过表达虫草素的重组蛹虫草

本发明属于蛹虫草栽培领域，主要涉及一种过表达虫草素的重组蛹虫草。
背景技术：
：蛹虫草(cordycepsmilitaris)又名北冬虫夏草，为子囊菌门，肉座目，麦角菌科、虫草属真菌，由子座(子实体)和菌核组成的复合体。蛹虫草富含多种活性化合物，其中包括1)核苷类，如虫草素、腺苷、腺嘌呤和次黄嘌呤等；2)虫草多糖；3)虫草甾醇和糖醇类物质，如虫草酸(又名d-甘露醇)、麦角甾醇和胆固醇等；4)酶类，如超氧化物歧化酶(sod)纤维蛋白溶解酶和溶栓酶等等，现广泛应用于医药行业。虫草素(cordycepin)是蛹虫草的主要活性成分之一，最早从蛹虫草中提取，随后在冬虫夏草(cordycepssinensis)和九州虫草(cordycepskyushuensis)也被发现有该种化合物。虫草素具有抗肿瘤，对大多数癌细胞均具有明显的抑制作用甚至促使其凋亡。因此，虫草素可用于抗肿瘤药物的开发，且虫草素安全性能高。虫草素作为核苷酸类物质，对细菌、真菌、病毒等微生物的代谢有多重作用。有研究表明虫草素对真菌、细菌有抑制作用，对病毒有杀伤抑制作用。虫草素还有免疫调节作用，抑制炎症反应，抗氧化作用，抑制人血小板聚集等作用。鉴于虫草素重要的食药用价值和巨大的应用前景，其已成为近年来的研究热点。腺苷琥珀酸合酶(adenylosuccinatesynthase)、腺苷琥珀酸裂合酶(adenylosuccinatelyase)、5’-核苷酸酶(5’-nucleotidase)是虫草素生物合成途径中的相关酶，这些酶的基因在蛹虫草的全基因组序列中均已得到验证。克隆编码相关酶的基因并进行过量表达是提高虫草素含量的主要策略之一。技术实现要素：本发明的目的是提供一种过表达虫草素的重组蛹虫草，该方法通过转基因技术获得蛹虫草的突变菌株，该突变菌株与野生型菌株相比，其发酵液中胞外虫草素的产量为1.63倍，而胞内虫草素含量为2.61倍，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下基础。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供一种过表达虫草素的重组蛹虫草，所述过表达虫草素的重组蛹虫草是将目的基因导入蛹虫草细胞中构建而成；所述目的基因为腺苷琥珀酸合酶基因、腺苷琥珀酸裂合酶基因或5’-核苷酸酶基因。具体地，所述过表达虫草素的重组蛹虫草按以下方法构建：(1)将目的基因与线性化双元载体pcambia0380连接，得到重组载体；用所述重组载体转化根癌农杆菌，通过含25μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基培养并筛选，获得含重组载体的根癌农杆菌菌株；(2)将步骤(1)得到的所述含重组载体的根癌农杆菌菌株含200μmol/l乙酰丁香酮的im培养基诱导培养后，与野生型蛹虫草孢子(cordycepsmilitaris)共培养，用含200μg/ml潮霉素、50μg/ml卡那霉素和100μg/ml头孢菌素的im培养基筛选，再在含200μg/ml潮霉素的pda培养基上连续传代五次,得到所述的过表达虫草素的重组蛹虫草。传代前的阳性菌株的虫草素表达量也有所提高，但传代后筛选出的所述的过表达虫草素的重组蛹虫草的过表达还可以稳定遗传。进一步，步骤(1)中所述腺苷琥珀酸合酶基因的基因符号为ccm_06768,核苷酸序列如seqidno.1所示；所述腺苷琥珀酸裂合酶基因的基因符号为ccm_05789，核苷酸序列如seqidno.2所示；所述5’-核苷酸酶基因的基因符号为ccm_02831，核苷酸序列如seqidno.3所示。上述基因均来源于蛹虫草，已在genebank注册。步骤(1)中所述lb固体培养基各组分终浓度为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，琼脂粉15-20g/l。优选地，所述目的基因利用pcr扩增从蛹虫草菌丝中得到，所述蛹虫草菌丝为cordycepsmilitariscgmcc3.14242；所述目的基因为腺苷琥珀酸合酶基因时，所述pcr扩增中使用的引物对是ccm_06768-fgcagacatcacaatgagtattacagtcattctcggctcccccm_06768-rtttcgccacggagctttaccggtaaatcatgtcgtcgcgt所述目的基因为腺苷琥珀酸裂合酶基因时，所述pcr扩增中使用的引物对是ccm_05789-fgcagacatcacaatggcaactgacggaaaaaatgctgggaccm_05789-rtttcgccacggagctttagacattcagctccgtcgttgct所述目的基因为5’-核苷酸酶基因时，所述pcr扩增中使用的引物对是ccm_02831-fgcagacatcacaatgaagactgctgctactctcctcgcccm_02831-rtttcgccacggagctctaaatcgccaaagccatgacaaca。优选地，所述蛹虫草菌丝是在发酵培养基中培养得到，所述发酵培养基各组分终浓度为：葡萄糖20-25g/l，蛋白胨10-20g/l，kh2po40-1g/l，k2hpo40-1g/l，mgso4·7h2o0-1g/l，l-甘氨酸1g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。