序方法中，扩增子用作核苷酸聚合的模板，核苷酸聚合被检测到并且为序列确定提供数据。在一些情况下，同时扩增两个或更多个、或多个不同的核酸序列，并且然后还可以同时测序。例如，在同时扩增不同核酸的一些方法中，使用一对通用引物进行扩增，所述引物与存在于被扩增的核酸群体中的不同核酸中的每个核酸中的序列互补，但是被扩增群体的不同核酸中的序列的其余部分在每种核酸中不同(即，多克隆核酸群体)。在此类情况下，通常期望从每种不同核酸生成的扩增子的单克隆性，因为多克隆群体中不同核酸分子的不同特性可能会使测定例如测序、数据的解释复杂化。
316.在本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒的一些实施例中，待分析的核酸在进行分析之前被扩增。在一些实施例中，待分析的核酸被克隆扩增以生成单克隆或基本上单克隆核酸扩增子群体，例如在核酸模板化过程中。在一些实施例中，多个核酸的多克隆群体内的不同核酸被克隆扩增以生成不同核酸的定界单克隆或基本上单克隆群体。
317.在本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒
的一些实施例中，样品中的核酸分子用于制备适合于下游测序的核酸分子的集合或文库。一些实施例包含在文库制备之前、期间或之后的靶标富集步骤。可例如通过多重核酸扩增或杂交来富集包含靶基因座或所关注区域的靶核酸分子。各种方法可以用于进行多重核酸扩增以生成扩增子，如多重pcr，并且可以用于本发明方法的实施例中的任何实施例中。通过任何方法进行富集后，可以进行通用扩增反应。
318.在本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒的一些实施例中，待分析(例如，测序)的一种或多种核酸在模板化过程中被扩增以生成单克隆或基本上单克隆模板核酸群体。模板化方法组合本文所提供的设备、装置、系统、组合物和试剂盒并入用于生成、含有、分离、转移、复制或操纵基本上单克隆核酸群体的方法和组合物，所述方法和组合物是快速的、有效的且节约成本的，同时提供相较于现有方法，显著增加了高质量核酸测序读段或较长长度的核酸测序读段的产生和减少了重复、无信息、错误或空白读段的数量，并且缩短了运行时间。在一些实施例中，模板化过程生成一种或多种单克隆或基本上单克隆模板核酸群体，其中核酸连接到一个或多个表面或载体，例如固体载体或表面。可通过任何方法，包含但不限于物理吸附，通过离子或共价键形成或其组合，将模板核酸分子固定于表面或载体上。在一些实施例中，载体或表面上的位点预接种有来自核酸集合(例如，核酸文库，扩增的靶标或核酸文库或样品的部分)的一个核酸分子或有限数量的主要基本上相同或单克隆核酸分子以提供连接到单个核酸分子或定位的基本上单克隆核酸群体的单个载体或位点(例如，可以在下游测序方法中明确分析的连接位点)。此类预接种的载体或表面易于操纵并且用作例如单独的单个核酸分子或两个或更多个基本上相同的或单克隆核酸分子的清洁、封闭、包含或分离的来源，其可以被克隆扩增，例如，在模板化反应中，生成相对纯净、封闭、包含或分离的核酸模板集合，用于高通量测序工作流程以改进测序结果。因此，在本文所提供的操纵核酸的方法的一些实施例或方面中，例如，在高通量测序工作流程中，预接种反应在模板化反应之前或同时进行。
319.在本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒的一些实施例中，模板核酸在表面或载体例如固体表面或载体上的扩增在两个或更多个反应中进行，包含例如一种或多种预接种反应，所述一种或多种预接种反应生成具有与其连接的一个模板核酸分子或与其连接的基本上单克隆模板核酸分子群体的一种或多种预接种载体或表面位点，然后在预接种的载体或位点上进行一种或多种模板化反应，所述一种或多种模板化反应在一种或多种载体或位点上生成一个或多个所连接的模板核酸分子的拷贝(例如，至少多10
×
拷贝)。因此，在一些实施例中，模板化反应混合物包含一种或多种预接种的载体或表面。进行预接种反应和模板化反应的优点是，这个工作流程在高通量测序反应中生成更高质量的测序读段。在一些实施例中，将核酸分子直接扩增到载体上，如包含多个位点的载体上的位点、珠粒或微粒、或阵列的反应室。例如，可以将核酸分子预接种到反应位点或反应室(例如，孔或微孔)中的载体上或者可以在溶液中以散装形式预接种到载体上，然后分配到例如固体载体或表面上的反应位点中。不同位点任选地是阵列位点的成员。阵列可包含表面上(例如，流通池、电子装置、电晶体芯片、反应室、通道和其类似物的表面)的二维位点阵列、或基质或其它介质(例如，固体、半固体、液体、流体和其类似物)内的三维位点阵列。在一些实施例中，孔或反应位点含有每个孔或反应位点的一个预先接种的载体。在一些实施例中，连接到已分布到孔或反应位点的预先接种的载体的模板核酸然
后经历一个或多个模板化反应，其中模板在载体上被扩增以生成单克隆或基本上单克隆模板核酸群体。可替代地，在预接种反应之前将核酸定位、沉积或定位在不同位点处。在一个实例中，可以将载体分配到孔阵列中，并且可以将核酸分子预接种在固体载体上同时将其原位保持在孔阵列中。在一些实施例中，已预先接种到孔或反应位点中的载体上的模板核酸然后经历一种或多种模板化反应，其中模板在载体上被扩增以生成模板核酸的单克隆或基本上单克隆群体。在一些实施例中，用于核酸扩增的方法包含一个或多个、或两个或更多个、或多个或一群表面或载体。
320.在一些实施例中，本文所提供的预接种(或接种)方法包含将核酸分子(例如，单链核酸)与和载体或表面结合且固定于其上的互补核酸，例如寡核苷酸或引物杂交。此类方法通常在退火条件下在短时间段内进行。在一些实施例中，接种方法涉及在其中载体例如固体载体，如珠粒、颗粒或表面上的位点将与仅一个核酸分子连接的条件下杂交。此类条件包含例如使核酸(例如，来自文库、核酸文库或核酸样品的扩增靶标或部分)群体与相对于核酸分子数量大量过量的载体或位点在退火条件下接触。例如，在一些实施例中选择载体与核酸分子(或位点与核酸分子)比率以优化具有单个模板多核苷酸分子或与其连接的单克隆或基本上单克隆模板核酸分子群体的载体的百分比。例如，可以用以下的载体与模板核酸分子(或位点与核酸分子)比率进行预接种：至少约1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1或100:1。在一些实施例中，预接种(或接种)方法进一步包含在模板核酸与固定在载体上的引物杂交之前或同时对文库或样品核酸进行操作(例如，转化)。此类操作可以包含例如添加一种或多种衔接子核苷酸序列或核酸扩增。
321.在一些实施例中，使用预接种反应混合物，在预接种(或接种)反应期间形成一种或多种预接种的载体。在一些实施例中，预接种反应混合物包含以下中的一些或全部：核酸分子群体、一种或多种载体或表面、聚合酶、第一引物群体、核苷酸、第二引物群体、二价阳离子或扩散限制性药剂。在一些实施例中，预接种反应混合物包含一个或多个或至少两个核酸分子，所述核酸分子可以具有相同或不同的序列、第一引物群体(其可以在或可以不在溶液中或其中一些可以在溶液中并且其中一些可以固定在载体上)、第二引物群体(其可以在或可以不在溶液中)和任选地一种或多种载体或表面。在一些实施例中，在预接种反应期间的特定时间将一种或多种载体或表面引入反应混合物中，例如，在待连接到载体或表面的核酸分子的一个或多个扩增循环之后。在一些实施例中，一种或多种载体或表面具有与其连接的第一引物群提或包含在第一引物中的序列群体。在一些实施例中，载体中的至少一种、一些或所有包含彼此基本上相同的第一引物群体或包含在第一引物中的序列群体。在一些实施例中，载体上的所有引物彼此基本上相同或所有包含基本上相同的第一引物序列或包含在第一引物中的序列。在一些实施例中，载体中的至少一个包含与其连接的两种或更多种不同引物。例如，至少一种载体可以包含第一引物群体或包含在第一引物中的序列群体和第二引物群体。载体可以与通用引物连接。通用引物与反应混合物内的所有或基本上所有模板核酸分子任选地杂交(或能够杂交)。反应混合物可包含与第一靶标特异性引物共价连接的第一载体和与第二靶标特异性引物共价连接的第二载体，其中第一和第二靶特异性引物彼此不同。任选地，第一靶标特异性引物与第一靶核酸序列基本上互补，且第二靶标特异性引物与第二靶核酸序列基本上互补，且其中第一和第二靶核酸序列不同。在一
些实施例中，反应混合物包含多个不同载体或表面，例如预接种反应混合物包含一种或多种珠粒(如颗粒、纳米颗粒、微粒等)，并且将至少两种不同的模板核酸分子连接到不同珠粒上，由此形成至少两种不同的珠粒，其中的每一个与不同模板核酸分子连接。在一些实施例中，预接种反应混合物包含单个表面(例如平面样表面、流通池或反应室阵列)，并且将至少两种不同的模板核酸分子扩增到表面上的两个不同的区域、位点或位置上，由此形成与两种或更多种模板核酸分子连接单个表面。在一些实施例中，载体或表面包含第二引物的多个实例，并且所述方法包含使至少一个延伸的第一引物链与载体或表面的第二引物杂交，如在桥式pcr中。在一些实施例中，预接种反应混合物包含一个或多个、多个或一群核酸分子，例如双链或单链核酸，和一个或多个、或多个具有与其连接的多个第一引物或多个包含在第一引物中的序列的载体或表面，其中核酸分子含有与第一引物(即第一引物结合序列)基本上互补或基本上相同的核苷酸序列，并且预接种反应混合物任选地包含聚合酶和核苷酸。在一些实施例中，预接种反应混合物进一步包含可以在溶液中的第二引物。核酸分子可以任选地含有第二引物结合序列。在一些实施例中，反应混合物包含与模板核酸分子内的序列结合的第一引物群体和第二引物群体。第一引物群体可以是相同的或基本上相同的拷贝或不同的序列。第二引物群体可以是相同的或基本上相同的拷贝或不同的序列。在一些实施例中，第一引物群体和任选的第二引物群体是通用引物(或含有通用引物的序列)，并且第一引物的所有拷贝是相同的并且第二引物的所有拷贝是相同的。因此，在一些实施例中，第一引物群体和第二引物群体两者均是结合模板核酸分子上的通用引物结合序列的通用引物(或含有通用引物序列)。在一些实施例中，预接种反应混合物包含重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。
322.在一些实施例中，预接种或模板化反应使用一种或多种能够催化核苷酸聚合的酶。在本文所提供的实施例中的任何实施例中，一种或多种能够聚合的酶包含至少一种聚合酶。在一些实施例中，用一种类型的聚合酶或连接酶或其混合物来进行反应。在一些实施例中，所述至少一种聚合酶包含热稳定或热不稳定的聚合酶。在一些实施例中，所述至少一种聚合酶包含dna或rna聚合酶或其突变版本的保持足够的催化活性以在任何适合条件下聚合或并入至少一种核苷酸的生物活性片段。聚合酶任选地可具有或缺乏核酸外切酶活性。在一些实施例中，聚合酶具有5'到3'核酸外切酶活性、3'到5'核酸外切酶活性或两个。在一些实施例中，聚合酶缺乏此类核酸外切酶活性中的任一个或多个。聚合酶的实例包含taq dna聚合酶、t7 dna聚合酶、sau dna聚合酶、bst dna聚合酶、bsu dna聚合酶、klenow以及其片段和衍生物。在一些实施例中，聚合酶具有链置换活性。示例性聚合酶是bst dna聚合酶(exonuclease minus)，其是一种登录号2bdp_a中例示的67kda嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)dna聚合酶蛋白(大片段)，其具有5'到3'聚合酶活性和链置换活性但缺乏3'到5'核酸外切酶活性。其它聚合酶包含来自水生栖热菌(thermus aquaticus)的taq dna聚合酶i(由登录号1taq例示)、来自大肠杆菌(escherichia coli)的eco dna聚合酶i(登录号p00582)、来自超嗜热菌(aquifex aeolicus)的aea dna聚合酶i(登录号067779)或其功能片段或变体。另一种示例性聚合酶是bsu dna聚合酶(大片段(neb))。bsu dna聚合酶i大片段保留枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)dna聚合酶i(1)的5'到3'聚合酶活性但缺乏5'到3'核酸外切酶结构域。在某些实施例中，bsu dna聚合酶大片段缺乏3'到5'核酸外切酶活性。在某些实施例中，例如，在反应包含rpa的情况下，一种或多
种能够聚合的酶包含t5或t7 dna聚合酶。在一些实施例中，能够进行聚合的一种或多种酶包含具有降低3'到5'核酸外切酶活性的一种或多种氨基酸突变的t5或t7 dna聚合酶。在一些实施例中，具有降低3到5'核酸外切酶活性的一种或多种氨基酸突变的t5或t7 dna聚合酶不含有干扰t5或t7 dna聚合酶的持续合成能力的氨基酸突变。在一些实施例中，t5或t7 dna聚合酶包含消除可检测的3'到5'核酸外切酶活性的一种或多种氨基酸突变；且其中所述一种或多种氨基酸突变不干扰t5或t7 dna聚合酶的持续合成能力。在某些说明性实施例中，预接种或模板化反应混合物包含sau聚合酶、3'到5'核酸外切酶活性降低的t7 dna聚合酶、bsu聚合酶或其组合，这些特别适用于rpa反应。
323.预接种反应混合物以及本文中所提供的方法中的任何其它扩增反应(包含模板化反应混合物)，可以包含被聚合酶用作延伸反应的基板的核苷酸或其类似物源。在一些实施例中，预接种反应混合物包含用于模板核酸分子的链延伸由此产生与一种或多种载体连接的模板核酸分子序列的一个或基本上单克隆群体的核苷酸(dntp)。在一些实施例中，核苷酸未被外部标记。例如，核苷酸可以是不包含荧光部分、染料或其它外来光学可检测标记的天然存在的核苷酸或合成类似物。任选地，核苷酸不包含终止核酸合成的基团(例如双脱氧基团、可逆终止子和其类似物)。在其它实施例中，核苷酸包含标记或标签。在一些实施例中，预接种或模板化反应混合物包含一种或多种辅因子。辅因子包含例如增强或调节另一种反应组分例如酶的活性的组合物。在一些实施例中，辅因子包含一种或多种二价阳离子。二价阳离子的实例包含镁、锰和钙。在各个实施例中，预接种或模板化反应混合物包含含有一种或多种二价阳离子的缓冲液。在说明性实施例中，缓冲液含有镁或锰离子。在一些实施例中，通过添加辅因子，尤其是二价阳离子来引发预接种反应或模板化反应。在一些实施例中，本文中用于核酸扩增所使用的预接种或模板化反应混合物可以包含至少一种辅因子，以用于在核酸上进行重组酶组装或用于同源核酸配对。
324.在一些实施例中，预接种反应包含(i)多个核酸分子，其在一端或两端包含靶序列和一个或多个衔接子序列(例如，通用衔接子序列)；(ii)多个可溶性正向引物；(iii)多个可溶性反向引物(其可以是封闭或带尾引物)；以及(iv)多个固体载体(例如包含在反应开始或反应过程中的任何其它时间)，其上固定有与衔接子序列或反向引物内所含序列的互补杂交的捕获引物。在一些实施例中，在具有含相同或不同靶序列的多个核酸分子的单一反应混合物中，进行预接种或模板化反应。在一些实施例中，从样品生成的个别核酸分子包含在末端处与至少一个通用衔接子序列(例如a-衔接子或p1-衔接子序列)接合的靶序列。在一些实施例中，核酸分子是具有互补顶部和底部链的双链分子。在一些实施例中，使用与衔接子序列杂交的正向和反向可溶性引物，进行预接种反应，以扩增核酸分子的一个或单克隆或基本上单克隆拷贝并且将其连接到固体载体(参见例如，图4)。尽管图4描绘单一反应混合物内的单一双链核酸分子和单一珠粒的一系列反应，相同单一反应混合物可以含有进行同一系列反应的多个双链核酸分子和多个珠粒，以生成至少两个珠粒，每个珠粒连接有一个模板核酸或单克隆或基本上单克隆模板群体。另外，珠粒可以连接到多个b捕获引物。进一步地，图53的下侧描绘与b捕获引物结合的生物素标记的引物延伸产物，但非生物素标记的引物延伸产物可结合b捕获引物。此外，生物素标记和非生物素标记的引物延伸产物的混合物可与和珠粒连接的多个b捕获引物连接。在一些实施例中，单一反应混合物含有多个核酸分子，其中具有相同或不同靶序列的个别核酸分子与至少一个通用衔接子序列连
接。
325.参考如图53所描绘的说明性方法，使具有顶部和底部链的核酸分子变性，并且在使用可溶性引物(例如，可溶性a引物)和可溶性封端的带尾引物(例如，可溶性封端的带尾p1/b引物)的引物延伸反应中，使用分开的顶部和底部链，以在预接种或模板化反应期间，生成具有可以结合所固定的b引物的衔接子序列的多个引物延伸产物。归因于顶部和底部链的不同序列和取向与所使用引物的差异，引物延伸反应生成两条链的不同产物。在第一引物延伸反应中，使用结合a引物结合位点的可溶性引物，生成底部链的互补链。出于说明的目的，在图53(左侧)中，可溶性a'引物与a衔接子序列互补。在一些实施例中，使用具有变化长度的可溶性a'引物的混合物来进行第一引物延伸反应。可溶性a'引物的混合物的其5'端、3'端或5'和3'端两个处的长度可变化。例如，引物混合物s(在有或没有5'生物素加合物(在图53中描绘为“bio”)的情况下，a'引物的混合物，其可以包含各种长度的5'非互补序列)可以用于引物延伸反应中，以视使用哪种可溶性a'引物来进行第一引物延伸反应而定，生成若干可能的第一延伸产物中的一个(图53左侧)。例如，在5'到3'方向上，第一延伸产物含有互补a-衔接子序列(在图53左侧中示出为a')、互补底部序列(在图53左侧中示出为底部')和互补p1序列(在图53左侧中示出为p1')。在一些实施例中，在第二引物延伸反应中，第一延伸产物中的新合成的p1'序列可与可溶性p1引物结合，以允许从第一引物延伸产物的p1'序列的3'端进行引物延伸。可溶性p1引物可以是带尾引物。可溶性p1引物可在其3'端处携带封端部分，其中所述封端部分可抑制从引物的3'端进行引物延伸。封闭的引物可以防止在预接种反应期间形成引物二聚体扩增子，这可以生成较低质量的测序读段并且减少来自模板核酸分子的测序读段的数量。可溶性p1引物可以是反向带尾p1引物，其包含所连接的5'b衔接子序列，使得使用带尾引物p1作为模板，第一延伸产物的引物延伸引起向3'端添加b序列的互补序列(在图53左侧中描述为b')。在说明性实施例中，可溶性p1引物可具有3'封闭端(在图53左侧中，显示为带圈的“x”)，以防止从可溶性p1引物的3'端延伸(图53左侧)。视在第一延伸反应中使用哪种可溶性a'引物而定，第二引物延伸反应可生成具有各种长度的多个第二延伸产物。在5'到3'方向上，多个第二延伸产物含有互补a-衔接子序列(在图53左侧中示出为a')、互补底部链序列(在图53左侧中示出为底部')、互补p1序列(在图53左侧中示出为p1')和互补b衔接子序列(在图53左侧中示出为b')。第二引物延伸产物可以包含或缺乏5'生物素加合物(图53左侧)。第二延伸反应可生成多个第二延伸产物，所述多个第二延伸产物具有不同长度，且可包含或缺乏生物素加合物，且包含b'衔接子序列。这些第二延伸产物中的任一个可与固定于固体表面(珠粒)的b捕获序列结合/杂交。所固定的b引物可以进行第三引物延伸反应，由此生成固定于珠粒且与第二延伸产物互补的第三延伸产物(图53下侧)。图53的右侧描绘双链核酸进行变性和顶部链的一系列反应。在一些实施例中，顶部链的p1'衔接子序列可以结合可溶性p1引物，且进行第一引物延伸反应，以生成第一延伸产物(图53右侧)。在一些实施例中，可溶性p1引物是带尾引物。可溶性p1引物可以在其3'端处携带封端部分，其中所述封端部分可抑制从引物的3'端进行引物延伸(图53右侧)。可溶性p1引物可以是带尾p1引物，其包含所连接的5'b衔接子序列，使得使用带尾引物p1作为模板，引物延伸引起向第一延伸产物的3'端添加b序列的互补序列(b')(图53右侧)。在说明性实施例中，可溶性p1引物可以具有3'封端端(在图53右侧中，显示为带圈的“x”)，以防止从p1引物的3'端延伸(图53右侧)。第一引物延伸反应生成多个第一延伸产物，所述
