本申请为申请日为2017年10月13日、申请号为201710953111.8、发明名称为“一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用”的发明专利申请的分案申请。本发明属于基因工程领域，具体涉及一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
：l-高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白氨基酸，作为生物合成苏氨酸、蛋氨酸和赖氨酸共有的中间体而少量存在于很多物种中。由于l-高丝氨酸具有l-型-α氨基酸的基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，因此，l-高丝氨酸及其衍生物作为医药中间体在药物学、生理学等方面有重要应用前景。目前，国内外生产l-高丝氨酸主要有以下几种方法：(1)化学法；该方法采用相对昂贵的l-蛋氨酸为原料，并使用具有严重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作为甲基化试剂，经亲核进攻以保护氨基，再在弱碱性条件下水解得到产物。该方法不仅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，对环境不友好；(2)化学手性拆分方法；该方法是利用混旋的高丝氨酸与手性试剂反应后，会形成非对应异构体的性质差异，由此分离出l-高丝氨酸。该方法产率低，试剂成本高且需使用大量有机溶剂，对环境有较大污染威胁。(3)生物酶催化法；该方法利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和l-氨基酸脱氢酶的共同作用下生成氨基酸高丝氨酸。该方法主要问题是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用价格昂贵的辅酶等。(4)微生物发酵法；该方法具有成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点，近年来已经成为生产各类氨基酸的首选工艺。但是，目前的l-高丝氨酸发酵依赖于以质粒为载体的基因过表达体系，其劣势是菌种传代稳定性差。技术实现要素：本发明要解决的第一个技术问题是提供一种稳定的l-高丝氨酸的生产菌株。本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建l-高丝氨酸生产菌株的基因工程方法。因此，本发明提供一种l-高丝氨酸的生产菌株，其特征在于：其具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离dna载体，其染色体dna上一个或多个与l-苏氨酸合成相关的基因被敲除或弱化，和/或被突变以增强，和/或其染色体dna上整合拷贝一个或多个与l-高丝氨酸代谢途径相关的基因。优选地，所述被敲除或弱化的基因为thrb和/或thrl；所述被突变以增强的基因为thra和/或rhta，所述整合拷贝的基因为thra*、ppc、pnta、pntb、asd、aspa和aspc中的一个或多个。优选地，所述l-高丝氨酸生产菌株属于大肠杆菌种属。进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌k-12野生型mg1655。本发明还提供所述的l-高丝氨酸生产菌株的构建方法，包括以下步骤中一步或多步：a、构建菌株中一个或多个与l-高丝氨酸代谢途径相关的基因被敲除或弱化；b、构建菌株中一个或多个与l-高丝氨酸代谢途径相关的基因通过点突变过表达或增强功能；c、构建菌株中一个或多个与l-高丝氨酸代谢途径相关的基因以多拷贝的形式整合到染色体dna上过表达。优选地，所述步骤a中所述的被敲除或弱化的基因为thrb和/或thrl；所述步骤b中所述的被突变的基因为thra和/或rhta；所述步骤b中，thra和/或rhta基因分别被突变为thra*和/或rtha23基因。且所述突变thra*具有抑制产物的反馈抑制的特性，突变rhta23具有增加表达量的效果；所述步骤c中所述的通过提高染色体拷贝数来过表达的基因为thra*、ppc、pnta、pntb、apsa，aspc和asd中的一个或多个。优选地，上述步骤中所述的构建菌株属于大肠杆菌种属。进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌k-12野生型mg1655。本发明还提供所述的l-高丝氨酸生产菌株在生产l-高丝氨酸中的应用。本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：(1)本发明通过对l-高丝氨酸代谢途径相关的特定基因的多拷贝整合表达，可实现稳定高产的目的。相对之前报道的通过质粒载体过表达的方式，本发明的菌株传代稳定性好，发酵结果稳定，并且产量较之前高。(2)本发明所构建的l-高丝氨酸生产菌株在发酵过程中，相对带质粒形式的菌种副产物少，糖酸转化率高。(3)本发明的l-高丝氨酸的生产菌株，发酵全程无需使用抗生素，避免了抗生素对环境的污染以及潜在的抗性基因流入环境的可能。具体实施方式实施例中均采用大肠杆菌mg1655构建l-高丝氨酸生产菌株，对所述大肠杆菌基因组中的基因进行敲除和编辑主要是基于lambda-red重组、flp-frt重组和crispr/cas9技术。可参照文献“lambdaredrecombinationone-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.”procnatlacadsciusa.2000jun6；97(12):6640-5.和“developmentofafastandeasymethodforescherichiacoligenomeeditingwithcrispr/cas9.”microbcellfact.2016dec1；15(1):205.。