优选地，步骤(2)中所述im培养基各组分终浓度为：kh2po41.45g/l,k2hpo42.05g/l,mgso4·7h2o0.6g/l,nacl0.1g/l,cacl20.01g/l,feso40.001g/l,nh4no30.5g/l,甘油5ml/l,1mol/l,ph5.5的mes缓冲液40ml/l,微量元素储备液5ml/l,葡萄糖2g/l，溶剂为蒸馏水；所述微量元素储备液中各组分终浓度为100mg/lznso4·7h2o,100mg/lcuso4·h2o,100mg/lh3bo3,100mg/lna2moo4·7h2o，溶剂为蒸馏水，ph自然。优选地，步骤(2)中所述的pda培养基各组分终浓度为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉15-20g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。进一步，所述线性化双元载体pcambia0380是以pcambia0380为模板，经以下引物pcr扩增得到(5'to3')：vector-f：agctccgtggcgaaagcctgacgca；vector-r：cattgtgatgtctgctcaagcggggt。本发明特别推荐，所述过表达虫草素的重组蛹虫草为cordycepsmilitariscctccaf2021007～2021030中的一种(优选cctccaf2021010、cctccaf2021015、cctccaf2021016、cctccaf2021025、cctccaf2021029中的一种，特别优选cctccaf2021025)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2021年01月04日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。与现有技术相比,本发明的有益效果主要体现在：通过基因工程手段构建了能够稳定遗传并过表达的蛹虫草的突变菌株，该突变菌株与野生型菌株相比，其发酵液中的胞外虫草素产量为1.63倍，胞内虫草素含量为2.61倍，为进一步筛选蛹虫草的优良品种打下基础。附图说明图1为本发明目的基因ccm_06768、ccm_05789和ccm_02831的pcr扩增结果；其中，m：5000dnamarker；1-5：目的基因ccm_06768；6-10：目的基因ccm_05789；11-15：目的基因ccm_02831。图2为本发明载体pcambia0380的pcr扩增结果；其中，m：1kbdnamarker；1-4：载体pcambia0380的pcr扩增产物。图3为本发明转化大肠杆菌dh5α的菌落pcr阳性鉴定结果。其中，m：5000dnamarker；1-14：trans-ccm_06768；15-28：trans-ccm_05789；29-42：trans-ccm_02831。图4为本发明转化农杆菌的菌落pcr阳性鉴定结果。其中，m：5000dnamarker；1-14：agl-ccm_06768；15-26：agl-ccm_05789；27-39：agl-ccm_02831。图5为本发明蛹虫草突变菌株的pcr阳性鉴结果；其中，m：marker，wt：野生型菌株，1-10：ccm_06768，11-18：ccm_05789，19-24：ccm_02831。图6为本发明野生型蛹虫草菌株、蛹虫草突变菌株用hplc法检测胞内、外虫草素的含量(mg/l发酵液)；其中a：胞内虫草素，b：胞外虫草素。cm-wt：野生型蛹虫草；cm-ccm_06768-1～10(cctccaf2021021～2021030)：含腺苷琥珀酸合酶基因的蛹虫草突变菌株；cm-ccm_05789-1～8(cctccaf2021013～2021020)：含腺苷琥珀酸裂合酶基因的蛹虫草突变菌株；cm-ccm_02831-1～6(cctccaf2021007～2021012)：含5’-核苷酸酶基因的蛹虫草突变菌株。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明保护范围并不局限于此。应理解，阅读了本发明的具体实施方式，本领域技术人员在没有背离本发明的精神下可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。蛹虫草菌株所用培养基pda培养基：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉15g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然；蛹虫草发酵培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，kh2po40.5g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，l-甘氨酸1g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。细菌菌株所用培养基lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，溶剂为蒸馏水，3m氢氧化钠调节ph至7.0。若要配制固体培养基，则再添加琼脂粉15g/l。