多个第一延伸产物在5'到3'方向上含有a'衔接子序列、顶部链序列、p1'衔接子序列和b'衔接子序列(图53右侧)。包含b'衔接子序列的第一延伸产物可与固定于固体表面(珠粒)的b捕获序列结合/杂交。所固定的b引物可进行第二引物延伸反应，由此生成固定于珠粒且与第一延伸产物互补的第二延伸产物(图53下侧)。
326.在一些实施例中，可如图54所图示进行预接种(或接种)反应。在这个实例中，在具有捕获引物的珠粒载体存在下，扩增靶多核苷酸b-a'和其互补序列模板多核苷酸(a-b')。靶多核苷酸具有与和珠粒载体偶联的捕获引物的序列相同或基本上类似的捕获部分(b)。基本上类似序列是其互补序列可与基本上类似序列中的每一个杂交的序列。珠粒载体可具有与靶多核苷酸的b部分的序列相同的序列或基本上类似的序列的捕获引物，以准许靶多核苷酸的捕获部分(b)的互补序列与和珠粒载体连接的捕获引物杂交。任选地，靶多核苷酸可包含与靶多核苷酸的捕获部分(b)相邻的第二引物位置(p1)，且可进一步包含与引物相邻且通过互补序列部分(a')与靶多核苷酸的测序引物部分(a)结合的靶区域。当在包含捕获引物的珠粒载体存在下扩增时，与靶多核苷酸互补的模板多核苷酸可与捕获引物(b)杂交。靶多核苷酸可残留于溶液中。系统可进行延伸，其中使与模板多核苷酸互补的捕获引物b延伸，得到与珠粒载体结合的靶序列。在具有捕获引物的载体存在下，可以在此阶段进行一次或多次另外的扩增。可在游离引物(b)、珠粒载体和具有与其连接的接头部分(l)的游离修饰的测序引物(a)存在下，进行一种或多种另外扩增。引物(b)和修饰的引物(l-a)可干扰游离浮动靶多核苷酸和模板多核苷酸，妨碍其与珠粒载体结合和彼此结合。具体地，具有与其连接的接头部分的修饰的测序引物(a)可与和珠粒载体连接的靶多核苷酸的互补部分(a')杂交。任选地，可使与靶多核苷酸杂交的接头修饰的测序引物l-a延伸，形成接头修饰的模板多核苷酸。与连接到珠粒载体的靶核酸杂交的此类接头修饰的模板多核苷酸然后可以被磁性珠粒捕获，并且用于连接到珠粒的靶多肽的磁性螯合(富集)并将其装载到测序装置中。可使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；pcr)扩增、重组酶聚合酶扩增(rpa)或其它扩增技术，进行扩增或延伸。在特定实例中，使用pcr扩增进行图5中图示的方案的每一步骤。尽管图54描绘单一反应混合物内的单一双链核酸分子和单一珠粒的一系列反应，相同单一反应混合物可以含有进行同一系列反应的多个双链核酸分子和多个珠粒，以生成至少两个珠粒，每个珠粒连接有一个模板核酸或单克隆或基本上单克隆模板群体。
327.在一些实施例中，可如图55所图示进行预接种(或接种)反应。在这个实例中，替代方案包含靶多核苷酸(p1-a')和其互补序列模板多核苷酸(a-p1')。在包含接头修饰的测序引物(l-a)和具有含捕获引物(b)的序列的部分的截短的p1引物(trp1)的溶液中，扩增靶多核苷酸和模板多核苷酸。在实例中，截短的p1引物(trp1)包含p1序列的子集或所有序列p1。随后在接头修饰的测序引物(l-a)和截短的p1引物(trp1-b)存在下扩增期间，物种包含可操作以与具有捕获引物(b)的珠粒载体杂交的接头修饰的模板多核苷酸(l-a-b')。因此，接头修饰的模板多核苷酸(l-a-b')与珠粒上的捕获引物(b)杂交，且延伸以形成与珠粒载体连接的靶多核苷酸(b-a')。可使用与连接珠粒的靶多核苷酸杂交的接头修饰的模板多核苷酸来与磁性珠粒连接，其例如可用于实施将珠粒磁性装载到测序装置中或用于富集与珠粒连接的核酸。接头修饰的模板多核苷酸的接头部分可采用各种形式，如生物素，其可与和磁性珠粒连接的接头部分结合，如抗生蛋白链菌素。扩增反应中的每个扩增反应可以使用聚合酶链式反应(pcr)、重组酶-聚合酶扩增(rpa)或其它扩增技术进行。在图55所展示的实例
中，所述方案可以使用两个或三个pcr循环来实施。这系列的pcr反应产生较高百分比的具有与其连接的单一靶多核苷酸的珠粒载体。因此，可以生成更多的单克隆群体，例如在模板化反应中，例如在测序装置的孔中。尽管图55描绘单一反应混合物内的单一双链核酸分子和单一珠粒的一系列反应，相同单一反应混合物可以含有进行同一系列反应的多个双链核酸分子和多个珠粒，以生成至少两个珠粒，每个珠粒连接有一个模板核酸或单克隆或基本上单克隆模板群体。
328.在一些实施例中，可以如图56所展示的进行预接种(或接种)方法。在此实例中，所述方法被设计成从一系列扩增循环生成期望的载体连接的核酸分子，其中所述扩增产物中的仅一种扩增产物(其是期望的靶核酸)将与载体连接。期望的靶标含有与核酸的5'端连接的接头部分，例如生物素(在图56中，用字母l标记)；和在3'端处与固定于载体上的引物(在图56中，用字母b标记)互补的衔接子核苷酸序列(在图56中，用字母b'标记)。相比之下，图55所示的方法生成与载体杂交的两种核酸扩增产物，所述核酸扩增产物中的仅一种核酸扩增产物具有期望的接头部分。在生成仅一种将与载体连接的扩增产物方面，图56中描绘的方法避免产生不含有期望的靶核酸(例如将不用于下游分析的缺乏接头部分)的载体。因此，这种方法避免过度使用载体和核酸，并且确保仅单个核酸靶分子将与载体杂交，所述载体是维持高水平单克隆，随后使用具有仅一个与其结合的核酸模板的载体进行模板化扩增所期望的。如图56中所展示的，双链文库核酸(例如，文库核酸)含有在每个端处的不同衔接子序列，示出为在5'端处的a衔接子序列和在3'端处的p1衔接子序列(例如，标准ion torrent a和p1文库衔接子；赛默飞世尔科技公司)。为开始接种过程，文库核酸在引物存在下进行一个循环扩增(即变性、引物退火和引物延伸)，如图56所示。用于扩增的示例性引物是生物素化引物a(正向引物)和反向融合引物。融合引物(例如，图56中标记为trp1的引物)是与靶核酸3'端的衔接子序列的一部分互补的序列和与固定在载体上的b引物的序列相同的b引物序列的融合物。在图56所示的实例中，trp1是具有seq id no:1的序列的ion p1衔接子的23聚体片段。融合引物将在接近于文库插入序列的文库核酸分子的3'衔接子序列的内部部分处杂交和引发，并且不在文库核酸的极限3'端处与衔接子序列的其余部分杂交。这在融合引物序列与文库核酸上的衔接子的极限3'端部分之间形成错配端。如图56中所示，在两个扩增(例如，pcr)循环之后，尽管生成四个扩增产物，但仅一个产物将能够接种(或杂交)载体(例如，离子球形颗粒)。因此，在扩增产物的随后变性后，所述产物中的仅一种产物的单链将与载体上的b引物杂交。这个引物可以延伸，以形成双链模板核酸，其中一条链含有可以例如用于将载体结合的核酸与磁性珠粒结合的接头部分，所述磁性珠粒用于模板珠粒的富集或将其磁性装载到测序装置中。尽管图56描绘单一反应混合物内的单一双链核酸分子和单一载体的一系列反应，相同单一反应混合物可以含有进行同一系列反应的多个双链核酸分子和多个载体，以生成至少两个载体，每个载体连接有模板核酸。
329.本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒的某些实施例包含用于生成具有特定核苷酸序列的核酸模板的方法。此类方法特别用于用单一核酸预接种一个或多个、两个或更多个、或多个载体或表面。在一个实施例中，用于生成具有特异性核苷酸序列的核酸模板的方法包含：(a)获得核酸或初始多个或一群核酸，所述核酸含有核酸链，所述核酸链具有在所述核酸链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述核酸链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连
续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一连续核苷酸序列和所述第二连续核苷酸序列彼此不同，并且其中所述第一连续核苷酸序列在多个或一群核酸中基本上相同，并且第二连续核苷酸序列在多个或一群核酸中基本上相同；(b)在存在第一引物和第二引物的情况下，使所述核酸或所述初始多个或一群核酸经受核酸扩增循环，其中所述第一引物包含与所述第一连续核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列，并且所述第二引物包含：(i)与所述第二连续核苷酸序列在所述第二连续核苷酸序列的5'端处的部分互补的核苷酸序列；以及(ii)不与所述第二连续核苷酸序列互补并且与和所述第二连续核苷酸序列在所述互补序列的3'端处的所述部分互补的序列连接的第四核苷酸序列，并且所述第二引物不含与所述二连续核苷酸的序列的3'端互补的核苷酸序列；(c)在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使(b)的核酸扩增循环的产物经受核酸扩增循环以生成多种不同核酸产物，其中在步骤(a)中，核酸或初始多个或一群核酸中的每个单独核酸的核酸扩增的多个不同核酸产物中的仅一种核酸产物包含与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。当步骤(a)包含初始多个核酸或一群核酸时，所述方法生成不同的核酸群体，其中每个核酸包含与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些实施例中，所述方法进一步包括在存在第一引物和第二引物的情况下，使(c)的核酸扩增循环的产物经受一个或多个核酸扩增循环以生成含有与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的另外核酸产物。在一些实施例中，使步骤(a)中所述的核酸群体在存在一种或多种正向引物和反向引物的情况下经受两个或更多个核酸扩增循环，以生成其中基本上所有或所有产物包含与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸产物，所述一种或多种正向引物包括与所述第一连续核苷酸序列基本上相同的寡核苷酸序列，所述反向引物在3'端处被封端且包括与所述第二连续核苷酸序列互补的寡核苷酸序列，其在所述寡核苷酸序列的5'端处与不和所述第二连续核苷酸序列互补的所述第四核苷酸序列连接。在用于生成具有特异性核苷酸序列的核酸模板的方法中的任何方法的一些实施例中，正向或第一引物包含含有与其连接的修饰的核苷酸。在一些实施例中，与经修饰核苷酸的连接包括接头部分，例如生物素。在一些实施例中，第四核苷酸序列的序列与固定在一个或多个载体或表面或表面上的位点上的引物序列基本上相同，并且所述方法可以进一步包含通过与固定的引物杂交，将包括与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的产物与一个或多个载体、表面或表面上的位点连接。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过从不与所述载体结合的任何其它核酸去除所述载体来分离与所述载体连接的所述核酸链。
330.在用于生成具有特异性核苷酸序列的核酸模板或具有特异性核苷酸序列的两个或更多个核酸模板的群体的方法的一些实施例中，引物中的一个或多个包含含有与其连接的修饰的核苷酸。例如，在一些实施例中，正向引物或第一引物或反向或第二引物包含含有与其连接的修饰的核苷酸。在一些实施例中，与经修饰的核苷酸的连接包含接头部分，例如生物素。在一些实施例中，引物中的一个或多个(正向引物或第一引物)包含与第一核苷酸序列基本上相同的3'端核苷酸序列、5'端核苷酸序列和位于3'端核苷酸序列与5'端核苷酸序列之间的不可复制部分。在其中正向引物或第一引物是包含在与第一核苷酸序列基本上相同的3'端核苷酸序列与5'端核苷酸序列之间的不可复制部分的正向引物或第一引物的实施例中，来自最终核酸扩增的包含与第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的仅一种产物还包含在5'端处的包含不可复制部分和第一引物的5'端核苷酸序列的单链区域。在一些实施例中，所述方法进一步包含在退火条件下将最终扩增循环的产物的单链核酸与和第四核苷
酸序列基本上相同的单链寡核苷酸组合或接触，由此将包含与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的所述产物与和所述第四核苷酸序列基本上相同的所述单链寡核苷酸杂交，以生成部分双链核酸。在一些实施例中，与第四核苷酸序列基本上相同的单链寡核苷酸与一个或多个、或多个载体或表面或表面上的位点连接。在一些实施例中，所述载体是固体载体。在特定实施例中，所述载体是颗粒或珠粒。在一些实施例中，所述方法进一步包含使部分双链核酸的寡核苷酸部分的3'端延伸，由此通过合成包含与第四核苷酸序列基本上相同的并且具有与和其杂交的产物互补的核苷酸序列的单链寡核苷酸的核酸链生成延伸的双链核酸。在一些实施例中，包含与所述第四核苷酸序列基本上相同的所述单链寡核苷酸的所述核酸链，在所述链的5'端处，通过所述链的作为所述寡核苷酸序列的部分与载体连接。在一些实施例中，所述方法进一步包含通过收集载体或从未与载体结合的任何其它核酸或反应组分中去除其来分离与载体连接的核酸链。
331.在一个实施例中，用于预接种或接种载体的方法包含(a)获得含有核酸链的核酸，所述核酸链具有所述核酸链的5'端处的第一连续核苷酸序列，在所述核酸链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一连续核苷酸序列与所述第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列；(b)在存在捕获引物的情况下，使核酸经受核酸扩增循环，其中捕获引物包含与所述第二连续核苷酸序列互补的核苷酸序列并与载体连接；(c)在存在不与载体连接的捕获引物和包含与所述第一连续核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的第一引物的情况下，使(b)的核酸扩增产物经受核酸扩增循环。在一些实施例中，第一引物与接头部分连接。
332.在一些实施例中，预接种(或接种)方法基本上如图54-56中所展示执行，其中在所述方法中添加一个或多个扩增(例如，pcr)循环。因此，在采用多个扩增循环(例如，pcr)的任何此类预接种方法中，预接种方法中可以包含两个或更多个，例如3、4、5个或更多个扩增循环。例如，在最大可能的核酸文库输入低于最佳范围的情况下，接种过程中可包含另外的扩增循环以生成足够量的模板接种载体，其可用于另外的方法，包含，例如，模板化扩增以生成基本上单克隆核酸模板群体和下游测序过程。此类情况可以包含，例如，由文库制备方法导致的低于预期的文库浓度。虽然在这种情况下，可以通过扩大接种反应将文库模板拷贝数增加到更优化的水平，以适应更大的文库输入量，但由于反应容器或处理中的体积限制，这有时不是可用的选择。在预接种方法中的任何点，例如在将具有连接到其上的寡核苷酸引物的载体引入扩增方案之前或之后，可以包含增加数量的扩增循环。例如，参考图56中描述的方法，如果在将载体引入反应混合物的点之前包含另外的扩增循环，则总共四种扩增产物将产生核酸链这将与载体上的b引物杂交，相比之下，只有一种产物会产生一条链，如所示的方案中没有添加另一个扩增循环。此外，四个产物链中的每一个将包含连接到核酸的5'端的接头部分。因此，在添加的扩增循环之后，当将固定有b引物的载体添加到反应混合物中时，变性、引物杂交和引物延伸的下一个扩增循环将导致所有四个扩增产物链都包含与载体上的b引物互补的与载体杂交并被延伸的序列，由此与一个载体相比接种了四个载体。如果在图56所示的最后一个扩增循环之后包含一个另外的扩增循环，其中已将连接有b引物的载体添加到反应混合物中，则总共有四种扩增产物将产生一条核酸链，与载体上的b引物杂交，相比之下，只有一个产物产生一条链，如所示的方案中杂交，而没有添加另一个扩增循环。此外，四个产物链中的每一个将包含连接到核酸的5'端的接头部分。因此，
在添加的扩增循环之后，假设将足够数量的具有与其固定的b引物的载体添加到反应混合物中，与如果不包含另外的扩增的一个接种的载体相比，总共四个载体将接种有核酸模板。因此，通过在诸如这些的预接种方法中增加扩增循环的数量，从相同数量的输入文库核酸分子获得更多数量的接种载体。