实施例中采用的所述温敏质粒具有文献cellfact.2016dec1；15(1):205.中的温敏质粒所示的dna序列结构；所述原始菌株大肠杆菌mg1655购买自atcc；需要说明的是，上述各材料均为市售，对于实现本发明的目的来说，不同厂家、不同规格的产品并不影响本发明的实施。实施例中，所述阿拉伯糖诱导条件具体为：在含20mm阿拉伯糖的lb培养基中，30℃诱导培养。实施例1敲除thrb基因、过表达rhta基因、敲除thrl基因、突变thra基因增强菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r))的构建。本实施例构建的l-高丝氨酸生产菌株为敲除thrb基因、过表达rhta基因、敲除thrl基因、突变thra基因的菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r))的构建，其构建方法可见中国专利申请cn201710106474.8。实施例2在染色体dna上单拷贝表达thra*、ppc、aspa、pnta和pntb的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab)的构建。本实施例构建的l-高丝氨酸生产菌株为染色体dna上同时整合表达thra*、ppc、aspa、pnta和pntb的基因工程菌mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab)，其构建方法可参考文献:microbcellfact.2016dec1；15(1):205，具体包括如下步骤：(1)以实施例1中所得菌种染色体dna为模板，以psoe-thra-f、psoe-ppc-thra-r；psoe-thra-ppc-f、psoe-aspa-ppc-r；psoe-ppc-aspa-f、psoe-pnta-aspa-r；psoe-aspa-pnta-f、pntb-r为引物，通过重叠延伸pcr法(即soe-pcr法)进行扩增，将模板菌中位于对应天然启动子下的thra*、ppc、aspa、pntab等基因连接起来，得到整合插入的基因dna片段；其中，所述引物psoe-thra-f具有如seqidno.1所示的序列，所述引物psoe-ppc-thra-rseqidno.2所示的序列，所述引物psoe-thra-ppc-f具有如seqidno.3所示的序列，所述引物psoe-aspa-ppc-r具有如seqidno.4所示的序列，所述引物psoe-ppc-aspa-f具有如seqidno.5所示的序列，所述引物psoe-pnta-aspa-r具有如seqidno.6所示的序列，所述引物psoe-aspa-pnta-f具有如seqidno.7所示的序列，所述引物pntb-r具有如seqidno.8所示的序列，具体如下：seqidno.1:5’-gctcatattggcactggaag-3’；seqidno.2:5’-cttatggaaatgttaaaaaatcgccaagctttacgcgaacgag-3’；seqidno.3:5’-ctcgttcgcgtaaagcttggcgattttttaacatttccataag-3’；seqidno.4:5’-cattttcctttatgtctatattgagatttcccttaaggatatctgaaggtatattcag-3’；seqidno.5:5’-ctgaatataccttcagatatccttaagggaaatctcaatatagacataaaggaaaatg-3’；seqidno.6:5’-gtactgaaaattatgcctgtgatctgtgccttttttatttgtactaccct-3’；seqidno.7:5’-agggtagtacaaataaaaaaggcacagatcacaggcataattttcagtac-3’；seqidno.8:5’-tctcaataaagagtgacggc-3’。(2)以mg1655基因组dna为模板，使用psoe-cada-h1-f、psoe-cada-h1-r；psoe-cada-h2-f、psoe-cada-h2-r为引物，分别获得cada的上下游整合同源臂，再通过重叠延伸pcr法(即soe-pcr法)与步骤(1)中得到的所述片段dna进行扩增，构成整合供体dna。结合pcada-n20-f、pcada-n20-r克隆到温敏质粒中，所述温敏质粒含有通过诱导表达gam、bet以及exo3种lambda噬菌体重组酶、cas9dna内切酶；所述引物psoe-cada-h1-f具有如seqidno.9所示的序列，所述引物psoe-cada-h1-r具有如seqidno.10所示的序列，所述引物psoe-cada-h2-f具有如seqidno.11所示的序列，所述引物psoe-cada-h2-r具有如seqidno.12所示的序列，所述引物pcada-n20-f具有如seqidno.13所示的序列，所述引物pcada-n20-r具有如seqidno.14所示的序列，具体如下：seqidno.9:5’-gtgcagcgccagagccac-3’；seqidno.10:5’-gccgtcactctttattgagagctttagtcagcggaggc-3’；seqidno.11:5’-cttccagtgccaatatgagcactgtttaaatatgttcgtgaagg-3’；seqidno.12:5’-gagctggatggatttcacatccagtg-3’；seqidno.13:5’-agcggcctccgctgactaaagcat-3’；seqidno.14:5’-aaacatgctttagtcagcggaggc-3’；所述整合插入的基因dna片段具有如seqidno.15所示的序列，具体如下：seqidno.15：5’-gctcatattggcactggaagccggggcataaactttaaccatgtcagactcctaacttccatgagagggtacgtagcagatcagcaaagacaccggcagctgtaacgtcattgcccgcaccatatccgcgcagtaccaacggcagcggctgataatagtggctatagaaggccagggcgttttcgccatttttcactttgaacagcggatcattaccatccacttcggcaatcttcacgcggcagacgccatcttcatcaatattgccaacatagcgcaaaacttttccttcatcacgggccttcgccacgcgcgcggcaaagagatcgtcgagttgtgacagattcgccataaaagcggcaacatcaccctcggcgttaaactctgcgggcagcacaggttcaatttcaatatccgccagctccagttcacgtcccgtttcacgagcgagaatcaatagtttacgcgccacatccataccagaaagatcatctcgcgggtccggttcggta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ttgcctggacatatgaacgtattgctggctgaagcaaaagtaccgtatgacatcgtgctggaaatggacgagatcaatgatgactttgctgataccgataccgtactggtgattggtgctaacgatacggttaacccggcggcgcaggatgatccgaagagtccgattgctggtatgcctgtgctggaagtgtggaaagcgcagaacgtgattgtctttaaacgttcgatgaacactggctatgctggtgtgcaaaacccgctgttcttcaaggaaaacacccacatgctgtttggtgacgccaaagccagcgtggatgcaatcctgaaagctctgtaaccctgacggcctctgctgaggccgtcactctttattgaga-3’；(3)筛选步骤(2)中得到的所述温敏质粒，并将正确的质粒转入实施例1中得到的所述菌株的感受态细胞中，然后，在30℃下进行培养，将成功转入质粒的菌株置于阿拉伯糖诱导条件下继续培养，使其表达lambda噬菌体重组酶、grna和cas9dna内切酶，再筛选目标突变体菌落；(4)将步骤(3)中筛选确认的所述突变体菌落在42℃下培养消除crispr/cas9质粒，同时消除质粒所导致的卡纳霉素抗性，即得到所述菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab)。实施例3在染色体dna上二拷贝整合表达thra*、ppc、aspa、pnta和pntb的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab)的构建。本实施例构建的l-高丝氨酸生产菌株为在染色体dna上同时二次整合表达thra*、ppc、aspa、pnta和pntb的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab)的构建，采用crispr/cas9基因编辑技术实现菌株的构建，对yidj基因的下游插入实施例2中所述seqidno.15片段，其构建方法与实施例2的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例2产物菌株为操作对象，整合位置为yidj基因下游。具体为：将实施例2中所述步骤(2)中采用的引物由所述psoe-cada-h1-f、psoe-cada-h1-r、psoe-cada-h2-f、psoe-cada-h2-r、pcada-n20-f、pcada-n20-r,替换为psoe-yidj-h1-f、psoe-yidj-h1-r、psoe-yidj-h2-f、psoe-yidj-h2-r、pyidj-n20-f、pyidj-n20-r；其中，所述引物psoe-yidj-h1-f具有如seqidno.16所示的序列，所述引物psoe-yidj-h1-r具有如seqidno.17所示的序列，所述引物psoe-yidj-h2-f具有如seqidno.18所示的序列，所述引物psoe-yidj-h2-r具有如seqidno.19所示的序列，所述引物pyidj-n20-f具有如seqidno.20所示的序列，所述引物pyidj-n20-r具有如seqidno.21所示的序列，具体如下：seqidno.16:5’-gtgcgaaattttcattgttgctcctttgc-3’；seqidno.17：5’-cttccagtgccaatatgagccggcctaccgacacaag-3’；seqidno.18：5’-ggccgtcactctttattgagagtgtcatagtcgcgtacaac-3’；seqidno.19：5’-gagccggcgatgtatgacgacatc-3’；seqidno.20：5’-agcggttgtacgcgactatgacac-3’；seqidno.21：5’-aaacgtgtcatagtcgcgtacaac-3’。实施例4在染色体dna上三拷贝表达thra*、ppc、aspa、pnta和pntb的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab，δatpc::thra*-ppc-aspa-pntab)的构建。本实施例构建的l-高丝氨酸生产菌株为在染色体dna上同时三次整合表达thra*、ppc、aspa、pnta和pntb的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab，δatpc::thra*-ppc-aspa-pntab)的构建，采用crispr/cas9基因编辑技术实现菌株的构建，对atpc基因的下游插入实施例2中所述seqidno.15片段，其构建方法与实施例2的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例3产物菌株为操作对象，整合位置为atpc基因下游。