im培养基：kh2po41.45g/l,k2hpo42.05g/l,mgso4·7h2o0.6g/l,nacl0.1g/l,cacl20.01g/l,feso40.001g/l,nh4no30.5g/l,甘油5ml/l,mes缓冲液(1mol/l,ph5.5)40ml/l,微量元素储备液(100mg/lznso4·7h2o,100mg/lcuso4·h2o,100mg/lh3bo3,100mg/lna2moo4·7h2o)5ml/l,葡萄糖2g/l，另外，im固体培养基葡萄糖终溶度减为1g/l,琼脂粉15g/l，溶剂为蒸馏水。aim培养基：含终溶度为200μmol/l乙酰丁香酮的im液体培养基。实施例1构建含腺苷琥珀酸合酶基因的蛹虫草突变菌株1.重组载体的构建蛹虫草基因组dna提取：将蛹虫草(cordycepsmilitariscgmcc3.14242)接种至50ml发酵培养基，在25℃,150rpm条件下发酵培养5d，发酵液5000r/min离心10min，收集菌丝体。用真菌基因组dna快速抽提试剂盒(生工生物工程有限公司,产品编号：b518229)抽提蛹虫草基因组dna：①取100mg新鲜大型真菌或20mg干燥子实体用液氮研磨成粉末，放至1.5ml离心管中，依次加入200μlbufferdigestion和2μlβ-巯基乙醇，再加入20μlproteinasek溶液，震荡混匀后，56℃水浴1h至细胞完全裂解；②加入100μlbufferpf，充分颠倒混匀，-20℃放置5min；③室温10000rpm离心5min，将上清液转移至新的1.5ml离心管中；④加入200μlbufferbd，充分颠倒混匀；⑤加入200μl的无水乙醇，充分颠倒混匀；⑥将吸附柱放入收集管中，用移液枪将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再室温10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；⑦将吸附柱放回收集管，加入500μlpwsolution,10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液；⑧将吸附柱放回收集管，加入500μlwashsolution,10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液；⑨将吸附柱放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的washsolution；⑩取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50μltebuffer静置3min，12000rpm室温离心2min，收集dna溶液，提取的dna可立即进行下一步实验或-20℃保存。利用表1引物ccm_06768-f/ccm_06768-r,进行目的基因腺苷琥珀酸合酶(ccm_06768)基因的扩增，pcr反应体系如表2。pcr扩增的程序：94℃预变性5min，循环次数1；94℃变性30s，63.3℃退火30s，72℃延伸2min，循环次数3；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸2min，循环次数27；72℃终延伸10min，循环次数1。扩增获得的产物先进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据条带的长度初步判断序列是否扩增成功，结果如图1。之后，通过sanprep柱式dna胶回收试剂盒将扩增得到的基因片段胶回收，具体操作如下：将回收的片段放入离心管中，加入bufferb2溶液300μl，50℃水浴10min至胶块完全溶解；加入异丙醇100μl，充分颠倒混匀；将胶液全部转移至吸附柱(吸附柱放在收集管中)中，室温下离心30s(9000rpm)，倒去收集管中的溶液；往吸附柱中加入washsolution500μl，室温下离心30s(9000rpm)，倒去收集管中的溶液；重复一次上一步骤，再在室温下离心2min(9000rpm)，除去残留的washsolution溶液；把吸附柱的盖子打开后30℃水浴加热10min挥发乙醇；取出吸附柱放入新的离心管中，加入tebuffer35μl后室温下静置3min；室温下离心1min(9000rpm)，收集目的基因腺苷琥珀酸合酶(ccm_06768)基因的dna溶液，-20℃保存。表1腺苷琥珀酸合酶(ccm_06768)pcr扩增引物表2pcr反应体系将含有载体pcambia0380的大肠杆菌(e.colidh5α)接种至lb固体培养基中活化，37℃恒温培养24h。挑取单菌落接种至lb液体培养基中，37℃、180rpm条件下恒温振荡培养18h制备种子液。吸取500μl种子液转接至50mllb液体培养基中，37℃、180rpm条件下恒温振荡培养12h。用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取载体的dna，具体步骤如下：取1.2ml菌液室温下离心2min(8000rpm)，弃去上清液；往剩下的菌体沉淀中加入bufferp1溶液250μl，重悬后颠倒混匀，继续加入bufferp2溶液250μl，立即缓慢颠倒混匀5-10次，室温下静置2-4min；加入bufferp3溶液350μl，缓慢颠倒混匀5-10次，室温下静置5min，再在室温下离心10min(10000rpm)；收集上清液，取680μl上清液转移至吸附柱(吸附柱放在收集管中)中，室温下离心30s(9000rpm)，倒去收集管中的溶液；加入dw1溶液500μl，室温下离心30s(9000rpm)，倒去收集管中的溶液；加入washsolution溶液500μl，室温下离心30s(9000rpm)，倒去收集管中的溶液，重复该步骤一次；再在室温下离心2min(9000rpm)，除去残留的washsolution溶液；把吸附柱的盖子打开后30℃水浴加热10min挥发乙醇；取出吸附柱放入新的离心管中，加入elutionbuffer50μl后室温下静置2min；室温下离心1min(9000rpm)，得到载体pcambia0380的dna溶液。