333.在一些实施例中，本文提供的预接种(或接种)方法包含通过杂交将核酸与载体或表面连接且在同时扩增所连接的核酸到低水准，例如约10或更多、20或更多、50或更多、100或更多、250或更多、500或更多或1000或更多拷贝的组合过程。在一些实施例中，预接种反应生成多个预接种的载体、表面或表面上的位点，其中多个预接种的载体或表面上的位点中的单独预接种的载体或位点包含与载体或位点连接的多个第一引物，其中所述多个第一引物具有基本上相同序列，并且其中所述多个第一引物中的一些与模板核酸分子接合并且所述多个第一引物中的一些不与模板核酸分子接合。在这些实施例中，预接种反应混合物通常包含以下一些或全部：核酸分子群体、聚合酶、核苷酸、第一引物群体、一群或多个载体或表面、或辅因子如二价阳离子。各种方法可以用于用基本上单克隆模板核酸分子预接种载体。作为非限制性实例，可以使用重组酶-聚合酶扩增(rpa)反应、模板步移反应、pcr、乳化pcr或桥式pcr来进行预接种反应。可以在溶液中以散装方式进行预接种反应或模板化反应。此外，预接种反应混合物或模板化反应混合物可以包含：与一种或多种载体连接的第一通用引物；溶液中的第二通用引物(可溶性第二通用引物)；和多个核酸分子，其中个别核酸分子与可在文库制备期间添加的至少一个通用引物结合序列接合，并且其中通用引物结合序列结合第一和任选的第二通用引物。在一些实施例中，在孔中进行预接种反应或模板化反应。在一些实施例中，使用连续rpa反应进行预接种反应和模板化反应，其中在预接种反应之后在进行模板化反应之前，洗掉模板核酸分子。
334.在一些实施例中，将不同核酸分子预接种到一种或多种不同离散表面或载体(例如，珠粒或颗粒)上而不需要在扩增之前区室化。在其它实施例中，在扩增之前，将核酸分子分配(partitioned/distributed)到乳液中。在一些实施例中，与单一连续液相内的扩增相反，可在多个分隔反应体积中平行进行预接种反应。各反应体积可包含预接种反应混合物。例如，可以将核酸分子分配或置于反应室阵列或反应体积阵列中，使得阵列中的至少两个此类区室或体积接受单一核酸分子。在一些实施例中，形成多个单独反应体积。可在扩增之前，任选地将反应室(或反应体积)密封。可在每一个反应室中进行预接种反应，以生成基本上单克隆模板核酸分子群体。在另一个实施例中，将反应混合物分区或分隔成分散于乳液连续相内的多个微反应器。各区室或微反应器充当非依赖性扩增反应器，因此整个乳液能够支持在单一反应容器(例如eppendorf管或孔)中于单独(非连续)液相中进行许多单独扩增反应。如本文所用，术语“乳液”包含含第一液体与第二液体的混合物的任何组合物，其中第一和第二液体基本上彼此不混溶。分区或单独反应体积任选地不彼此混合或连通，或不能够彼此混合或连通。在此类实施例中，微反应器中的预接种反应混合物可以是本文所描述的预接种反应混合物中的任何预接种反应混合物。在其中反应混合物分散在乳液内的一些实施例中，所述方法进一步包含从乳液回收至少一些与基本上单克隆模板核酸分子群体连接的载体。在一些实施例中，所述方法进一步包含将至少一些与基本上单克隆模板核酸分子群体连接的载体放置到表面上。在一些实施例中，所述方法进一步包含通过将至少一些与基本上单克隆模板核酸分子群体连接的载体放置到表面上而形成阵列。
335.在一些实施例中，预接种反应可以生成：零个模板核酸分子与其连接的载体(空载体)、一种类型的模板核酸分子与其连接的其它预接种的载体和多于一种类型的模板核酸分子与其连接的其它预接种的载体。与一个或多个预接种的载体连接的模板核酸分子的数量是预接种数量。在预接种方法的实施例中的一些实施例中，预接种数量是1或介于约1与150,000个模板核酸分子之间，例如介于约1与100,000、1与75,000、1与50,000、1与25,000、1与10,000、1与5,000、1与2,500、10与100,000、10与75,000、10与50,000、10与25,000、10与10,000、10与5,000或10与2,500个模板核酸分子之间。在一些实施例中，在预接种反应之后，大部分与载体连接的任何引物不与模板核酸分子结合。这些未结合引物可用于后续模板化反应中以用于进一步扩增模板核酸分子。例如，在预接种反应之后，与载体连接的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的引物通常不与模板核酸分子结合，或除了与载体连接的引物之一外，所有引物均不与模板核酸分子结合。
336.在一些实施例中，预接种或模板化反应包含使用pcr扩增方法。在一些实施例中，在单轮或单循环pcr中进行预接种或模板化反应。在其它实施例中，在多轮或多循环pcr中进行预接种或模板化反应。例如，在一些使用扩增(例如，pcr)循环的方法中，可以在不存在(或存在)载体的情况下进行一个或多个或两个或更多个pcr循环以生成所需模板或其量，其可以遵循在存在载体的情况下通过一个、一个或多个或两个或更多个pcr循环将所需模板核酸接种到载体上(参见例如图56)。例如，所述方法可包含稀释一定量的与载体反应的核酸分子，以降低与多于一个核酸分子反应的载体的百分比。在一些实施例中，稀释核酸分子，使得预接种反应具有载体:模板核酸分子比率，选择所述比率以优化具有与其连接的一个模板核酸分子或基本上单克隆模板核酸分子群体的载体的百分比。例如，可用以下的载体:模板核酸分子比率进行预接种反应：至少约1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、75:1、和100:1。在一些实施例中，pcr在单一反应混合物的溶液中批量进行。在一些实施例中，pcr在连续溶液中的孔或反应室中进行。在一些实施例中，在乳液中进行pcr，其中如本文中其它地方所描述，在乳液中的多个微反应器中进行pcr。
337.在一些实施例中，预接种或模板化反应包含模板步移，其中双链核酸分子的部分变得解离，使得引物与链之一结合以开始新一轮的复制(参见例如，2012年6月21日公布的美国专利公开第2012/0156728号，所述美国专利公开通过引用整体并入本文)。模板步移反应通常是在等温下进行。在一些实施例中，模板步移是在乳液内进行。
338.在本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒的一些实施例中，预接种反应混合物或模板化反应混合物包含使模板核酸分子部分地变性的组分。在一些实施例中，部分地变性条件包含用一种或多种酶处理待扩增的模板核酸分子或使所述模板核酸分子与所述一种或多种酶接触，所述一种或多种酶能够任选地以序列特异性或序列定向方式(如在rpa反应中)使核酸模板部分地变性。在一些实施例中，至少一种酶任选地以序列特异性方式催化链侵入或解开。任选地，一种或多种酶包含选自以下的一种或多种酶：重组酶、拓扑异构酶和解螺旋酶。在一些实施例中，使模板部分地变性包含使模板与重组酶接触和形成包含重组酶的核蛋白复合物。任选地，使模板核酸分子在第一和任选地第二引物存在下与重组酶接触。部分地变性可包含使用重组酶催化链交换和使第一引物与第一引物结合序列杂交(或使第二引物与第二引物结合序列杂交)。在一些实施例
中，部分地变性包含使用重组酶进行链交换，和使第一引物与第一引物结合序列杂交且使第二引物与第二引物结合序列杂交。
339.在一些实施例中，使模板核酸分子部分地变性包含使模板与一种或多种重组酶或核蛋白复合物接触。核蛋白复合物中的至少一个可包含重组酶。不受理论限制，据信，重组酶涂覆单链dna(ssdna)，以形成侵入模板核酸分子上的同源性双链区域的核蛋白长丝。这产生短杂合体和被称为d-环的置换链气泡(参见例如zarling的美国专利第5,223,414号、sena的美国专利第5,273,881号和第5,670,316号以及美国专利第7,270,981号、第7,399,590号、第7,435,561号、第7,666,598号、第7,763,427号、第8,017,339号、第8,030,000号、第8,062,850号和第8,071,308号，通过引用整体并入本文)。利用dna聚合酶，使杂交引物的游离3'端延伸，以合成新互补链。互补链在其伸长时，置换模板核酸分子的最初配对的伴侣链。在一实施例中，在与模板核酸分子(其任选地是双链)接触之前，使一对引物中的一个或多个与一种或多种重组酶接触。核蛋白复合物中的至少一个可包含引物(例如第一引物或第二引物，或包含与模板中的对应引物结合序列互补的序列的引物)。在一些实施例中，使模板部分地变性包含使模板与包含引物的核蛋白复合物接触。部分地变性可包含使核蛋白复合物的引物与模板中的对应引物结合序列杂交，由此形成引物-模板双螺旋。在一些实施例中，使模板核酸分子部分地变性包含使模板与包含第一引物的第一核蛋白复合物接触。部分地变性可包含使第一核蛋白复合物的第一引物与正向链的第一引物结合序列杂交，由此形成第一引物-模板双螺旋。在一些实施例中，使模板部分地变性包含使模板与包含第二引物的第二核蛋白复合物接触。部分地变性可包含使第二核蛋白复合物的第二引物与反向链的第二引物结合序列杂交，由此形成第二引物-模板双螺旋。
340.在包含溶液中的所固定的第一引物群体和第二引物群体的本文所提供的预接种或模板化方法的一些实施例中，不受理论限制，在预接种或模板化反应期间，使模板核酸至少部分地变性，并且模板上的第一引物结合位点与和固体载体连接的第一引物结合。聚合酶使用第一引物，以生成模板核酸的一条链的互补链。那条互补链现通过引物与固体载体共价连接。溶液中的第二引物是呈与重组酶的复合物形式，且与互补链上的引物结合位点结合，因此使结合的模板核酸分子部分变性。聚合酶使用引物合成与原始模板核酸链相同的新链。在一些此类实施例中，然后认为这条链将通过结合重组酶的复合物和同固体载体连接的附近第一引物而部分地变性，且聚合酶合成另一条互补链。通过这个方法的重复步骤，基本上单克隆模板核酸分子群体在预接种反应或模板化反应期间扩增的一些实施例中生成。
341.在本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒的一些实施例中，预接种或模板化包含部分变性或扩增，包含本文所描述的任何一个或多个步骤或方法，使用重组酶和任选地重组酶辅助蛋白。重组酶可以包含能够诱导或增加重组事件发生频率的任何试剂，包含由此两个不同的多核苷酸链彼此重组的任何事件。重组酶可以是催化同源重组的酶。适合的重组酶包含reca和其原核或真核同源物、或其功能片段或变异体，任选地与一种或多种单链结合蛋白(ssb)组合。在一些实施例中，同源重组酶包含来自任何生物体的酶，所述生物体包含肌病毒科(myoviridae)(例如来自噬菌体t4的uvsx、rb69和其类似物)、大肠杆菌(例如，reca)或人类(例如，rad51)。在实施例中，反应混合物包含选自以下的一种或多种重组酶：uvsx、reca、rada、radb、rad51、其同源物、其功能
类似物或其组合。在说明性实施例中，重组酶是uvsx。uvsx蛋白可以例如以50-1000ng/μl、100-750ng/μl、200-600ng/μl或250到500ng/μl存在。在本文所提供的方法的一些实施例中，预接种或模板化反应混合物包含一种或多种重组酶辅助蛋白。例如，辅助蛋白可提高重组酶的活性。在一些实施例中，辅助蛋白可结合模板核酸分子的单链，或可将重组酶装载到模板核酸分子上。辅助蛋白可以源自例如任何噬菌体，包含肌病毒噬菌体或细菌物种。在一些实施例中，用于核酸扩增的方法可以包含单链结合蛋白，例如肌病毒gp32(例如，t4或rb69)。在一些实施例中，反应混合物包含提高重组酶装载到核酸上的蛋白质。例如，uvsy蛋白是重组酶装载蛋白。在一些实施例中，uvsy可以介于约20与500ng/μl之间，例如介于约20与250ng/μl、20与125ng/μl或约75与125ng/μl之间。
342.在一些实施例中，预接种或模板化反应混合物可以进一步包含其它组分。例如，组合物可包含核苷酸、第一引物群体、任选地第二引物、辅因子和缓冲液。第一引物群体和任选地第二引物群体可与一种或多种载体连接。作为非限制性实例，组合物包含：一种或多种载体；重组酶，如uvsx；聚合酶，如sau dna聚合酶；重组酶装载蛋白，如uvsy；单链结合蛋白，如gp32蛋白；核苷酸；atp；磷酸肌酸；和肌酸激酶。反应组分组合物可以呈液体形式，或其可呈固体形式，如可复水的干燥沉淀物形式(dried-down pellet form)。脱水沉淀物可以包含例如重组酶、任选的重组酶辅助蛋白、任选地gp32、dna聚合酶、dntp、atp、任选地磷酸肌酸、任选的拥挤药剂和任选地肌酸激酶。复水缓冲液可包含例如tris缓冲液、乙酸钾盐和任选地如peg的拥挤药剂。dna聚合酶可以是例如t4或t7 dna聚合酶，并且当聚合酶是t7 dna聚合酶时可以进一步包含硫氧还蛋白。在一些实施例中，当使用包含反应混合物组分的脱水沉淀物时，沉淀物用复水缓冲液复水，且添加模板核酸分子、引物和另外无核酸酶水到最终体积。此外，可将组合物的组分分开，使得任何组合的组分可呈沉淀物或液体形式，且其余组分的一种或多种组合可呈一种或多种单独沉淀物或液体形式。此类组合可形成包含此类组合中的至少两种的试剂盒或小瓶。例如，试剂盒或小瓶可以包含含除聚合酶以外的所有反应混合物组分的沉淀物，所述聚合酶可以单独沉淀物或液体提供于小瓶，例如试剂盒中。在一个非限制性实例中，组合物包含核酸分子群体、聚合酶、重组酶、正向引物、反向引物、核苷酸和缓冲液。在一些实施例中，组合物包含核酸分子、正向引物、反向引物、uvsx重组酶、uvsy重组酶装载蛋白、gp32蛋白、sau dna聚合酶、dntp、atp、磷酸肌酸和肌酸激酶。在一些实施例中，组合物包含具有第一引物结合序列和第二引物结合序列的至少两种不同的核酸分子、重组酶、重组酶辅助蛋白、聚合酶、第一通用引物、第二通用引物、dntp和缓冲液。在一些实施例中，组合物进一步包含一种或多种载体。在说明性实施例中，组合物包含具有第一引物结合序列和第二引物结合序列的至少两种不同的模板核酸分子、uvsx重组酶、uvsy重组酶装载蛋白、gp32蛋白、sau dna聚合酶、atp、磷酸肌酸、肌酸激酶、与珠粒载体连接的第一通用引物、第二通用引物和缓冲液。
343.在本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒的一些实施例中，在预接种反应之后进行模板化反应(例如，一个、一个或多个、两个或两个或更多个模板化反应)，其中预接种的表面或载体上的模板核酸分子被扩增或进一步扩增(本文称为模板化反应)。通常在与模板化反应分开的预接种反应中生成预接种的固体载体。通常，在此类实施例中，模板化反应混合物不包含溶液中的另外模板核酸分子，使得在开始模板化反应之前，与一种或多种预接种的载体连接的模板核酸分子是模板化反应混合
物中的模板核酸分子的主要来源或唯一来源。在一些实施例中，当开始模板化反应时，模板核酸分子以溶液形式存在于反应混合物中。在一些实施例中，在将其引入到模板化反应混合物中之前，在一种或多种预接种的载体上进行一次或多次洗涤。在一些实施例中，两个或更多个反应在模板化方法中进行。
344.在一些实施例中，进行一个或多个模板化反应(或模板化反应在两个单独扩增的两个步骤中进行，例如两个单独的rpa反应)。在一些实施例中，在模板化方法中进行两个或更多个单独的反应。例如，在本文提供的一些方法中，进行第一或初始模板化反应，并且然后是第二或随后模板化反应。在一些情况下，初始模板化反应包含一种或多种载体，一种或多种模板多核苷酸连接到所述载体上，所述模板多核苷酸在模板化反应开始之前在单独的预接种过程中生成。初始模板化反应包含例如在基本上等温条件下使用重组酶和聚合酶(即，rpa)在预接种的载体上扩增一种或多种模板多核苷酸。在此类实施例中，单独的模板化或rpa反应可以进行相同或不同的时间量。与随后的第二模板化反应的持续时间相比，初始第一模板化反应随后进行第二或随后模板化反应通常进行更短的时间段。例如，初始第一模板化反应，随后是第二或随后模板化反应可以进行约1-10分钟、约1-9分钟、约1-8分钟、约1-7分钟、约1-6分钟，约1-5分钟，约1-4分钟，约1-3分钟，约1-2.5分钟，约1-2分钟，约1-1.5分钟，约2-10分钟，约2-9分钟，约2-8分钟，约2-7分钟，约2-6分钟，约2-5分钟，约2-4分钟，约2-3分钟，约2-2.5分钟，约2.5-10分钟，约2.5-9分钟、约2.5-8分钟、约2.5-7分钟、约2.5-6分钟、约2.5-5分钟、约2.5-4分钟或约2.5-3分钟。在一些实例中，初始第一模板化反应，随后是第二或随后的模板化反应，可以进行少于约15分钟、少于约10分钟、少于约5分钟、少于约4分钟、少于约3分钟、少于约2.5分钟、少于约2分钟、少于约1.5分钟或少于约1分钟。在一个非限制性实例中，使用rpa在约40℃下进行约2.5分钟的初始模板化反应。在一些实施例中，初始或第一模板化反应在开始第二或随后模板化反应之前终止或限制。例如，终止组合物，例如模板化反应抑制剂，可以添加到抑制或停止反应或阻止反应继续的初始或第一模板化反应中。模板化反应抑制剂的实例包含但不限于抑制核酸扩增反应的一种或多种组分，例如聚合酶抑制剂或重组酶抑制剂，或限制反应所需的组分的组合物反应进行。例如，在包含rpa的初始模板化反应中，模板化反应抑制剂可以是螯合剂，如金属或阳离子螯合剂，例如edta，其与在重组酶-聚合酶扩增中重组酶介导的反应可能需要的阳离子如镁结合。在另一个实例中，模板化反应可以通过去除反应组分例如通过用不含模板化反应所需的一种或多种组分的溶液洗涤模板化反应位点，例如反应室或孔来限制或中断。例如，可以用不含重组酶、聚合酶、阳离子、核苷酸或用于模板化反应的rpa反应的其它组分的溶液洗涤或冲洗模板化反应位点。在一些实施例中，通过将一种或多种模板化反应组分添加或接触到已经进行初始或第一模板化反应的模板结合载体来开始或促进在初始或第一模板化反应之后的第二或随后模板化反应。例如，在包含重组酶-聚合酶核酸扩增的第二或随后模板化反应中，可以将以下组分中的一种或多种组分添加到模板结合的载体或与模板结合载体接触：重组酶、聚合酶、核苷酸或阳离子。在第一或初始模板化反应之后的第二或随后模板化反应通常进行比第一模板化反应的持续时间更长的时间段。例如，在第一模板化反应之后的第二或随后模板化反应可以进行约5-60分钟、约5-50分钟、约5-45分钟、约5-40分钟、约5-35分钟、约5-30分钟，约5-25分钟，约5-20分钟，约5-15分钟，约5-10分钟，约10-60分钟，约10-50分钟，约10-45分钟，约10-40分钟，约10-35分钟，约10-30分钟，约10-25分钟，