具体的：将实施例2中所述步骤(2)中采用的引物由所述psoe-cada-h1-f、psoe-cada-h1-r、psoe-cada-h2-f、psoe-cada-h2-r、pcada-n20-f、pcada-n20-r,替换为psoe-atpc-h1-f、psoe-atpc-h1-r、psoe-atpc-h2-f、psoe-atpc-h2-r、patpc-n20-f、patpc-n20-r；其中，所述引物psoe-atpc-h1-f具有如seqidno.22所示的序列，所述引物psoe-atpc-h1-r具有如seqidno.23所示的序列，所述引物psoe-atpc-h2-f具有如seqidno.24所示的序列，所述引物psoe-atpc-h2-r具有如seqidno.25所示的序列，所述引物patpc-n20-f具有如seqidno.26所示的序列，所述引物patpc-n20-r具有如seqidno.27所示的序列，具体如下：seqidno.22:5’-gtgcgaaattttcattgttgctcctttgc-3’；seqidno.23：5’-cttccagtgccaatatgagcgaaagcgccattttcgacc-3’；seqidno.24：5’-gccgtcactctttattgagagtcagcggggataatccgt-3’；seqidno.25：5’-gagccataaccggtcggatcatcc-3’；seqidno.26：5’-agcggttgtacgcgactatgacac-3’；seqidno.27：5’-aaacgtgtcatagtcgcgtacaac-3’。实施例5在染色体dna继续整合thra*的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab，δatpc::thra*-ppc-aspa-pntab，δdaca：：thra*)的构建。本实施例构建的l-继续整合thra*的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab，δatpc::thra*-ppc-aspa-pntab，δdaca：：thra*)，采用crispr/cas9基因编辑技术实现菌株的构建，在daca基因内部插入thra*表达盒，其构建方法与实施例2的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例4产物菌株为操作对象，整合位置为反向插入daca基因内部。具体的：插入片段是使用引物psoe-thra-f和psoe-thra-r从mg1655基因组通过pcr扩增获得，且将实施例2中所述步骤(2)中采用的引物由所述psoe-cada-h1-f、psoe-cada-h1-r、psoe-cada-h2-f、psoe-cada-h2-r、pcada-n20-f、pcada-n20-r,替换为psoe-daca-h1-f、psoe-daca-h1-r、psoe-daca-h2-f、psoe-daca-h2-r、pdaca-n20-f、pdaca-n20-r；其中，所述引物psoe-thra-f具有如seqidno.1所示的序列，所述引物psoe-thra-r具有如seqidno.28所示的序列，所述引物psoe-daca-h1-f具有如seqidno.29所示的序列，所述引物psoe-daca-h1-r具有如seqidno.30所示的序列，所述引物psoe-daca-h2-f具有如seqidno.31所示的序列，所述引物psoe-daca-h2-r具有如seqidno.32所示的序列，所述引物pdaca-n20-f具有如seqidno.33所示的序列，所述引物pdaca-n20-r具有如seqidno.34所示的序列，具体如下：seqidno.28:5’-aagctttacgcgaacgagc-3’；seqidno.29:5’-gtgcgaaattttcattgttgctcctttgc-3’；seqidno.30：5’-gctcgttcgcgtaaagcttgtacgtcacggatcaatgc-3’；seqidno.31：5’-cttccagtgccaatatgagccgaatgaatactcgatctataaagaaaaag-3’；seqidno.32：5’-gagcaaccaaaccagtgatggaac-3’；seqidno.33：5’-agcgagtattcattcggtacgtca-3’；seqidno.34：5’-aaactgacgtaccgaatgaatact-3’。实施例6在染色体dna继续整合thra*的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab，δatpc::thra*-ppc-aspa-pntab，δdaca::thra*，δbcsb::thra*)的构建。本实施例采用crispr/cas9基因编辑技术实现菌株的构建，在bcsb基因内部插入thra*表达盒，其构建方法与实施例5的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例5产物菌株为操作对象，整合位置为反向插入bcsb基因内部。