约10-20分钟，约10-15分钟，约15-60分钟，约15-50分钟，约15-45分钟，约15-40分钟，约15-35分钟，约15-30分钟，约15-25分钟，约15-20分钟，约20-60分钟，约20-50分钟，约20-45分钟，约20-40分钟、约20-35分钟、约20-30分钟或约20-25分钟。在一些实例中，在第一或初始模板化反应之后的第二或随后模板化反应可进行至少约60分钟、至少约55分钟、至少约50分钟、至少约45分钟、至少约40分钟、至少约35分钟、至少约30分钟、至少约25分钟、至少约20分钟、少于2分钟、少于1.5分钟或少于1分钟。在一个非限制性实例中，使用rpa在约40℃下进行第二或随后的模板化反应约20分钟。在一些实施例中，第二或随后的模板化反应在设定的时间被终止、中断或限制，例如，如对于初始或第一模板化反应所描述的。
345.在模板化过程中包含两个或更多个反应以生成基本上单克隆的核酸群体的一个优点是其促进了模板扩增的控制，这可以减少或防止核酸群体中的多克隆性。例如，数量或持续时间有限的预接种载体上的模板多核苷酸的初始或第一扩增可以限制可以用于移动或迁移到另一个模板化反应位点的游离模板核酸的量。初始或第一模板化反应提供复制的模板核酸与预接种的载体或表面或表面位点上的另外固定引物的结合，并因此提供对于模板核酸扩散在第二或随后的模板化反应扩增中发生的不太开放的环境。
346.在本文所提供的预接种或模板化方法的一些实施例中，包含例如在其中在模板化方法中进行两个或更多个反应的实施例中，所述反应中的一个或多个反应包含一种或多种扩散限制性药剂。当在反应混合物的单一连续液相内扩增两种或更多种模板核酸分子时，包含扩散限制性药剂可为有利的。扩散限制性药剂可以进一步阻止或减缓模板核酸分子或通过模板核酸分子的至少一些部分在模板化或预接种反应混合物中的复制产生的扩增多核苷酸的扩散，由此防止或减少用于生成单克隆模板群体的一个模板化反应中的核酸转移到用于生成不同单克隆模板群体的另一模板化反应中，由此减少在模板化或预接种反应中核酸扩增期间多克隆污染物的形成。因此，扩散限制性药剂可以防止或减少多克隆污染物的形成，而无需在扩增期间通过物理方式或封装方式(例如，乳化)对预接种或模板化反应混合物进行分隔。在一些实施例中，扩散限制性药剂被包含在第一或初始模板化反应中。在一些实施例中，扩散限制性药剂被包含在第一或初始模板化反应中，但不包含在第二或随后模板化反应中。在一些实施例中，扩散限制性药剂被包含在第一或初始模板化反应中和一个或多个随后的模板化反应中。在一些实施例中，一个或多个反应中包含的扩散限制性药剂是一个种或多种筛分药剂，例如聚合物，如甲基纤维素或其提供具有多个孔的基质。筛分药剂可以是有效筛分和限制或减缓存在于预接种或模板化反应混合物中的一种或多种模板核酸分子或多核苷酸，例如扩增反应产物和/或模板核酸分子，的迁移的任何药剂。因此，筛分药剂可以减少多核苷酸的布朗运动(brownian motion)。在一些实施例中，筛分药剂是聚合物化合物。借助于非限制性实例，筛分药剂可包含多醣、多肽、有机聚合物或任何其它适合的聚合物。在一些实施例中，筛分药剂是以下聚合物中的一种或多种：纤维素、葡聚糖、淀粉、肝醣、琼脂、甲壳素、果胶或琼脂糖。在一些实施例中，筛分药剂包含纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠、羧甲基2-羟乙基纤维素钠、甲基纤维素、羟基乙基纤维素、2-羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、(羟丙基)甲基纤维素或羟乙基乙基纤维素、或包含此类聚合物中的任一个或多个的混合物。在一些实施例中，预接种反应混合物包含拥挤药剂(crowding agent)。例如，拥挤药剂可通过生成拥挤的反应环境而增加核酸扩增反应中的一种或多种组分的浓度。在一些实施例中，预接
种或模板化反应混合物包含筛分药剂或扩散限制性试剂或拥挤药剂。扩散限制性药剂包含扩散降低药剂。扩散降低药剂包含降低模板核酸分子或多核苷酸从较高浓度区域迁移到较低浓度区域的任何化合物。在一些实施例中，扩散降低药剂包含无关于大小降低核酸扩增反应的任何组分的迁移的任何化合物。
347.在一些实施例中，包含在一个或多个反应中的扩散限制性药剂是药物组合物。术语“药物化合物”和其变体是指可以与核酸连接并阻止其扩散通过反应混合物，但仍然允许在核酸合成反应中使用此类多核苷酸、引物、模板或扩增产物进行核酸合成的任何组合物，例如化学组合物。例如，与缺少连接的化合物的核酸相比，通过改变修饰的核酸的整体大小、长度、半径、形状或电荷，当连接到核酸时，药物化合物可以提供流体动力学阻力。在一些实施例中，与水性介质和缺少连接化合物的核酸之间的相互作用相比，连接到核酸上的药物化合物可以改变核酸和水性介质之间的相互作用。此类药物化合物在合成反应中与核酸的连接通常会降低此类核酸在反应混合物中的迁移率，并可用于防止同一反应混合物发生的不同合成反应之间扩增产物或模板的交叉污染。例如，药物化合物可以是在模板化反应过程中，例如在模板核酸扩增过程中结合或连接到模板核酸上以降低模板核酸在模板化反应混合物中的迁移率的化合物。在一些实施例中，模板核酸被修饰以包含与药物化合物结合的部分(称为“药物标签”)。例如，亲和部分，例如接头部分，可以连接到核酸并且药物化合物是一种结合配偶体部分，例如受体类型部分，其与亲和部分结合。在一个非限制性实例中，模板核酸与生物素部分连接，所述生物素部分可以结合作为包含在一种或多种模板化或预接种反应中的药物化合物的抗生物素蛋白样部分(例如，链霉抗生物素或其衍生物，例如中性抗生物素蛋白)。在一些实施例中，药物化合物被包含在第一或初始模板化反应中。在一些实施例中，药物化合物包含在第一或初始模板化反应中，但不包含在第二或随后模板化反应中。在一些实施例中，药物化合物包含在第一或初始模板化反应中和在一个或多个随后模板化反应中。在一些实施例中，扩散降低剂或筛分药剂包含聚丙烯酰胺、琼脂、琼脂糖或纤维素聚合物，如羟基乙基纤维素(hec)、甲基纤维素(mc)或羧甲基纤维素(cmc)。
348.在本文所提供的模板化方法的一些实施例中，模板化反应包含rpa反应。模板化反应混合物通常包含以下中的所有或一些：一种或多种预接种的固体载体，其包含所连接的基本上相同的第一引物群体，并且具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子例如一个模板分子(或超过一个模板分子)；聚合酶；重组酶；任选的单链结合蛋白；任选的重组酶装载蛋白；任选的第二引物或反向引物，其可与固体载体连接或在溶液中；dntp；atp；缓冲液；和任选地磷酸肌酸和肌酸激酶中的一个或两个。可添加二价阳离子，如mgcl2或mg(oac)2，以启动反应。在一些实施例中，缓冲剂包含拥挤药剂，如peg、tris缓冲剂或乙酸钾盐或扩散限制性药剂，例如筛分药剂或药物化合物。在一些实施例中，模板核酸分子上的正向引物结合序列与正向引物的至少一部分互补或相同，且模板核酸分子上的反向引物结合序列与反向引物的至少一部分互补或相同。在一些实施例中，模板化反应包含散装扩增(例如，散装等温扩增)或在反应室例如多孔固体载体的孔或表面中进行。
349.在一些实施例中，组合物以及与组合物相关的系统、方法、试剂盒和设备包含模板化反应混合物，其包含预接种的载体、核苷酸、重组酶和聚合酶群体，其中预接种的载体各自具有一个或超过一个，例如介于10与50,000个之间的包含与其连接的第一引物的基本上单克隆模板核酸分子，并且进一步包含与预接种的载体连接并且不与模板核酸分子结合的
所连接的第一引物。在一些实施例中，反应混合物不包含能够引发重组酶-聚合酶扩增反应的阳离子，或者反应混合物中至少95％的模板核酸分子与一种或多种载体连接。在一些实施例中，模板化反应混合物进一步包含能够开始重组酶-聚合酶扩增反应的阳离子。在一些实施例中，模板核酸分子包含具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在一些实施例中，所述模板化反应混合物包含重组酶辅助蛋白。在另外的实施例中，重组酶辅助蛋白是单链结合蛋白或重组酶装载蛋白。在一些实施例中，预接种的载体在预接种反应中生成，包含pcr循环或重组酶-聚合酶扩增(rpa)反应。在一些实施例中，通过在35℃与45℃之间的温度下，温育rpa反应混合物2到5分钟，来进行rpa反应。
350.由于在本文所提供的方法的一些实施例中，预接种方法可以包含rpa反应或模板化过程可以包含超过一种rpa反应，因此所述方法可以包含顺序rpa反应。例如，第一rpa反应可以是预接种反应，随后是第二rpa模板化反应。在另一个实例中，预接种反应可以是一个或多个pcr循环或非等温扩增循环，其后是一个或多个涉及rpa反应的模板化反应。rpa反应可以在相同条件下进行。然而，在一些实施例中，进行预接种rpa反应或初始模板rpa反应，然后是一个或多个后续模板rpa反应，使得与模板rpa反应或在初始模板rpa反应之后发生的模板化反应相比，发生的扩增循环更少。例如，预接种rpa反应可进行比模板化rpa反应短的时间，所述模板化rpa反应扩增与通过预接种的rpa反应所生成的预接种的固体载体连接的模板核酸分子。作为非限制性说明性实例，进行预接种rpa反应或初始模板rpa反应，然后是一个或多个模板rpa反应例如约2到5分钟，以生成一种或多种例如预接种的载体或模板化载体群体，随后使其经受模板rpa反应，所述模板rpa反应进行约10到60分钟。在这些非限制性说明性实例中的一些实例中，在模板化rpa反应之前，从预接种的固体载体洗掉包含模板核酸的反应组分。
351.在一些实施例中，在抑制过早反应开始的条件下，预温育预接种反应混合物或模板化反应混合物。例如，可从反应容器扣留预接种反应混合物中的一种或多种组分，以防止过早反应开始。在一些实施例中，为了启动反应，添加二价阳离子(例如，镁或锰)。在另一实例中，反应混合物在抑制酶活性的温度下预温育，例如在约0-15℃或约15-25℃下。随后，在较高温度下温育反应，以提高酶促活性。在说明性实施例中，在反应期间，不将预接种反应混合物或模板化反应混合物暴露于高于42℃的温度。在一些实施例中，预接种或模板化反应在等温条件下进行。在一些实施例中，等温条件包含使反应在至少一些部分扩增(或整个扩增过程)期间经受约束在有限范围内的温度变化，包含例如等于或小于约10℃或约5℃或约1-5℃或约0.1-1℃或小于约0.1℃的温度变化。等温反应的温度可通常在约15℃与65℃之间，例如在约15℃与55℃之间、在约15℃与45℃之间、在约15℃与37℃之间、在约30℃与60℃之间、在约40℃与60℃之间、在约55℃与60℃之间、在约35℃与45℃之间或在约37℃与42℃之间。在其它实施例中，不将预接种反应暴露于高于以下的温度：40℃、41℃、42℃、43℃、45℃或50℃。因此，在某些实施例中，不将反应混合物暴露于热启动条件。在一些实施例中，进行方法而无需在扩增期间使双链模板核酸分子经受极限变性条件。例如，可以进行方法而无需在扩增期间使核酸模板经受等于或大于模板的tm的温度。在一些实施例中，进行方法而无需在扩增期间使模板与化学变性剂(如naoh、脲、胍盐和其类似物)接触。
352.在一些实施例中，在进行模板化方法之后，模板化表面或载体或位点具有至少50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、
450,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或106个与每个模板化载体、表面或位点连接的基本上单克隆模板核酸分子。在一些实施例中，在进行模板化方法之后，模板化表面或载体或位点具有介于约50,000与500,000个与每个模板化载体连接的基本上单克隆模板核酸分子，例如介于约50,000与400,000之间、介于约50,000与300,000之间、介于约50,000与200,000之间、介于约50,000与100,000之间、介于约100,000与400,000之间、介于约100,000与300,000之间、介于约100,000与200,000之间或介于约150,000与300,000之间的与每个模板化载体连接的基本上单克隆模板核酸分子。
353.在一些实施例中，用于生成一种或多种模板化载体或表面，例如固体载体的方法包含，例如：a)通过将一种或多种预接种的载体、核苷酸、重组酶和聚合酶组合来形成模板化反应混合物，其中所述一种或多种预接种的载体包含所连接的基本上相同的第一引物群体并且具有与其连接的一个模板分子或具有与其连接的基本上单克隆模板核酸分子，其中一种或多种预接种的载体在模板化反应之前的单独预接种反应中形成，其中模板核酸分子包含近侧区段，所述近侧区段包含在一些实施例中不包含100个或更多个相同核苷酸的第一引物，其中近侧区段将模板核酸区段与预接种的固体载体连接，并且其中预接种的载体进一步包含未与模板核酸分子结合的所连接的第一引物，其中模板化反应混合物进一步包含基本上相同的第二引物群体，其可以是可溶的或在溶液中，并且其中模板核酸分子在与近侧区段相对的末端处或附近包含第二引物的引物结合位点；以及b)进行一种或多种模板化反应。在一些实施例中，在进行模板化反应时，将模板化反应混合物在等温条件下温育以扩增模板核酸分子以生成一种或多种模板化表面或载体。在一些模板化反应中包含向模板化反应混合物中添加阳离子。在一些实施例中，当开始模板化反应时，模板核酸分子不以溶液形式存在于反应混合物中。在一些实施例中，模板核酸分子包括具有不同序列的两种或更多种模板核酸分子。在所述方法的一些实施例中，存在于模板化载体上的基本上单克隆模板核酸分子为存在于预接种的载体上的基本上单克隆模板核酸分子的至少100倍。
354.模板化反应可以通过预接种方法进行，其中生成用于形成模板化反应混合物的一种或多种预接种载体或预接种载体群体。预接种方法包含在预接种条件下使用预接种反应混合物以生成预接种的载体，所述预接种的载体具有一个模板分子或多个，例如介于10与100,000个之间的基本上单克隆模板核酸分子，包括与其连接的第一引物，并且包括不与模板核酸分子结合的所连接的第一引物。通常，预接种反应包含温育包括核酸分子群体和载体或表面群体的预接种反应混合物，所述载体或表面群体包括所连接的基本上相同的第一引物群体。在一些实施例中，核酸分子群体包括多个核酸分子，所述多个核酸分子包含靶序列和一个或多个通用衔接子序列。例如，对于分子的链之一，多个核酸分子中的每个核酸分子含有在分子的5'端处的第一连续核苷酸序列(例如，第一衔接子)、在分子的3'端处的第二连续核苷酸序列(例如，第二衔接子)和定位于第一连续核苷酸序列与第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，例如靶序列，其中第一连续核苷酸序列和第二连续核苷酸序列不同，在核酸分子群体中核酸分子的第一连续核苷酸序列基本上相同，并且核酸分子的第二连续核苷酸序列基本上相同。核酸分子末端处的连续核苷酸序列之一(例如，衔接子序列)通常和与载体连接的第一引物的至少一部分互补或将和与载体连接的第一引物的至少一部分互补的连续核苷酸序列添加到预接种反应中核酸分子的末端。在一些实施例中，预接种反应中的温育包含在核酸与第一引物退火的条件下的扩增循环(例如，pcr)，所述第一
引物与载体连接。在一些实施例中，预接种反应混合物包含用于延伸与核酸杂交的第一引物的组分(例如，一种或多种聚合酶、dntp)。在一些实施例中，预接种反应包含一个或多个核酸扩增循环(例如，包含变性、引物退火和引物延伸)，其中例如当核酸分子不包括此类连续核苷酸序列时，将和与载体连接的第一引物的至少一部分互补的连续核苷酸序列添加到核酸分子的末端。在此类实施例中，可以在不存在或存在包括所连接的第一引物群体的载体或表面的情况下进行一个或多个扩增循环。在其中在不存在包括所连接的第一引物群体的载体或表面的情况下进行一个或多个扩增循环的情况下，在生成具有包括连续核苷酸序列的端的核酸之后，将载体或表面添加到预接种反应混合物中，所述连续核苷酸序列和与载体连接的第一引物的至少一部分互补。在一些实施例中，预接种反应包含在存在核酸和溶液中的一种或多种引物的情况下的一个或多个扩增循环，包含例如包括第一引物序列的引物或在不存在或存在载体或表面的情况下作为第二引物的引物，所述载体或表面具有与其连接的多个第一引物，在一些实施例中，这之后可以是在存在具有与其连接的多个第一引物的载体或表面的情况下的一个或多个扩增循环(例如，变性、引物退火和引物延伸)。在一些实施例中，在预接种反应期间的一个或多个扩增循环在等温条件下进行。例如，在一些实施例中，预接种反应中的一个或多个扩增循环包含rpa。在所述方法的一些实施例中，预接种反应条件包括扩增循环，所述扩增循环包含在约98℃下约2分钟，然后在约56℃到约58℃下约5分钟。在一些实施例中，在溶液中存在包括第一引物序列或第二引物的引物的情况下，预接种反应条件包括一个或多个扩增循环(例如，2个循环)，所述扩增循环包含在约98℃下约15秒，然后在约58℃下约2分钟，这可以在存在或不存在载体或表面的情况下进行。在一些实施例中，在存在具有与其连接的多个第一引物的载体或表面的情况下，这之后是扩增循环，所述扩增循环包含在约98℃下约2分钟，然后在约56℃到约58℃下约5分钟。在所述方法的一些实施例中，所述预接种反应条件包括在等温条件下温育所述预接种反应混合物约2到5分钟。在一些实施例中，使用第一重组酶-聚合酶扩增(rpa)反应生成预接种的载体，并且模板化反应包含所述方法中的第二rpa反应和任选地第三或更多rpa反应。在一些实施例中，通过在35℃与45℃之间的温度下，温育rpa反应混合物2到5分钟，来进行第一rpa反应。在所述方法的一些实施例中，所述方法中的预接种反应混合物或模板化反应混合物进一步包括重组酶辅助蛋白，例如单链结合蛋白或重组酶装载蛋白。在所述方法的一些实施例中，在35℃与45℃之间的温度下，温育模板化反应混合物或预接种混合物。在一些实施例中，温育模板化反应混合物10到60分钟。适用于本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒的预接种和模板化方法的实例包含但不限于以下中描述的预接种和模板化方法：pct国际公开第wo2019/094524号、美国专利申请公开第us2019/0194719号和美国专利申请第16/403,339号，这些中的每一个的公开内容通过引用整体并入本文。
355.在一些实施例中，在测序反应中使用一种或多种模板化固体载体，以确定模板核酸分子的序列。在另外的实施例中，模板化固体载体是模板化珠粒，且测序包含在进行测序反应之前将珠粒分配在固体载体或表面的孔中。在一些实施例中，一种或多种模板化固体载体包含：第一模板化固体载体，其与具有第一序列的模板核酸分子的基本上单克隆群体连接；以及至少一种其它模板化固体载体，其与具有第二序列的模板核酸分子的基本上单克隆群体连接，其中第一连接的模板核酸分子的序列不同于第二连接的模板核酸分子的序
列。
356.在用于生成一种或多种模板化载体或表面，例如本文提供的固体载体的方法的一些实施例中，与方法中所生成的模板化载体或载体连接的至少一些、大部分、基本上所有或所有模板核酸含有至少一个修饰的核苷酸，所述至少一个修饰的核苷酸包含与其连接的连接物，例如第一接头部分。此类方法可以进一步包含将模板化载体与第二载体，例如珠粒连接，所述第二载体具有与模板化载体连接的核酸的经修饰的核苷酸可以通过修饰的核苷酸的连接物或接头结合、连接(link)或连接(attach)的部分(例如结合伴侣或第二接头部分)，由此形成模板化载体和第二载体的载体组装体。在这些方法的一些实施例中，将载体组装体与不包含第二载体的任何元件分开，由此将载体组装体与任何此类元件分开并且形成富集的模板化载体群体。在一些实施例中，第二载体包括磁性组件(例如，磁性珠粒)，并且通过向载体组装体施加磁场来将载体组装体与不包含磁性载体的元件分开。在所述方法的一些实施例中，使分开的载体组装体进一步置于从第二载体释放模板化载体的条件下，并且在另外的方法，例如测序方法中进行分析。
357.在一些实施例中，在进行预接种(接种)或模板化反应之后，在其表面具有结合或连接到模板核酸上的接头(例如，生物素)的部分的颗粒，例如珠粒用于直接捕获并富集接种的模板核酸。例如，在一些实施例中，使用可溶性封端的带尾引物(例如，如图53中描绘的p1/b引物)或生物素化引物(例如，如图56中描绘的引物a)在接种反应中生成的携带生物素加合物的模板核酸，与固定在载体上的引物杂交，然后延伸形成与载体结合的双链模板分子。然后将接种的载体与具有生物素结合的部分的颗粒(例如，链霉亲和素包被的珠粒，如磁性珠粒)接触，其通过生物素加合物结合模板核酸以形成珠粒组装体(见图58)，由此捕获接种的载体。然后可以将珠粒组装体与任何其它反应组分分离，例如，通过用磁体将珠粒组装体造粒。随后将链霉亲和素包被的珠粒从模板核酸上分离(例如，通过使结合到固体载体的双链模板变性)并从分离的珠粒上去除结合到固体载体上的模板核酸产生丰富的单链模板结合固体载体集合。捕获过程中可以包含过量的链霉亲和素包被的磁性珠粒，以确保捕获所有模板核酸接种的载体。任何携带接头(例如，生物素)但未与载体结合的接种的扩增反应产物可以被磁性珠粒捕获并与接种的载体一起从其洗脱，在进一步的下游加工中(例如，在装载接种的载体进入反应位点，例如表面上的微孔，例如芯片，用于对结合到固体载体的模板进行测序，如本文所描述的。
358.在一些实施例中，可以如图59所展示的进行预接种(或接种)方法。在此实例中，所述方法被设计成从靶核酸的一系列扩增循环生成期望的固体载体连接的核酸分子，其中所述扩增产物中的仅一种扩增产物(其是期望的靶核酸)将与载体连接。期望的靶标含有被在核酸的5'端处的被称为“手柄”部分的单链核苷酸序列和在3'端处的与固定在载体上的引物(在图59中用字母b标记)互补的衔接子核苷酸序列(在图58中用字母b'标记)。如图58中所示，双链核酸(例如，文库核酸)含有在每个端处的衔接子序列，例如在5'端处的a衔接子序列和在3'端处的p1衔接子序列(标准ion torrent a和p1文库衔接子；赛默飞世尔科技公司)。在某些情况下，如图58所示，输入文库可能已经在a衔接子上具有手柄配置。如果输入文库在a衔接子上没有手柄配置，则可以将其添加在文库的扩增反应中，所述扩增反应包含引物，所述引物在5'到3'方向上含有手柄核苷酸序列、不可复制的部分(例如，聚合酶终止位点)和a衔接子序列。为了开始预接种扩增反应，文库在引物存在下进行一个扩增循环
(即，变性、引物退火和引物延伸)，如图58所示。用于扩增的示例性引物是引物a(正向引物)，其在其5'端处具有聚合酶终止位点和定位于不可复制部分的5'的手柄序列，以及反向融合引物。含有手柄的引物的不可复制部分可以是聚合酶不能复制的任何组合物。此类不可复制部分包含例如不能支持聚合酶进行的基于模板的核苷酸聚合的任何部分。例如，不可复制部分可以包含非核苷酸部分(例如，peg或其它基于碳的间隔基、氨基酸或不被用于进行引物延伸的聚合酶识别的核苷酸类似物)。含有不可复制部分的引物的实例描述于例如国际申请公开第wo2014/062717号中，所述国际申请公开的公开内容通过引用整体并入本文。当含有手柄的引物用于聚合酶的模板依赖性核酸合成时，聚合酶不能将合成的核酸链延伸超过不可复制部分。这通常导致核酸合成的停止或终止，并且不可复制部分充当聚合酶终止位点。融合引物(例如，图58中标记为trp1的引物)是与在靶核酸的3'端处的衔接子序列的一部分互补的序列和与固定在固体载体上的引物相同的b引物的融合物。在图58所示的实例中，trp1是ion p1衔接子的23聚体片段。融合引物将在接近于文库插入序列的文库核酸分子的3'衔接子序列的内部部分处杂交和引发，并且不在文库核酸的极限3'端处与衔接子序列的其余部分杂交。这在融合引物序列与文库核酸上的衔接子的极限3'端部分之间形成错配端。如图58中所示，在两个扩增(例如，pcr)循环之后，尽管生成四个扩增产物，但仅一个产物将能够接种(或杂交)载体(例如，离子球形颗粒)。因此，在扩增产物的随后变性后，所述产物中的仅一种产物的单链将与载体上的b引物杂交。这个引物可以延伸，以形成双链模板核酸，其中一条链含有可以例如用于将载体结合的核酸与用于孔的富集或磁性装载的捕获部分(例如，与磁性珠粒结合的捕获部分)结合的手柄。
359.在图58中描绘的预接种(或接种)方法的一些实施例中，含有手柄序列的引物在3'到5'方向包含与第一双链衔接子在文库dna扩增子的一端上的序列互补的第一核苷酸序列、聚合酶终止位点以及与第一核苷酸序列至少部分互补或完全互补的第二核苷酸序列(手柄序列)。手柄序列可以例如与第一核苷酸序列的一部分互补，但在所述部分内含有一个或多个错配碱基，所述错配碱基不与第一核苷酸序列的所述部分的对应位置中的碱基互补。在某些许可条件下，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列将彼此杂交形成发夹结构。然而，在接种过程中发生的扩增反应的条件下，例如在图58中描述的方法中，含有手柄的引物的核苷酸的第一和第二序列将不杂交。相反，在此类非许可条件下，引物的第一核苷酸序列与文库扩增子的互补衔接子序列(例如，a衔接子)的杂交将是有利的并且发生，并且手柄序列将在聚合酶终止部分的位点从a衔接子和引物的第一核苷酸序列的双链体延伸，作为在接种扩增反应中未复制的单链部分。含有手柄的引物的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以杂交的许可条件可以包含例如相对低的温度，例如低于进行接种扩增反应的温度或低于标准pcr操作温度。低温包含基本上或显著低于a衔接子的双链体双链核酸和引物的第一核苷酸序列的tm的温度。在一些实施例中，含有手柄的引物的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的双链体核酸的tm基本上或显著小于a衔接子和引物的第一核苷酸序列的双链体核酸的tm。例如，在含有手柄的引物的第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间形成的杂交体的tm可以小于约50℃、45℃、40℃、35℃、30℃、25℃，20℃或更低。允许条件的另一个实例是相对高的盐浓度，例如0.25m、0.3m、0.4m、0.5m、0.75m、1m或更高的nacl浓度。非许可条件可以包含，例如，更高的温度(例如，温度显著高于在含有手柄的引物的第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间形成的杂交体的tm)或低水平或不存在盐水平(例如，nacl浓度为0.2m、
0.1m、0.05m、0.001m或更低)。
360.在一些实施例中，在进行如图58所示的接种(或预接种)方法之后，接种的载体通过与其它反应组分的分离而富集。在一种富集方法中，接种的载体通过连接到载体上双链靶模板手柄的接头部分(例如，生物素)间接捕获。具有继而结合或连接于与模板核酸相连的接头的部分(例如，链霉亲和素)的珠粒可用于富集接种的载体。例如，如图59所描绘的，与载体结合的模板靶核酸上的手柄序列互补并与接头部分(例如，生物素加合物)连接的寡核苷酸(即，“捕获”寡核苷酸)与接种的载体和具有链霉亲和素包被的表面的珠粒(例如，磁性珠粒)接触。这导致通过形成珠粒组装体间接捕获与载体结合的双链靶模板核酸。在磁性珠粒的情况下，组装体可以在磁体上沉淀，并去除含有任何其它反应组分的上清液。在一些实施例中，捕获过程在其中与含有游离手柄的引物至少部分互补的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列将杂交的条件下进行，例如允许条件。在此类条件下，存在的含有游离手柄的引物将呈发夹构型，其不会与捕获寡核苷酸杂交。因此，含有游离手柄的引物不会被链霉亲和素包被的磁性珠粒捕获。
361.图59所示的将与载体结合的模板核酸与磁性珠粒连接的过程称为间接捕获方法，而图57中描述的将与载体结合的模板核酸与磁性珠粒连接的过程称为间接捕获方法被称为直接捕获方法。如图57所示，链霉亲和素包被的磁性珠粒与生物素接头部分结合，所述部分直接连接到模板双链体的链上，所述链与一条链杂交，所述链是固定在载体上的延伸引物。相比之下，在图59所示的间接捕获方法中，链霉亲和素包被的磁性珠粒与生物素化的捕获寡核苷酸结合，所述寡核苷酸不是载体结合的模板双链体的链，而是与从双工延伸的单链手柄杂交。因此，在直接和间接捕获方法中通过磁性珠粒捕获接种的载体后形成的珠粒组装体是不同的。在某些情况下，珠粒组装体的差异可能会影响载体结合的模板双链体的杂交链之间的关联。例如，通过磁性珠粒的移动施加在直接连接到磁性珠粒的模板链上的力有时可能与通过接种载体的移动施加在双链体链上的力相对。与其中磁性珠粒通过捕获寡核苷酸间接连接到模板双链体的模板双链体相比，这种力对相关模板双链体链的影响可能更大。效果的程度可能受一种或多种因素的影响，例如模板杂交体的长度、培养基的盐浓度、温度以及在捕获和富集期间珠粒组装体的混合、转移等的量。随着这种力对载体结合的靶模板双链体的影响增加，模板双链体解离的可能性也会增加。在富集过程中模板双链体的解离可能导致富集接种的载体产量的降低或更长的模板双链体被富集的百分比增加。然而，捕获寡核苷酸和在间接捕获方法中形成的珠粒组装体的模板双链体之一的手柄部分之间的短杂交可能比模板双链体更容易和更快地解离，由此释放磁性珠粒并消除磁性珠粒强制模板双工。此外，捕获寡核苷酸的短核酸序列和模板双链的手柄部分可能比已分离的较长模板双链更容易结合，这可以减轻富集接种的载体产量的任何潜在降低。因此，可以选择捕获方法和捕获条件以匹配所需的接种的模板双链长度和接种的载体产量。通常，为了在使用直接捕获方法时优化接种载体的产量，使用更温和的条件(例如缓慢移取和温和混合)处理由此类方法生成的珠粒组装体，而不是剧烈条件(例如涡旋)。当使用间接捕获方法生成珠粒组装体时，接种的载体产量通常不会受到更剧烈地处理珠粒组装体的不利影响。
362.在富集预接种的载体的间接捕获方法的一些实施例中，通过在其中与接种的载体结合的双链模板核酸不会变性的条件下使捕获寡核苷酸与模板核酸上的手柄序列之间的相对较小的杂交区域变性，从与磁性珠粒结合的捕获寡核苷酸中洗脱所捕获的接种的载
体。例如，可以通过利用由手柄序列和捕获寡核苷酸形成的短杂交体的解链温度(tm)的差异(例如，在高盐缓冲液中的tm为约32℃)和双-与载体结合的链靶模板核酸(例如，tm大于32℃)。例如，在一些实施例中，任何适度的变性条件，例如增加的温度(例如，温和加热至大于35℃，如42℃持续约5分钟)、较低的盐浓度(例如，低te、添加水)或物理干扰或搅动(例如，涡旋、移取)可以用于解离捕获寡核苷酸-手柄序列杂交体而不破坏双链载体结合的模板核酸。与捕获寡核苷酸结合的磁性珠粒被丢弃，留下富集的双链模板与接种的载体结合。在其中含有手柄的引物的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列不互补并且在接种过程中使用的任何条件下不杂交以形成发夹结构的实施例中，过量的捕获寡核苷酸和过量的链霉亲和素包被的磁性珠粒可以包含在捕获过程中以确保捕获所有模板核酸接种的载体。在进一步的下游处理中(例如，在将接种的载体装载到反应位点或室，如表面上的微孔，例如芯片中，用于对与固体载体结合的模板进行模板化反应或测序)，可以将任何含有手柄的引物和未与载体结合的可以被磁性珠粒捕获并与接种的载体一起从其洗脱接种扩增反应产物与接种的载体分开，如本文所描述的。
363.与图57中描述的富集方法相比，在变性以去除磁性珠粒后产生结合到载体的单链模板，图59中描述的富集方法产生与变形后的载体结合的双链模板以去除磁性珠粒。在一些实施例中，将双链模板连接到载体上有助于检测可能在接种过程中发生的误差，排除对含有误差的模板接种的载体的任何下游分析结果的考虑，由此减少误差例如，在一群或多个接种的模板的测序的总体结果中。例如，在某些情况下，在生成与载体结合的双链模板时固定在载体上的引物的模板依赖性延伸期间可能发生聚合误差。如果发生这种类型的误差，并且后续捕获和富集接种的载体只会产生单链接种的模板，如图57所描述的，唯一可用于下游过程的模板序列(例如在模板化扩增和测序中)将含有误差。在此情况下，从接种的载体扩增的模板将是含有误差的单克隆序列群体，并且模板的测序将产生相同的读段。相反，如果双链接种的模板由间接捕获和富集产生，如图59所示，则两条链，即，一条是具有误差的延伸固定引物，另一条是与没有误差的所固定的引物可用于进一步处理和分析。这有效地将模板误差从100％(在只有单链接种的模板的情况下)稀释到约50％(即，接种误差率降低了约50％)。因为从这种双链接种的载体扩增的模板将产生多克隆序列群体(即，某些序列(约50％)有误差，而某些序列(约50％)没有误差)，误差可以是在下游分析中检测到，例如测序。在分析多个核酸模板群体的序列结果时，可以排除来自所述多克隆群体测序的序列读段。因此，如果绑定到正在测序的其它载体的模板中没有其它误差，则其余模板的测序误差率实际上为0％。
364.在一些实施例中，提供了一种生成一个或多个、或多个模板核酸群体，例如单克隆或基本上单克隆核酸群体的方法，所述方法包含：(a)获得多个载体，其中每个载体具有固定到所述载体的多个单链寡核苷酸引物和与所述载体连接的模板核酸，其中所述模板核酸在链的一端处包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列是寡核苷酸引物序列；(b)在溶液中存在第一引物的情况下，使与多个载体连接的模板核酸经受一次或多次或两次或更多次等温核酸扩增(例如，rpa反应)，其中第一引物包括与所连接的核酸链的在所述链的与具有连续核苷酸序列的末端相对的末端处的引物结合序列互补的核苷酸序列，所述连续核苷酸序列是所述寡核苷酸引物序列。在所述方法的一些实施例中，一种或多种或两种或更多种等温核酸扩增在单一反应混合物的单一连续液相内进行。在一些实施例中，使与载体连接
的核酸经受至少两种等温核酸扩增反应，其中第二扩增生成的与载体连接的核酸比第一扩增后连接的核酸多至少1000倍、至少100,000倍或至少1,000,000倍。在一些实施例中，在步骤(b)中，在存在(i)与溶液中的接头部分或亲和力部分连接的第一引物和(ii)连接或结合接头部分或亲和力部分的组合物的情况下，执行第一等温核酸扩增，并且所述方法进一步包括：(c)中断(b)的第一等温扩增和去除与第一引物的接头部分或亲和力部分连接的组合物以及(d)在溶液中存在第一引物且不存在与接头部分连接的组合物的情况下，使与多个载体连接的模板核酸经受第二等温核酸扩增，由此生成与载体连接的单克隆或基本上单克隆模板核酸群体，其中第二等温核酸扩增中存在的第一引物与接头部分(或亲和力部分)连接或不与接头部分(或亲和力部分)连接。在一些实施例中，在存在扩散限制性药剂例如聚合物例如纤维素或甲基纤维素的情况下进行一种或多种等温扩增。在一些实施例中，第一或第二等温核酸扩增是重组酶-聚合酶扩增。在一些实施例中，在存在扩散限制性药剂例如聚合物例如纤维素或甲基纤维素的情况下进行第一或第二等温扩增。在一些实施例中，步骤(a)的具有与载体连接的模板核酸的多个载体通过包含以下的方法获得：(1)获得核酸群体，其中每个核酸包含核酸链，所述核酸链在核酸链的5'端处包括第一连续核苷酸序列，其中第一连续核苷酸序列任选地包括与其连接的第一接头部分、在核酸链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于第一和第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中第一连续核苷酸序列和第二连续核苷酸序列不同，并且第一连续核苷酸序列基本上相同，并且第二连续核苷酸序列基本上相同，并且其中在一些实施例中，定位于第一和第二连续核苷酸序列之间的第三核苷酸序列在核酸群体中不同；(2)在退火条件下使核酸群体的单链与载体接触，以生成具有通过与第二连续核苷酸序列杂交而与其连接的单链核酸的载体，其中载体包括多个引物寡核苷酸，所述多个引物寡核苷酸具有与固定在其上的第二连续核苷酸序列互补的核苷酸序列；(3)延伸与核酸链杂交的载体的固定引物以生成与载体连接的双链核酸，其中双链核酸包括与载体直接连接的延伸链和与所连接的链杂交的链；以及(4)将双链核酸的链分开。在一些实施例中，步骤(2)中的载体的数量超过核酸分子的数量至少2倍或至少5倍。在一些实施例中，步骤(2)中的载体数量超过核酸分子数量至少2倍或至少2.5倍或至少3倍或至少3.5倍或至少4倍或至少4.5倍或至少5倍或至少5.5倍或至少6倍或至少6.5倍或至少7倍或至少7.5倍或至少10倍或至少15倍或至少20倍或至少25倍。