具体的：插入片段同例5，且将实施例5中所述步骤(2)中采用的引物由所述psoe-daca-h1-f、psoe-daca-h1-r、psoe-daca-h2-f、psoe-daca-h2-r、pdaca-n20-f、pdaca-n20-r替换为psoe-bcsb-h1-f、psoe-bcsb-h1-r、psoe-bcsb-h2-f、psoe-bcsb-h2-r、pbcsb-n20-f、pbcsb-n20-r；其中，所述引物psoe-bcsb-h1-f具有如seqidno.35所示的序列，所述引物psoe-bcsb-h1-r具有如seqidno.36所示的序列，所述引物psoe-bcsb-h2-f具有如seqidno.37所示的序列，所述引物psoe-bcsb-h2-r具有如seqidno.38所示的序列，所述引物pbcsb-n20-f具有如seqidno.39所示的序列，所述引物pbcsb-n20-r具有如seqidno.40所示的序列，具体如下：seqidno.35:5’-gtgctcgttactgcctgtccagtc-3’；seqidno.36:5’-gctcgttcgcgtaaagcttcagtttgacgtaaggattctgc-3’；seqidno.37：5’-cttccagtgccaatatgagcctggtggtgtttggtcgtgacg-3’；seqidno.38：5’-gagcgctggaaggtaatacagttatccac-3’；seqidno.39：5’-agcggaatccttacgtcaaactgc-3’；seqidno.40：5’-aaacgcagtttgacgtaaggattc-3’；实施例7在染色体dna整合aspc的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab，δatpc::thra*-ppc-aspa-pntab，δdaca::thra*，δbcsb::thra*，δmenh::aspc)的构建。本实施例构建在染色体dna整合aspc的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab，δatpc::thra*-ppc-aspa-pntab，δdaca：：thra*，δmenh::aspc)。采用crispr/cas9基因编辑技术实现在menh基因内部插入aspc表达盒。其构建方法与实施例5的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例6产生的菌株为操作对象，将天然启动子下的aspc基因反向插入到menh基因内部。具体的：插入片段由引物psoe-aspc-f和psoe-aspc-r从mg1655基因组通过pcr扩增获得，且将实施例步骤(2)中采用的引物由所述psoe-daca-h1-f、psoe-daca-h1-r、psoe-daca-h2-f、psoe-daca-h2-r、pdaca-n20-f、pdaca-n20-r替换为psoe-menh-h1-f、psoe-menh-h1-r、psoe-menh-h2-f、psoe-menh-h2-r、pmenh-n20-f、pmenh-n20-r；其中，所述引物psoe-aspc-f具有如seqidno.41所示的序列，所述引物psoe-aspc-r具有如seqidno.42所示的序列，所述引物psoe-menh-h1-f具有如seqidno.43所示的序列，所述引物psoe-menh-h1-r具有如seqidno.44所示的序列，所述引物psoe-menh-h2-f具有如seqidno.45所示的序列，所述引物psoe-menh-h2-r具有如seqidno.46所示的序列，所述引物pmenh-n20-f具有如seqidno.47所示的序列，所述引物pmenh-n20-r具有如seqidno.48所示的序列，具体如下：seqidno.41:5’-ctgaccgtaccaacctgca-3’；seqidno.42:5’-cctgataagcgtagcgcat-3’；seqidno.43:5’-gtgcgtttgccgactactcacg-3’；seqidno.44：5’-tgcaggttggtacggtcaggcgctaaggttagcacgtaaat-3’；seqidno.45：5’-atgcgctacgcttatcaggccgcacatttgcgttttattat-3’；seqidno.46：5’-gagcacattcaggtgatgtacgcc-3’；seqidno.47：5’-agcgacgcaaatgtgcgggcgcta-3’；seqidno.48：5’-aaactagcgcccgcacatttgcgt-3’。实施例8在染色体dna整合aspc的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab，δatpc::thra*-ppc-aspa-pntab，δdaca::thra*，δbcsb::thra*，δmenh::aspc，δyddb::asd)的构建。本实施例构建在染色体dna整合asd的基因工程菌株mg1655(δthrb,rhta23,δthrl,thra*(g433r)，δcada::thra*-ppc-aspa-pntab，δyidj::thra*-ppc-aspa-pntab，δatpc::thra*-ppc-aspa-pntab，δdaca::thra*，δbcsb::thra*，δmenh::aspc，δyddb::asd)。采用crispr/cas9基因编辑技术实现在yddb基因内部插入asd表达盒。其构建方法与实施例5的方法基本类似，区别仅在于：以原始菌实施例7产生的菌株为操作对象，将天然启动子下的asd基因插入到yddb基因内部。