365.在一些实施例中，生成一个或多个、或多个模板核酸群体，例如与载体或表面连接的单克隆或基本上单克隆核酸群体的方法包含将一种或多种、或多种具有一个、一个或多个、或多个与其连接的核酸的载体或表面转移到表面上的一个或多个、或多个反应位点或室(例如，孔)。在一个实例中，此类方法包含转移一个或多个、或多个载体，所述载体具有固定于其上的多个单链寡核苷酸引物和与其连接的模板核酸，所述模板核酸包括在核酸的一端处的连续核苷酸序列，其是包括反应位点的表面的寡核苷酸引物序列，由此具有与其连接的核酸的载体被装载到单独的位点。在一些实施例中，在将具有与其连接的模板核酸的载体装载到单独的反应位点后，使核酸经受一种或多种或两种或更多种等温核酸扩增反应(例如，rpa反应)。在一些实施例中，所述方法进一步包括使与载体连接的经扩增核酸经受核酸测序。在一些实施例中，所述测序方法产生至少约4500万个长度为至少100个、至少200个或至少300个核苷酸的序列读段。在一些实施例中，所述测序方法产生至少6000万个长度为至少300个核苷酸的序列读段。在一些实施例中，所述测序方法产生至少约4500万或约
8000万个长度为至少100个核苷酸的序列读段。在一些实施例中，所述测序方法产生至少8000万个长度在约100与约400个核苷酸之间的序列读段。
366.在一些实施例中，生成一个或多个、或多个模板核酸群体，例如与载体或表面连接的单克隆或基本上单克隆核酸群体的方法包含在使与多个载体连接的模板核酸经受一种或多种、或两种或更多种等温核酸模板扩增之前形成多个捕获的载体。例如，在一种此类方法中，多个载体中的载体具有与其连接的双链或部分双链模板核酸，其中每个双链或部分双链模板核酸包括(1)与载体(例如，延伸的引物链)直接连接的连接链和与连接链杂交的链；以及(2)与连接链杂交的链上的接头部分或单链突出核苷酸序列。此方法包括：(i)通过使多个载体与和所述接头部分(或亲和力部分)结合的捕获部分或与和所述单链突出端核苷酸序列和捕获部分互补的寡核苷酸接触来生成多个所捕获载体，其中与所述单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸与所述单链突出端杂交并且包括与所述捕获部分结合的接头部分；(ii)收集所捕获载体；以及(iii)将具有与其连接的模板核酸的载体与捕获部分或与所述单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸分开。在所述方法的一些实施例中，步骤(i)的多个载体中的每个载体具有与载体连接的仅一个双链或部分双链模板核酸。在一些实施例中，捕获部分与珠粒或颗粒连接，并且在收集所捕获载体之后，通过以下将具有与其连接的模板核酸的载体与和所述珠粒或颗粒连接的捕获部分分开：解离双链模板核酸的链，由此生成与单链模板核酸连接的多个载体或通过解离与单链突出端核苷酸序列互补的寡核苷酸和单链突出端的杂合体，由此生成多个与含有单链突出端核苷酸序列的部分双链模板核酸连接的载体。在一些实施例中，在使与多个载体连接的模板核酸经受第一等温核酸扩增之前，将已与捕获部分分开的与模板核酸连接的载体转移到包括反应位点(例如，孔)的表面并且装载到单独的反应位点中，所述捕获部分与珠粒或颗粒连接。在一些实施例中，将载体转移到包括反应位点的表面，方法包括将与其连接的核酸的载体与磁性珠粒结合，其中载体上的核酸与磁性珠粒连接，并且将具有与其连接的核酸和磁性珠粒的组合载体递送到包括反应位点的表面，并向所述表面施加磁场，由此将具有与其连接的核酸的载体装载到单独的反应位点中。在一些实施例中，与捕获部分所连接的珠粒或颗粒是磁性载体，并且所捕获载体包括模板核酸结合的载体-磁性载体组装体，并且在步骤(ii)中收集所捕获载体包括向组装体施加磁场，从而将组装体与不包含磁性载体的元件分开。在生成一个或多个、或多个与载体连接的模板核酸群体的方法的一些实施例中，所述方法包含形成多个所捕获载体，载体具有与其连接的部分双链模板核酸，其中每个部分双链-链模板核酸包括(1)与载体(例如，延伸引物链)直接连接的连接链和与连接链杂交的链；以及(2)与连接链杂交的链上的单链突出端核苷酸序列。在此类实施例的一个实例中，部分双链模板核酸在包括以下的方法中生成：(a)在存在第一引物和第二引物的情况下，使初始核酸分子群体经受核酸扩增循环，其中：(1)多个核酸中的每个核酸包括核酸链，所述核酸链具有在所述链的5'端处的第一连续核苷酸序列、在所述链的3'端处的第二连续核苷酸序列和定位于所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列彼此不同，并且其中在所述群体中，核酸分子群体的第一核苷酸序列基本上相同，并且核酸分子群体的第二核苷酸序列基本上相同；(2)第一引物包括与第一核苷酸序列基本上相同的3'端核苷酸序列、5'端核苷酸序列和定位于3'端核苷酸序列与5'端核苷酸序列之间的不可复制部分；并且(3)第二引物包括(i)在第二核苷酸序列的5'端处与第二
核苷酸序列的一部分互补的核苷酸序列和(ii)与第二核苷酸序列不互补的且与序列连接的第四核苷酸序列，所述序列在互补序列的3'端处与第二核苷酸序列的一部分互补，并且其中第二引物不含有与第二核苷酸序列的3'端互补的核苷酸序列；(b)在存在所述第一引物和所述第二引物的情况下，使步骤(a)的扩增循环的产物经受核酸扩增循环以生成多种不同的产物，其中来自步骤(a)中的所述初始核酸分子群体中的每个单独核酸分子的步骤(b)的核酸扩增的所述多种不同核酸产物中的仅一种核酸产物包括在3'端处具有与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的链和在5'端处的单链区域，所述单链区域包含所述不可复制部分和所述第一引物的5'端核苷酸序列；(c)在退火条件下使步骤(b)的所述核酸产物的单链与固定有与所述第四核苷酸序列基本上相同的多个单链寡核苷酸引物的载体接触，由此将步骤(b)的包括与所述第四核苷酸序列互补的核苷酸序列的所述核酸产物的单链与和所述第四核苷酸序列基本上相同的所述单链寡核苷酸杂交以生成与包括部分双链核酸的模板核酸连接的载体；以及(d)通过模板依赖性核酸合成使所述部分双链核酸的所固定的寡核苷酸引物部分的3'端延伸以生成延伸双链核酸，其中所述所固定的寡核苷酸引物部分的延伸继续到延伸链杂交的存在于所述模板链上的所述不可复制部分的点，并且然后中断，从而导致部分双链核酸含有包含所述第一引物的5'端核苷酸序列的单链突出端核苷酸序列，由此产生连接有模板核酸的多个载体，其中每个载体具有与其连接的不同的部分双链模板核酸。在此方法的一些实施例中，第一引物的5'端核苷酸序列和第一引物的3'端核苷酸序列至少基本上彼此互补。
367.在一些实施例中，用于本文所描述的预接种或模板化方法中的载体或表面被转移到反应位点或室，例如表面上的微孔，例如芯片或半导体芯片，用于进一步的下游处理(例如，用于模板化反应或对与载体结合的模板进行测序)。本文所提供的用于转移具有一个、或一个或多个、或多个与其连接的核酸模板的载体或表面的一种方法包含通过第二接头部分与第一接头部分的连接，将具有第二接头部分的磁性载体例如珠粒与核酸模板联接，从而形成模板连接的载体-磁性载体组装体(例如，珠粒或载体组装体)；以及使用磁场将载体沉积到表面例如测序装置的反应位点或室例如孔中，其中核酸模板具有连接的第一接头部分。在一些此类实施例中，在包括以下的方法中生成具有一个、或一个或多个、或多个与其连接的核酸模板的载体或表面：生成包含捕获序列部分、模板部分和引物部分的模板核酸；在与和捕获序列部分互补的捕获引物联接的载体上捕获模板核酸，捕获引物与模板核酸的捕获序列部分杂交；延伸与模板核酸互补的捕获引物以形成与模板核酸互补并杂交的靶核酸；将杂交的模板核酸和靶核酸分开；将接头修饰的引物与载体上的靶核酸杂交，接头修饰的引物包含接头部分；延伸与靶核酸互补的接头修饰的引物；将磁性载体例如珠粒与接头部分联接，磁性载体具有与接头部分连接的第二接头部分；以及使用磁场将载体沉积到表面例如测序装置的反应位点或室例如孔中，其中核酸模板具有所连接的第一接头部分。在一些实施例中，所述方法进一步包括使所述模板核酸和所述序列靶核酸分离，以从所述载体复合物释放所述磁性载体。在一些实施例中，分离包含变性，例如热变性、酶变性、在存在离子溶液的情况下的变性。在一些实施例中，所述方法进一步包括从具有反应位点的表面洗涤磁性载体。
368.在本文所提供的方法以及用于执行所述方法的设备、装置、系统、组合物和试剂盒的一些实施例中，使用本文所描述的方法、设备、装置、系统、组合物和试剂盒来对与模板化
载体或表面或位点连接的一个或多个单克隆或基本上单克隆模板核酸群体进行测序，其中在如本文所描述的预接种或模板化方法中生成模板核酸群体。
369.测序
370.在将靶序列装载到传感器装置上并且进行模板化以形成单克隆靶序列群体之后，各个类型的核苷酸的核苷酸溶液可以依次流过传感器装置的流通池。可以从传感器装置测量响应于核苷酸流的信号。此类信号可以用于碱基识别以确定碱基顺序。可以比对和分析较小序列的顺序以确定比对的读段和变异识别。
371.核苷酸溶液可以通过传感器装置的流通池以提高系统性能如读长的流动顺序提供。例如，可以遵循在2016年8月30日授予的us9,428,807中描述的流动顺序，所述专利通过引用整体并入本文。
372.用于检测碱基的示例核苷酸流、信号检测和信号处理可以如2019年3月26日授予的us10,241,075中所描述的进行，所述专利通过引用整体并入本文。
373.性能定义和参数
374.上述系统和方法提供了期望的技术优势，包含性能和自动化。具体地，在有限的人为干预下，上述系统可以在所需的短时间内执行从提取的dna或rna样品到比对读段或变异识别的测序操作。例如，一旦将样品和消耗品(试剂条、移液管尖端、传感器装置和衔接子等)提供给仪器，仪器就可以执行测序和数据处理而无需进一步的人工干预。在一实例中，在用于核酸分析的样品处理方面不熟练的用户可以设置测序系统并且指导系统执行测序分析而无需进一步干预。
375.在一实例中，所述系统和方法以至少98.5％的原始读段准确度(通过与参考序列比对测量的碱基识别的序列的准确度)提供运行和分析。例如，原始读段准确度可以为至少99.0％，如至少99.1％甚至99.2％。在一实例中，原始读段准确度不大于99.99％。
376.在另外的实例中，系统和方法以至少100b的q20平均读长(q20mrl)提供运行和分析。q20读长是从读段开始的碱基的数量，所有碱基的phred质量评分至少为20。q20平均读长是所有序列的q20读长的平均值。在一实例中，q20 mrl为至少100b。例如，q20 mrl在100b到450b的范围，如102b到300b的范围或104b到300b的范围内。
377.在另外的实例中，所述系统和方法提供具有至少95％的均匀性的运行和分析。例如，均匀性可以在96％到99.9％的范围，如96％到98％的范围内。
378.在另一实例中，所述系统和方法提供具有至少80％的灵敏度的运行和分析。灵敏度为真阳性识别数量除以对照样品中所有真变异的数量。对于以检测限百分比提供的对照样品，可以进一步确定这种灵敏度，所述检测限百分比是测序数据可以检测到的最低变异百分比。例如，灵敏度可以为至少90％。在一实例中，灵敏度可以在90％到100％的范围内，如90％到99％的范围或94％到99％的范围内。具体地，拷贝数变异灵敏度可以在80％到100％的范围内，如90％到100％的范围或95％到100％的范围内。
379.在另外的实例中，系统和方法提供具有小于0.5的所有成对差异的绝对值的中值(mapd)的运行和分析。对于给定运行，每个图块的log2比率之间的所有成对差异的绝对值的中值mapd。图块大致对应于ion ampliseq
tm
测定中的扩增子。每对在基因组距离方面被定义为相邻的。mapd是对拷贝数变异性的每次测序运行估计，类似于标准偏差(sd)。例如，mapd在0.5到0.001的范围内，如0.5到0.01的范围或0.4到0.01的范围内。
380.在另外的实例中，系统和方法提供具有至少97％，如在98％到100％的范围内，如在98％到99.9％的范围内或在98.1％到99.9％的范围内的平均中靶读段百分比的运行和分析。平均中靶读段百分比是映射到任何靶向区域的过滤读段相对于映射到参考的所有读段的百分比。如果至少一个比对的碱基与至少一个靶区域重叠，则认为读段中靶。
381.在另外的实例中，所述系统和方法提供具有在1300万个碱基到1亿个碱基的范围内，如在1300万个碱基到6000万个碱基的范围内或在1450万个碱基范围到2500万个碱基的范围内的总读段数的运行和分析。在另一实例中，所述系统和方法提供具有在5m到20m的范围内，如在5m到14m的范围内的映射读段/文库的运行和分析。在另外的实例中，包含多泳道流通池的传感器装置的每个泳道的总读段数可以在50万个碱基到4800万个碱基，如50万个碱基到1400万个碱基的范围内。
382.在另外的实例中，所述系统和方法提供具有不大于80％的条形码(bc)不平衡的运行和分析。bc是具有最小映射读段/平均映射读段的条形码。
383.在另一个，所述系统和方法提供具有至少25k的每文库读段覆盖率，如在25k到100k的范围内或在25k到50k的范围内的读段覆盖率的运行和分析。读段覆盖率/文库是映射到扩增子的读段数量。
384.在另外一个实例中，所述系统和方法提供具有覆盖深度或至少800，如在800到5000的范围内、在800到4000的范围内或在1000到3500的范围内的覆盖深度的运行和分析。覆盖深度是所有靶向参考碱基的平均读段数量。这是中靶碱基读段总数除以靶向碱基的数量，因此包含任何没有覆盖的碱基。
385.在另外的实例中，所述系统和方法提供具有至少75bp，如在75bp到200bp的范围内或在75bp到110bp的范围内的未比对读长的运行和分析。未比对读长是未与参考比对的读段的平均读长。
386.在另一实例中，所述系统和方法提供具有在100到10000的范围，如在250到10000的范围内、在300到10000的范围内或在300到5000的范围内的每文库分子覆盖率的运行和分析。每文库分子覆盖率是映射到扩增子的分子家族的数量。
387.在另外的实例中，所述系统和方法提供具有至少90％的端到端读段的运行和分析。端到端读段是在质量过滤后读取端到端的读段，即在读取结束时报告3'衔接子的读段。
388.在另外的实例中，所述系统和方法提供具有至少90％，如在90％到100％的范围内、在92％到99％的范围内或在94％到99％的范围内的阳性预测值的运行和分析。阳性预测值是报告的变异是样品中真变异的概率。
389.在另外的实例中，所述系统和方法提供具有不大于每正常样品1fp的特异性的运行和分析。对于具有已知真变异的对照样品，特异性是真阴性识别数量除以(所有真阴性识别数量+假阳性识别数量)。
390.实例
391.实例1——用单循环pcr预接种isp，然后进行等温扩增
392.在此方法中，固体载体(ion torrent离子球形颗粒(isp))预接种有单克隆模板，并且在等温扩增(模板化反应)之前分配到ion torrent半导体测序芯片的孔中，用于下游下一代测序。将预接种的isp与无模板对照(“ntc”)isp进行比较，所述无模板对照isp在模板化反应期间而非在模板化反应之前和在预接种反应期间在溶液中具有相同模板多核苷
酸。使用各种度量，比较不同扩增反应产生的测序结果。
393.生成模板核酸分子
394.使用来自oncomine聚焦测定(ofa)(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)的pcr引物1、12和13，从基因组dna扩增dna。在第二带尾pcr的10个循环期间，向扩增子中，添加促进与接种反应中使用的溶液中的所固定引物b和引物a结合的衔接子。扩增生成3个模板：ofa 1ab，19.2ng/μl(148nm)；ofa 12ab，15.6ng/μl(100nm)；以及ofa 13ab，17.2ng/μl(76nm)。
395.预接种反应
396.制备ofa 1 ab、ofa 12 ab和ofa 13 ab模板的稀释液，且用于在预接种反应中生成单独预接种的p1 isp。预接种反应包含6.67μl具有固定的引物b的p1 isp(400,000,000isp)、88.33μl 1x铂hifi混合物(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)和5μl适当的模板稀释液，以生成期望数量的基本上单克隆模板分子(对于p1 isp，拷贝数为70,665和4,170)。将isp预接种反应混合物置于热循环仪中以进行98℃的变性步骤2分钟，随后98℃持续25秒和56℃持续10分钟，以生成预接种的isp。为了检查isp的相对大小，将1μl各预接种的p1 isp稀释于999μl退火缓冲液(ion pgm
tm hi-q
tm
view sequencing solution，(产品号a30275))中，且使用guava easycyte流式细胞仪(马萨诸塞州比尔里卡emd密理博)分析。也分析在不存在结合的模板下，ntc p1 isp的相对大小。
397.在总体积1ml的onetouch wash solution洗涤缓冲液中，洗涤残留的预接种的p1 isp两次。在第一次洗涤之后，在》21,000g下离心样品8分钟，且去除上清液，留下约100μl。在第二次洗涤和离心之后，去除上清液，留下约50μl样品于管中。随后，样品用300μl新鲜制备的熔脱溶液(melt off solution)(125mm naoh，0.1％tween 20)处理，且在室温下温育5分钟之前充分地涡旋。随后，这些样品用无核酸酶(nuclease-free；nf)的h2o洗涤三次，最终体积为1ml。在每一次洗涤之后，在》21,000g下离心样品8分钟，且去除上清液，留下约100μl。为了检查在最后一次洗涤之后预接种的p1 isp的大小，将1μl各预接种的p1 isp稀释于99μl退火缓冲液中，且使用guava easycyte流式细胞仪分析。也分析在不存在结合的模板下，ntc p1 isp的相对大小。
398.确定预接种的p1 isp上的拷贝数量
399.基于在洗涤之后来自guava easycyte流式细胞仪的样品计数，制备预接种的p1 isp的稀释液，得到50,000、5,000、500或50isp/μl。这些稀释液如下用于qpcr反应中：10μl fast sybr(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司)、0.2μl 10μm截短的pcr a引物(seq id no:2)、0.2μl 10μm截短的pcr b引物(seq id no:3)、2μl预接种的p1 isp和7.6μl nf h2o。将反应混合物置于实时pcr仪中以进行95℃变性步骤20秒，随后40个循环(95℃持续3秒和60℃持续30秒)。将各qpcr反应的ct与具有已知分子数量的qpcr反应的c
t
值进行比较，以计算各isp上的单克隆模板的拷贝数。将具有相同的预接种的模板量的样品合并，以获得各组每isp的平均拷贝数。
400.将具有相同的各单克隆模板的拷贝数的预接种的isp合并，即将已预接种有82个ofa 1ab、ofa 12ab或ofa 13ab拷贝的isp全部合并，和类似地将预接种有775个模板拷贝的isp合并，以及将预接种有5,400个模板拷贝的isp合并。
401.盒装载
402.ion torrent 541芯片用100μl 100mm naoh洗涤60秒，用200μl无核酸酶水冲洗，用200μl异丙醇冲洗且抽吸干燥。为了装载芯片，涡旋isp(500,000,000个ntc isp或合并、预接种的isp)，用退火缓冲液(ion pi
tm hi-q
tm sequencing 200试剂盒，离子激流公司(ion torrent))补到45μl，且通过装载端口注射到处理的芯片中。在1424rcf下离心芯片2分钟。将1ml泡沫(将980μl 50％退火缓冲液，与20μl 10％triton x-100合并，吸取1ml空气在其中，且通过移液管进一步混合泡沫5秒)注射到芯片中，且抽吸过量的泡沫。将200μl 60％退火缓冲液/40％异丙醇冲洗溶液注射到芯片，且抽吸芯片到干燥。芯片用200μl退火缓冲液冲洗，且将芯片真空干燥。对于具有预接种的isp的芯片，向芯片中添加40μl pbst，且用35μl pbst填充各端口。对于具有ntc isp的芯片，向110μl退火缓冲液中添加5μl 100pm文库(等份ofa 1ab、ofa 12ab和ofa 13ab)，以制备文库混合物。向芯片中添加40μl文库混合物，用35μl文库混合物填充各端口。将芯片置于热循环仪上，且循环一次(在95℃下1分钟，随后37℃2分钟，随后4℃)。芯片用200μl退火缓冲液冲洗一次且保留为湿润的。
403.模板化反应和测序
404.ion pgm
tm
模板ia沉淀物用871μl的ion pgm
tm
复水缓冲液复水，充分地涡旋，并且短暂旋转。对各芯片注射40μl沉淀物ia溶液，且从出口抽吸置换的退火缓冲液。向装载端口中添加20μl沉淀物ia溶液，并且在1424rcf下旋转芯片2分钟。为了活化沉淀物ia溶液，将218.2μl ion pgm
tm
启动溶液与8μl引物a合并，并且添加到沉淀物ia溶液中。涡旋活化的沉淀物ia溶液且短暂旋转。向各芯片中，注射60μl活化的沉淀物ia溶液，且抽吸置换的流体。各芯片将另外35μl沉淀物ia溶液添加各端口。将芯片置于设定为40℃的热循环仪上，封盖，且温育15分钟。芯片用200μl 0.5m edta真空冲洗，且抽吸干燥。芯片用200μl退火缓冲液真空冲洗，且抽吸干燥。芯片用200μl 1％sds真空冲洗两次，且抽吸干燥。芯片用200μl冲洗溶液(50％异丙醇/50％退火缓冲液)真空冲洗，且抽吸干燥。随后，芯片用200μl退火缓冲液冲洗，且抽吸干燥。向各芯片中，将40μl引物混合物(250μl测序引物和250μl退火缓冲液)注射到流通池中，且向各端口中添加35μl引物混合物。将芯片置于热循环仪上，且循环一次(在95℃下2分钟，随后37℃2分钟，随后4℃)。芯片用200μl退火缓冲液冲洗一次且抽吸。向各芯片中添加60μl酶混合物(60μl退火缓冲液和6μl psp4酶)，且温育5分钟。将芯片真空干燥，且紧接着添加100μl退火缓冲液。将芯片装载到ion proton系统上用于测序。ion proton系统用hi-q 200材料启动，且使用400个流动(flows)进行测序。
405.结果
406.对isp预接种单克隆模板，且随后将预接种的isp装载到ion torrent测序芯片上，比ntc isp生成更好的测序度量值，其具有连接的单克隆模板且在一个反应中扩增。所装载的isp的百分比增加，其中82个模板拷贝预接种到isp上，但较高水平的预接种将所装载的isp的百分比降低低于ntc isp(图61a)。可使用读段的百分比随着预接种的isp而增加(图61b)。在总读段数方面，预接种的isp相对于ntc isp也具有至多9倍增加，且在读长的平均值、中值和众数方面，大于2倍增加(图61c-61d)。所有预接种的isp均显示较低的低质量孔百分比和无模板孔百分比(图61e-61f)。这个实例表明，在其中在分配在ion torrent芯片的孔内的isp上进行模板化反应的方法中，isp可以预接种有单克隆模板核酸分子，以实现测序数据改进。
407.实例2——在载体上生成基本上单克隆模板核酸群体
408.预接种/接种
409.在pcr管中，将ion ampliseq外显子组文库的12亿拷贝(20μl 100pm，具有标准ion torrent a和p1文库衔接子)与3μl 3μm生物素-tpcra(序列5'生物素-seq id no:2)和3μl 1.5μm b-trp1(trp1是ion p1衔接子的23聚体片段，序列为seq id no:1；b是与ion torrent离子球形颗粒(isp)连接的引物序列)引物以及9μl ion ampliseq hifi主混合物5
×
或其它合适的含聚合酶混合物，例如缺乏3'-5'核酸外切酶活性的混合物混合。用10μl无核酸酶水将体积补足到45μl。用以下温度分布，在热循环仪上使管进行热循环：在98℃下2分钟、2个[在98℃下15秒-在58℃下2分钟]循环，最终保持在10℃。在热循环之后，向管中添加60亿isp(75μl，8000万/微升)和6μl ion ampliseq hifi主混合物5
×
。也添加5μl无核酸酶水以将总体积带到131μl。将溶液充分混合，且将管返回热循环仪。用以下温度分布进行第三个扩增循环：在98℃下2分钟，在56℃下5分钟，最终保持在10℃。在热循环之后，添加5μl edta 0.5m，并且混合，以终止反应。
[0410]
富集isp
[0411]
将myone抗生蛋白链菌素c1珠粒(120μl)转移到单独管中，且将管置于磁体上以使磁性珠粒沉淀。丢弃上清液，且从磁体移出管。珠粒通过再悬浮于150μl ion torrent退火缓冲液中来洗涤，随后在磁体上沉淀。丢弃上清液，且另外重复一次用150μl退火缓冲液洗涤。在从第二洗涤液丢弃上清液之后，用50μl退火缓冲液再悬浮洗涤的myone c1珠粒。将退火缓冲液中的洗涤后的myone c1的全部内含物转移到含有文库和isp的热循环的pcr管中。将移液管体积设定为160μl，且通过在1秒/抽吸下来回吸取三次或施配运动将内含物缓慢混合。使混合物在室温下在无搅动下静置30分钟，以使磁性珠粒捕获文库接种的isp。随后，将管置于磁体上以使磁性珠粒沉淀，且丢弃上清液。向沉淀物中添加含tween-20(25μl，0.1％)的水。剧烈地涡旋混合物以从myone c1珠粒洗脱接种的isp。脉冲旋转管，随后返回磁体。将含有接种的isp的上清液(洗脱液)收集到新鲜管中以用于下游芯片装载和扩增步骤。
[0412]
芯片制备和ips在芯片上的磁性装载
[0413]
将含有反应室微孔芯片的ion torrent半导体芯片用200μl nf水冲洗2次。将dynabeads m-270抗生蛋白链菌素(150μl；赛默飞世尔科技公司)，其是具有与其表面结合的抗生蛋白链菌素的磁性珠粒，转移到管中，随后将管置于磁体中以使磁性珠粒沉淀。丢弃上清液，且从磁体移出管。随后，向含有m-270沉淀珠粒的管中添加以下：20μl来自接种过程的isp混合物，9μl 5
×
退火缓冲液和16μl无核酸酶水，总计45μl。可替代地，将20ul isp/文库混合物与3.2ul 10
×
退火缓冲液、3ul浓m270磁性珠粒和5.8ul水混合，总计32ul。混合混合物以再悬浮m-270沉淀物，且通过装载端口缓慢注射到芯片中。放在芯片下方的磁体反复来回扫描芯片，以将isp装载到芯片微孔中。以30秒/扫描，进行磁性装载扫描40分钟。在装载之后，剧烈地振荡含有5ml 1％sds的15ml falcon管，以生成致密泡沫，随后将800μl注射入芯片以从芯片流通池去除磁性珠粒。丢弃芯片出口处的流过物。随后，将退火缓冲液(200μl)注射入芯片，且丢弃流过物。从芯片出口真空干燥芯片。将冲洗液(200μl，60％退火缓冲液，40％ipa)注射入芯片，随后真空干燥芯片。注射退火缓冲液(200μl)以填充芯片流通池，且丢弃芯片出口处的流过物。芯片用退火缓冲液填充，直到准备在下游扩增步骤中扩增为止。
[0414]
扩增
[0415]
第一步骤扩增
[0416]
对于正扩增的各芯片来说，将1.1ul生物素标记的引物a(100um)和1ul封端分子(复水于缓冲液中的10mg/ml中性抗生物素蛋白)合并在管中，且在冰上温育》15分钟。向来自ion pgm
tm
模板ia 500试剂盒的含有用于进行重组酶-聚合酶扩增的反应组分(例如，重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、核苷酸、缓冲液和其它成分)的1
×
ia沉淀物(pn 100032944)中，添加复水缓冲液(871μl)。脉冲涡旋溶液10
×
，且快速旋转，以收集管内含物。在过程期间，将复水的内含物(被称作“沉淀物溶液”，大约900ul)保持在冰上。对于各ion torrent芯片来说，将60μl复水的ia沉淀物溶液缓慢注射到芯片中。从出口抽吸置换的退火缓冲液。在rt下，将芯片与复水的ia沉淀物溶液一起温育4分钟。
[0417]
对于正扩增的各芯片来说，将90ul复水的ia沉淀物溶液转移到新管中。添加先前制备的生物素标记的引物a和中性抗生物素蛋白封端分子(2.1ul)，且脉冲混合。向复水的ia沉淀物溶液的管中添加含有28mm mg(oac)2水溶液、10mm乙酸tris和3.75％(v/v)甲基纤维素的启动溶液(30μl)，脉冲涡旋10
×
，且快速旋转，以形成总体积为约120ul的活化的扩增溶液。对于各芯片来说，将约60μl活化的扩增溶液缓慢注射到芯片中。从两个端口抽吸所有置换的流体。接下来，向各芯片端口中添加25μl残留的活化的扩增溶液。将芯片放到设定为40℃的加热板(热循环仪)上。芯片用移液管尖端盒盖或类似盖(不是加热的热循环仪盖子)盖住，且温育2.5分钟。
[0418]
短暂反应终止和在扩增步骤之间的清洁
[0419]
从加热板或热循环仪取下扩增的芯片。在真空抽吸出口同时，将200μl0.5m edta ph 8(vwr e522-100ml)注射到芯片中，且随后使用真空抽吸芯片到干燥。在一些方法中，没有将edta添加到芯片中，而是将退火缓冲液注入芯片中以中断反应。在真空抽吸出口同时，将200μl 1
×
ab注射到芯片中，随后抽吸芯片到干燥。另外重复ab添加两次，且填充芯片以进行第2步骤扩增。(抽空ab两次，且将第三个ab添加留在芯片中。)
[0420]
第二步骤扩增(无封端剂)
[0421]
对于各芯片来说，将60ul复水的沉淀物溶液减缓注射到芯片中。从出口抽吸置换的退火缓冲液。在rt下，将芯片与沉淀物溶液一起温育4分钟。对于正制备的各芯片来说，将90ul复水的沉淀物溶液转移到新鲜管中。添加生物素标记的引物a(1.1ul，100um)，且脉冲涡旋管且旋转。向含有复水的沉淀物溶液和引物a的管中添加启动溶液(30μl)，且脉冲涡旋10
×
，且快速旋转，以生成活化的扩增溶液。将大约60μl活化的扩增溶液注射到芯片中。从两个端口抽吸置换的流体。向各端口中添加另外25μl残留的扩增溶液。将芯片放到设定为40℃的加热板(热循环仪)上。芯片用移液管尖端盒盖或类似盖盖住，并且温育20分钟。
[0422]
反应终止和清理
[0423]
将已经受扩增反应的芯片放置在配备有真空的罩附近。在真空抽吸出口同时，添加200μl 0.5m edta ph 8，并且抽吸芯片以干燥芯片。在一些方法中，没有将edta添加到芯片中，而是将退火缓冲液注入芯片中以中断反应。在真空抽吸出口同时，添加200μl 1
×
ab，并且随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μl含1％sds溶液的水(ambion pn am9822)，并且随后抽吸以干燥芯片。重复sds洗涤。在真空抽吸出口同时，添加200μl甲酰胺。在50℃下温育芯片3分钟，随后抽吸以干燥芯片。在真空抽吸出口同时，添加200μl冲洗
(50％ipa/50％ab)溶液。抽吸芯片到干燥。在真空抽吸出口同时，添加200μl退火缓冲液。将芯片留在1
×
ab中，直到准备引发为止。
[0424]
芯片上测序引物杂交和酶反应
[0425]
将含有ion测序引物(100um)的管解冻。对于正测序的各芯片来说，制备40ul退火缓冲液和40ul测序引物的引物混合物，且涡旋孔。抽吸芯片到干燥，随后向芯片中添加80μl引物混合物(流通池中50μl，各端口中15μl)。将芯片置于热循环仪上，且在50℃下温育2分钟，在20℃下温育5分钟。在真空抽吸出口同时，注射200μl 1
×
ab。用60μl退火缓冲液和6μl测序酶(ion psp4测序聚合酶)制备酶混合物。清洁端口且从入口抽真空以干燥芯片。向芯片中添加酶混合物(60μl)，且在rt下温育5分钟。抽吸芯片到干燥。紧接着注射ab(100μl，1
×
)以填充芯片。清洁端口，将芯片背面干燥，且将芯片装载到ion torrent proton(赛默飞世尔科技公司)设备上以用于对文库核酸进行测序。
[0426]
实例3——使用不同核酸操纵方法测序结果的比较
[0427]
图60示出使用四个不同扩增条件(图中a-d)所生成的核酸模板的核酸测序运行组的总可使用读段。在方法a中，根据本文中实例2中所描述的方法，将非模板化离子球形颗粒(isp)装载到ion torrent 541芯片的微孔中。随后，在将文库扩增子注射到芯片中之后，通过单次95℃1分钟/37℃1分钟热循环步骤，使具有与isp引物互补的衔接子的文库分子(110bp hg19片段文库)与预装载的isp杂交。在文库杂交之后，使用基本上如实例2中所描述的单步rpa模板化扩增方法进行扩增。引物未被生物素标记。方法b相对于扩增方案a采用两个重要变化：1)在模板化扩增之前另外扩增步骤(“第一”扩增步骤)；和2)在所添加的第一扩增步骤中并入中性抗生物素蛋白和生物素标记的溶液引物。在这个实例中，第一扩增步骤，其是等温rpa扩增，是2.5分钟，且含有等效浓度的生物素标记的溶液引物和中性抗生物素蛋白。第二扩增步骤是15分钟，且不含有中性抗生物素蛋白。在这个方法中，第一扩增步骤用于局部扩增模板拷贝同时添加拖拽(drag)(通过中性抗生物素蛋白)以限制新生链的孔-2-孔扩散。在2.5分钟之后，产生足够的局部拷贝，不再需要拖拽组分。随后，如实例2中所描述进行第二扩增步骤。在方法c和d中，使用220bp hg19 ampliseq外显子组文库。通过用如本文实例6中所描述的溶液类预扩增isp富集方法置换方法a和b中的文库杂交方法，方法c对于方法b进行改进。因此，代替在孔中进行所有步骤，在溶液中完成文库与isp杂交的第一步骤，随后向管中添加磁性珠粒，富集含模板的isp，并且随后与磁性珠粒分开并装载到孔中以如方法b中所完成的进行2步扩增。预扩增富集方法使得能够装载具有单一文库模板拷贝的isp。最终，相较于方法c，根据方法c进行的扩增方法d采用经修饰的isp引物序列。经修饰的引物av4具有序列seq id no:4。如图60所示，由方法a-d得到的改进组合使得总读段数能够等效于对于通过乳液pcr扩增的模板核酸进行的测序。
[0428]
实例4.模板核酸接种方法和接种的载体的间接捕获
[0429]
在这种用靶模板核酸接种固体载体的方法(如图58所示)中，进行了一系列衔接子修饰的核酸文库分子的扩增反应以生成能够连接到通过与固定在载体上的引物杂交的固体载体。所述产品包含单链的5'端突出端，称为“手柄”，提供短序列，可与捕获寡核苷酸杂交，用于富集靶模板核酸结合的载体。
[0430]
接种方法
[0431]
pcr扩增混合物是通过将文库dna与聚合酶和两种引物组合来制备的：(1)具有核5×
退火缓冲液和16μl无核酸酶水，总共45μl。混合混合物以再悬浮m-270沉淀物，且通过装载端口缓慢注射到芯片中。放在芯片下方的磁体反复来回扫描芯片，以将isp装载到芯片微孔中。装载后，磁性珠粒和多余的isp从芯片流通池中去除。然后使微孔中接种的isp上的核酸进行两步扩增过程，如实例6中所描述，在两个扩增反应之间进行短暂的反应停止和芯片清洗。