具体的：插入片段由引物psoe-asd-f和psoe-asd-r从mg1655基因组通过pcr扩增获得，且将实施例步骤(2)中采用的引物由所述psoe-menh-h1-f、psoe-menh-h1-r、psoe-menh-h2-f、psoe-menh-h2-r、pmenh-n20-f、pmenh-n20-r替换为psoe-yddb-h1-f、psoe-yddb-h1-r、psoe-yddb-h2-f、psoe-yddb-h2-r、pyddb-n20-f、pyddb-n20-r；其中，所述引物psoe-asd-f具有如seqidno.49所示的序列，所述引物psoe-asd-r具有如seqidno.50所示的序列，所述引物psoe-yddb-h1-f具有如seqidno.51所示的序列，所述引物psoe-yddb-h1-r具有如seqidno.52所示的序列，所述引物psoe-yddb-h2-f具有如seqidno.53所示的序列，所述引物psoe-yddb-h2-r具有如seqidno.54所示的序列，所述引物pyddb-n20-f具有如seqidno.55所示的序列，所述引物pyddb-n20-r具有如seqidno.56所示的序列，具体如下：seqidno.49:5’-ggatccataatcaggatcaataaaact-3’；seqidno.50:5’-aggatccgcaaaatggcc-3’；seqidno.51:5’-gtgcggctcttcaggaagtacttattac-3’；seqidno.52：5’-gttttattgatcctgattatggatcccagtccacgcatcggaatag-3’；seqidno.53：5’-ggccattttgcggatcctaacgccataaccagtctgaat-3’；seqidno.54：5’-gagcctgaacgaatgcgttttgg-3’；seqidno.55：5’-agcgatggcgttcagtccacgcat-3’；seqidno.56：5’-aaacatgcgtggactgaacgccat-3’。实施例9l-高丝氨酸生产菌株发酵生产l-高丝氨酸本实施例采用实施例1中制备得到的菌株进行l-高丝氨酸的发酵生产，其生产方法具体可参见中国专利申请cn201710106474.8，发酵获得高丝氨酸5.3g/l。作为本实施例可替换的实施方式，所述实施例1最终制备得到的菌株还可替换为实施例2-8中最终制备得到的菌株。实施例10l-高丝氨酸生产菌株发酵的结果统计本实施例优选采用实施例1和实施例4、实施例8构建菌株进行l-高丝氨酸的发酵生产，与mg1655菌对比。其生产方法与实施例10中所述的生产方法完全一致。按照采用实施例4中制备得到的菌株进行发酵的实验编号为hom4、采用实施例8中制备得到的菌株进行发酵的实验编号为hom8，分别对l-高丝氨酸的产量进行检测和计算，其结果如下：菌种l-高丝氨酸产量(g/l)mg16550hom14.8±1.2hom453.8±5.9hom888.1±11.4由上述结果可知，采用本发明的菌株发酵生产l-高丝氨酸的产量最高达近100g/l，表明本发明对各基因的敲除、弱化、增强、过表达、突变起到了明显的效果。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。sequencelisting<110>四川利尔生物科技有限公司<120>一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用<130>tc5382<160>56<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>1gctcatattggcactggaag20<210>2<211>43<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>2cttatggaaatgttaaaaaatcgccaagctttacgcgaacgag43<210>3<211>43<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>3ctcgttcgcgtaaagcttggcgattttttaacatttccataag43<210>4<211>58<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>4cattttcctttatgtctatattgagatttcccttaaggatatctgaaggtatattcag58<210>5<211>58<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>5ctgaatataccttcagatatccttaagggaaatctcaatatagacataaaggaaaatg58<210>6<211>50<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>6gtactgaaaattatgcctgtgatctgtgccttttttatttgtactaccct50<210>7<211>50<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>7agggtagtacaaataaaaaaggcacagatcacaggcataattttcagtac50<210>8<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>8tctcaataaagagtgacggc20<210>9<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>9gtgcagcgccagagccac18<210>10<211>38<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>10gccgtcactctttattgagagctttagtcagcggaggc38<210>11<211>44<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>11cttccagtgccaatatgagcactgtttaaatatgttcgtgaagg44<210>12<211>26<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工合成<400>12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