[0437]
使用ion proton(赛默飞世尔科技公司)系统对含有扩增模板的isp进行测序。将含有ion测序引物(100um)的管解冻。对于正测序的各芯片来说，制备40ul退火缓冲液和40ul测序引物的引物混合物，且涡旋孔。抽吸芯片到干燥，随后向芯片中添加80μl引物混合物(流通池中50μl，各端口中15μl)。将芯片置于热循环仪上，且在50℃下温育2分钟，在20℃下温育5分钟。在真空抽吸出口同时，注射200μl 1
×
ab。用60μl退火缓冲液和6μl测序酶(ion psp4测序聚合酶)制备酶混合物。清洁端口且从入口抽真空以干燥芯片。向芯片中添加酶混合物(60μl)，且在rt下温育5分钟。抽吸芯片到干燥。紧接着注射退火缓冲液(100μl，1
×
)以填充芯片。清洁端口，将芯片背面干燥，并且将芯片装载在ion proton设备上以用于对文库核酸进行测序。oncomine焦点测定文库和oncomine综合测定v3文库序列读段的平均读长分别为113bp和109bp。大多数(99％)已识别读段与靶区域对齐。
[0438]
实例5
[0439]
使用ofa测定从四个样品中自动制备文库。在上文实例2中描述的自动化过程中，所述文库被应用于四泳道ion torrent芯片的单泳道。变异识别报告在13.8小时内提供1470万个读段。所述运行的原始读段准确度为98.98％，并且q20 mrl为110bp。
[0440]
实例6
[0441]
使用具有dna和rna的ocav3测定从六个样品中自动制备文库。在上文实例2中描述的自动化过程中，所述文库被应用于ion torrent芯片的四个泳道。变异识别报告在30.3小时内提供5620万个读段。所述运行的原始读段准确度为99.05％，并且q20 mrl为107bp。
[0442]
实例7
[0443]
使用tcrβ-lr测定从四个样品中自动制备文库。在上文实例2中描述的自动化过程中，所述文库被应用于ion torrent芯片的一个泳道。变异识别报告在18.7小时内提供1460万个读段。所述运行的q20 mrl为292bp。
[0444]
实例8
[0445]
自动制备两个文库，第一个文库使用ofa测定从四个样品中制备，并且第二个文库使用tcr-β-lr测定从四个样品中制备。在上文实例2中描述的自动化过程中，所述文库被应用于ion torrent芯片的单个泳道。变异识别报告在22.1小时内提供，每个泳道的相应读段为1350万个读段和1170万个读段。包含第一文库的第一泳道提供原始读段准确度为99.1％，并且q20 mrl为112bp。具有第二文库运行的第二泳道的q20 mrl为275bp。
[0446]
实例9
[0447]
执行一组6次运行，每次利用使用ofa测定从四个样品自动制备的文库，并且在上文实例2中描述的自动化过程中应用于四泳道ion torrent芯片的单个泳道。变异识别报告在13.8小时内提供。运行提供的平均性能如下：
[0448] 平均cv(％)原始准确度99.20.1
q20 mrl104.50.5总读段数(m)13.14.4碱基覆盖率的均匀性98.60.4平均中靶读段百分比98.10.1
[0449]
实例9
[0450]
执行一组4次运行，每次利用从源自ffpe dna/rna的六个样品自动制备的文库并使用ocav3测定，并且在上文实例2中描述的自动化过程中应用于ion torrent芯片的四个泳道。变异识别报告在30.8小时内提供。运行提供的平均性能如下：
[0451]
度量平均值％cv总读段数/泳道12.9m12.10 11.7％dna-扩增子均匀性95.1％1.4％dna-映射读段602280716.2％dna-覆盖深度146513.9％dna-mapd0.3169.3％dna-未比对的rl100.64.1％bc不平衡《80％
‑‑
[0452]
核苷酸序列
[0453]
seq id no核苷酸序列1cctctctatgggcagtcggtgat2ccatctcatccctgcgtgtc3cctatcccctgtgtgccttg4attcgagctgttcatctgtatcttgcgctaccaa
[0454]
在第一方面，一种测序系统包括自动测序仪器，所述自动测序仪器适于以至少98.5％原始读段准确度的性能和在5小时到14小时的范围内的运行时间确定一个或多个提取的多核苷酸样品的变异识别，以在使用具有每样品一个dna池和在100个碱基到120个碱基的范围内的平均扩增子大小的靶向测定对4个提取的多核苷酸样品进行测序时确定变异识别。
[0455]
在第二方面，一种测序系统包括自动测序仪器，所述自动测序仪器适于以至少98.5％原始读段准确度的性能和在15小时到24小时的范围内的运行时间确定一个或多个提取的多核苷酸样品的变异识别，以在使用具有每样品一个dna池和在100个碱基到120个碱基的范围内的平均扩增子大小的靶向测定对32个提取的多核苷酸样品进行测序时确定变异识别。
[0456]
在第三方面，一种测序系统包括自动测序仪器，所述自动测序仪器适于以至少98.5％原始读段准确度的性能和在20小时到30小时的范围内的运行时间确定一个或多个提取的多核苷酸样品的变异识别，以在使用具有每样品两个dna池和每样品两个rna池以及在100个碱基到120个碱基的范围内的平均扩增子大小的靶向测定对6个提取的多核苷酸样品进行测序时确定变异识别。
[0457]
在第四方面，一种测序系统包括自动测序仪器，所述自动测序仪器适于以至少98.5％原始读段准确度的性能和在20小时到28小时的范围内的运行时间确定一个或多个
提取的多核苷酸样品的变异识别，以在使用具有每样品一个dna池和在190个碱基到220个碱基的范围内的平均扩增子大小的靶向测定对12个提取的多核苷酸样品进行测序时确定变异识别。
[0458]
在第五方面，一种测序系统包括自动测序仪器，所述自动测序仪器适于以至少98.5％原始读段准确度的性能和在15小时到24小时的范围内的运行时间确定一个或多个提取的多核苷酸样品的变异识别，以在基于第一测定和第二测定对8个提取的多核苷酸样品进行测序时同时确定变异识别，所述8个提取的多核苷酸样品中的第一组4个提取的多核苷酸样品使用具有每样品一个dna池和在100个碱基到120个碱基的范围内的平均扩增子大小的所述第一测定，所述8个提取的多核苷酸样品中的第二组4个提取的多核苷酸样品使用具有每样品一个dna池和在190个碱基到220个碱基的范围内的平均扩增子大小的所述第二测定。
[0459]
在第一方面的一实例中，运行时间在5小时到12小时的范围内。
[0460]
在第一到第五方面的一实例和上述实例中，原始读段准确度为至少99.0％原始读段准确度。例如，所述原始读段准确度为至少99.1％。
[0461]
在第一到第五方面的另一实例和上述实例中，所述性能进一步以至少100个碱基且不大于450个碱基的q20中值读长为特征。例如，所述q20中值读长为至少102个碱基且不大于300个碱基。在另一实例中，所述q20中值读长为至少104个碱基且不大于300个碱基。
[0462]
在第一到第五方面的另外的实例和上述实例中，所述性能进一步以至少97％的均匀性为特征。例如，所述均匀性为至少98％。在另一实例中，所述均匀性为至少98.5％。
[0463]
在第一到第五方面的另外的实例和上述实例中，所述性能进一步以至少97％的平均中靶读段百分比为特征。例如，平均中靶读段百分比为至少98％。在一实例中，平均中靶读段百分比为至少98.1％。
[0464]
在第一到第五方面的另一实例和上述实例中，所述性能进一步以在1300万个碱基到1亿个碱基的范围内的总读段数为特征。例如，总读段数在1300万个碱基到6000万个碱基的范围内。在一实例中，总读段数在1450万个碱基到2500万个碱基的范围内。
[0465]
在第六方面，一种用于测序的方法包含向测序仪器提供4个提取的多核苷酸样品、测序基板和用于具有每样品一个dna池和在100个碱基到120个碱基的范围内的平均扩增子大小的测定的试剂；用所述测序仪器生成源自所述测定的多个多核苷酸；用所述测序仪器以至少98.5％的原始读段准确度对所述多个多核苷酸进行测序；以及用所述测序仪器基于所述测序准备变异识别报告；其中所述生成、所述测序和所述准备是在5小时到14小时的范围内的运行时间内执行的。
[0466]
在第六方面的一实例中，运行时间在5小时到12小时的范围内。
[0467]
在第六方面的另一实例和上述实例中，原始读段准确度为至少99.1％。例如，所述原始读段准确度为至少99.2％。
[0468]
在第六方面的另外的实例和上述实例中，所述性能进一步以至少100个碱基且不大于300个碱基的q20中值读长为特征。例如，所述q20中值读长为至少102个碱基且不大于300个碱基。在一实例中，所述q20中值读长为至少104个碱基且不大于300个碱基。
[0469]
在第六方面的另外的实例和上述实例中，所述性能进一步以至少97％的均匀性为特征。例如，所述均匀性为至少98％。在另一实例中，所述均匀性为至少98.5％。
[0470]
在第六方面的另一实例和上述实例中，所述性能进一步以至少97％的平均中靶读段百分比为特征。例如，平均中靶读段百分比为至少98％。在一实例中，平均中靶读段百分比为至少98.1％。
[0471]
在第六方面的另外的实例和上述实例中，所述性能进一步以在1300万个碱基到1亿个碱基的范围内的总读段数为特征。例如，总读段数在1400万个碱基到6000万个碱基的范围内。在一实例中，总读段数在1450万个碱基到2500万个碱基的范围内。
[0472]
在第七方面，一种用于测序的方法包含向测序仪器提供用于第一类测定的试剂溶液、用于第二类测定的试剂溶液、具有多个泳道的测序基板和至少两个多核苷酸样品；用所述测序仪器生成第一多个多核苷酸，所述第一多个多核苷酸源自至少两个纯化的多核苷酸样品中的至少第一多核苷酸样品和所述第一类测定；用所述测序仪器生成第二多个多核苷酸，所述第二多个多核苷酸源自至少两个纯化的多核苷酸样品中的至少第二多核苷酸样品和所述第二类测定；将所述第一多个多核苷酸装载到所述测序基板的所述多个泳道中的第一泳道中；将所述第二多个多核苷酸装载到所述测序基板的所述多个泳道中的第二泳道中；用所述测序仪器对所述第一多个多核苷酸和所述第二多个多核苷酸进行测序；以及用所述测序仪器在提供后的10小时到24小时的范围内的运行时间内准备变异识别报告，对于所述第一多个多核苷酸和所述第二多个多核苷酸中的至少一个，所述测序的性能以至少98.5％的原始读段准确度为特征。
[0473]
在第八方面，一种测序仪器包括用于同时由第一纯化样品和第一测定类型生成第一多核苷酸群体并且由第二纯化样品和不同于所述第一测定类型的第二测定类型生成第二多核苷酸群体的自动系统以及用于同时对所述第一多核苷酸群体和所述第二多核苷酸群体进行测序的测序设备。
[0474]
在第九方面，一种对多个样品进行测序的方法包含使用测序仪器由测定和第一样品自动生成第一多核苷酸群体；使用所述测序仪器将所述第一多核苷酸群体装载到多泳道测序基板的第一泳道中；使用所述多泳道测序基板和所述测序仪器对所述第一多核苷酸群体进行测序；在对所述第一多核苷酸群体进行测序后使用测序仪器由第二测定和第二样品自动生成第二多核苷酸群体；使用所述测序仪器将所述第二多核苷酸群体装载到所述多泳道测序基板的第二泳道中；以及使用所述多泳道测序基板和所述测序仪器对所述第二多核苷酸群体进行测序。
[0475]
在第十方面，一种系统包含测序仪器，所述测序仪器适于接收一个或多个提取的多核苷酸样品并且生成变异识别报告，其中：接收所述一个或多个提取的多核苷酸样品与使用在所述测序仪器上运行的包含每样品一个多核苷酸池的测定进行测序时生成所述变异识别报告之间的运行时间介于约5小时与14小时之间；除了提供所述一个或多个提取的多核苷酸样品、一组消耗品和运行计划外，所述系统不需要任何人工干预即可生成变异识别报告。
[0476]
在第十一方面，一种用于核酸处理和分析的集成自动系统包含用于由一个或多个含有核酸的样品制备核酸模板的组件；用于将所述核酸模板与一个或多个表面连接的组件；用于在所述一个或多个表面上扩增所述核酸模板的组件；用于通过核苷酸聚合生成与所述核酸模板互补的核酸序列的组件；用于检测在生成与所述核酸模板互补的核酸序列时聚合的核苷酸的组件；以及用于鉴定在生成与所述核酸模板互补的核酸序列时聚合的核苷
酸的组件；其中所述集成自动系统仅需要人类用户进行一个干预步骤。
[0477]
在第十一方面的一实例中，所述集成自动系统进一步包含用于分析所鉴定的核苷酸以确定所述核酸模板的序列的组分。
[0478]
在第十一方面的另一实例和上述实例中，所述集成自动系统进一步包含人类用户，所述人类用户在如所述系统执行的样品核酸处理和分析方面不熟练。
[0479]
在第十一方面的另外的实例和上述实例中，所述集成自动系统进一步包含所述系统，所述系统能够处理和分析核酸以同时由四个或更多个不同样品中的每个样品生成至少约1200万个核酸序列读段。
[0480]
在第十一方面的另外的实例和上述实例中，所述集成自动系统进一步包含所述系统，所述系统能够处理和分析核酸以同时由96个或更多个不同样品中的每个样品生成至少约100万个核酸序列读段。
[0481]
在第十一方面的另一实例和上述实例中，所述集成自动系统进一步包含所述能够处理和分析核酸以同时由48个或更多个不同样品中的每个样品生成至少约50万个核酸序列读段的系统。
[0482]
在第十一方面的另外的实例和上述实例中，大部分核酸序列读段各自包括至少约350个核苷酸。
[0483]
在第十一方面的另外的实例和上述实例中，用于制备所述核酸模板的所述组件包括用于使用两个或更多个不同的扩增引物对在单个扩增反应混合物中扩增所述一个或多个样品中的至少一个样品的核酸的系统。例如，用于制备所述核酸模板的所述组件包括用于使用50个或更多个不同的扩增引物对在单个扩增反应混合物中扩增所述一个或多个样品中的至少一个样品的核酸的系统。
[0484]
在第十一方面的另一实例和上述实例中，用于制备核酸模板的组件能够由rna或dna制备模板。
[0485]
在第十一方面的另外的实例和上述实例中，用于制备所述核酸模板的所述组件包括用于使用两个或更多个不同的扩增引物对在单个扩增反应混合物中扩增所述一个或多个样品中的至少一个样品的核酸的系统。例如，所述系统能够在约5到14小时内处理来自四个或更多个样品的核酸以生成至少1200万个核酸序列读段。
[0486]
在第十二方面，一种用于处理用于核酸分析的样品的自动方法包含提供包括核酸的样品；将所述样品输入到上述方面的系统中；以及使所述系统处理所述样品。例如，当使用具有每样品一个dna池和在100个碱基到120个碱基的范围内的平均扩增子大小的测定时，所述系统在5到14小时的运行时间内提供变异识别报告。
[0487]
在第十三方面，一种用于自动核酸分析的集成样品处理装置包含用户输入模块；核酸文库制备单元；核酸模板化单元；核苷酸聚合信号检测单元；核苷酸聚合信号数据处理单元；核苷酸聚合数据分析单元；以及控制单元，其中所述装置被配置用于在用于核酸分析的样品处理方面不熟练的用户仅进行一个干预步骤即可完成的自动样品处理。
[0488]
在第十三方面的一实例中，当对四个样品使用具有每样品一个dna池和在100个碱基到120个碱基的范围内的平均扩增子大小的测定时，所述装置能够在5小时到14小时的运行时间内提供变异识别报告。
[0489]
在第十三方面的另一实例和上述实例中，用户指令输入单元包括触摸屏用户接
口。
[0490]
在第十三方面的另外的实例和上述实例中，所述核酸文库制备单元包括安置在仪器台板上的孔板。
[0491]
在第十三方面的另外的实例和上述实例中，所述核酸文库制备单元包括移液机器人。
[0492]
在第十三方面的另一实例和上述实例中，所述核酸模板化单元包括磁性装载设备。
[0493]
在第十三方面的另外的实例和上述实例中，所述信号检测单元包括用于与传感器装置交互的电子接口。
[0494]
在第十三方面的另外的实例和上述实例中，所述信号数据处理单元和所述分析单元在计算装置中实施。
[0495]
应注意，以上在一般描述或实例中描述的所有活动并非都是必需的，可能不需要一部分特定活动，且除所描述的那些以外可以执行一个或多个其它活动。仍进一步，所列的活动次序未必是执行活动的次序。
[0496]
在前述说明书中，已经参照具体实施例对概念进行了描述。然而，所属领域普通技术人员应理解，可以在不脱离以下权利要求书中阐述的本发明的范围的情况下作出各种修改和改变。因此，说明书和图式应该以说明性而不是限制性意义来看待，且所有这些修改意图包含在本发明范围内。
[0497]
如本文所用，术语“包括(comprises/comprising)”、“包含(includes/including)”、“具有(has/having)”或其任何其它变化形式打算涵盖非排它性的包含。例如，包括一系列特征的过程、方法、物品、或设备并不需要仅限于那些特征，而是可以包含未明确列出的或对这个过程、方法、物品、或设备为固有的其它特征。此外，除非明确相反地陈述，否则“或”是指包括性的或而非排他性的或。例如，下列任一项均满足条件a或b：a是真(或存在)和b是假(或不存在)，a是假(或不存在)和b是真(或存在)，以及a和b都是真(或存在)。
[0498]
同样，“一个”或“一种”用于描述本文描述的元素和部件。这样做仅是为了方便并且对本发明的范围给出一般含义。此描述应理解为包含一个或至少一个，并且除非明显地另有所指，否则单数也包含复数。
[0499]
上面已经关于具体实施例描述了益处、其它优点和问题的解决方案。然而，益处、优点、问题的解决方案以及会产生任何益处、优点、或解决方案或使其更明显的任何一个或多个特征不会被解释为任何或所有权利要求的关键的、必要的或基本的特征。
[0500]
在阅读本说明书之后，所属领域技术人员将理解为了清楚的目的某些特征在此被描述在单独的实施例的上下文中，还能够以结合在单个实施例中的形式来提供。相反，为了简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的各种特征也可以单独地或以任何子组合提供。此外，指定在范围内的参考值包含该范围内的每个值。