收集的dna溶液在-20℃条件下保存。载体pcambia0380通过表3引物vector-f和vector-r进行pcr扩增，得到线性化载体。pcr的反应体系如表4。pcr扩增程序：94℃预变性5min，循环次数1；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸6min，循环次数25；72℃终延伸10min，循环次数1。扩增得到的产物加入1μldpni酶，37℃水浴切割2h去除余下的模板dna，80℃水浴加热15min灭活dpni酶。将得到的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据条带的长度初步判断序列是否扩增成功，结果如图2。用sanprep柱式dna胶回收试剂盒将扩增得到的线性化载体胶回收，具体的操作同目的基因胶回收，得到线性化载体dna溶液在-20℃条件下保存。表3载体线性化引物表4pcr反应体系采用-uniseamlesscloningandassemblykit(北京全式金生物技术有限公司，cu101-02)将腺苷琥珀酸合酶(ccm_06768)基因与线性化载体pcambia0380连接，得到重组产物。具体步骤：按反应体系(表5)分别加入各个成分，轻轻混合，50℃反应15分钟。反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒。之后将重组产物保存于-20℃或直接用于转化。表5克隆反应体系2.转化大肠杆菌dh5α冰上融化trans1-t1(ecolidh5α)感受态细胞，在50μl细胞中加入2μl构建好的重组产物，轻轻混匀后，冰上放置30min；42℃水浴热激30s，马上转至冰上冷却2min；加入450μl常温的lb液体培养基，37℃摇床中190rpm培养1h；之后将含卡那霉素50μg/ml的lb平板在37℃预热，取100μl细胞均匀涂布于平板上，37℃培养箱中过夜培养。挑取单菌落用表6引物ide1-f/ide1-r进行菌落pcr鉴定，pcr反应体系见表7，pcr的扩增程序：94℃预变性5min，循环次数1；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，循环次数30；72℃终延伸10min，循环次数1。根据1％琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果可初步判定是否为阳性克隆，检验转化是否成功，结果如图3。表6菌落pcr引物表7pcr反应体系将大肠杆菌阳性克隆接种至lb液体培养基，37℃摇床中190rpm培养12h用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒按照说明书抽提质粒dna，具体操作同载体pcambia0380的dna提取，提取的质粒dna可立即进行下一步实验或-20℃保存。3.转化根癌农杆菌将5μl构建好的质粒加入至100μl根癌农杆菌感受态细胞(上海懋康生物科技有限公司，mf2305-1000μl)中，立即转移至液氮中放置5min后，37℃水浴热激5min；向感受态细胞中加入1mllb液体培养基，28℃、180rpm温育培养3h；3500rpm离心10min，倒掉上清，剩余的菌液用移液器缓慢反复吹吸重悬并把100μl菌液接种至含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的lb平板上，28℃恒温培养两天。挑取单菌落用表6引物ide1-f/ide1-r进行菌落pcr鉴定，pcr反应体系见表7，pcr的扩增程序：94℃预变性5min，循环次数1；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，循环次数30；72℃终延伸10min，循环次数1。根据1％琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果可判定转化是否成功，结果如图4。4.同源重组载体蛹虫草中的转化(根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化)(1)从上一步骤的lb平板上挑取农杆菌阳性单菌落，接种至3ml含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的lb液体培养基中，28℃，180rpm，震荡培养36h；取500μl菌液转接至50ml农杆菌aim培养基中，180rpm、28℃恒温培养6～8h，菌体浓度od600＝0.6-0.8，得到农杆菌菌液。(2)蛹虫草孢子培养和收集：将野生型蛹虫草(梁山正大食用菌研究所)接种至pda培养基，25℃恒温避光培养7d后，在超净工作台上用无菌水反复冲洗pda培养基表面，得到蛹虫草的菌悬液。菌悬液用纱布过滤得到蛹虫草的孢子悬液，取1ml蛹虫草孢子悬液用血球计数板检测溶度，为1.0×1011个/ml；用移液器吸取100μl原孢子悬液用900μl无菌水稀释，再取稀释后的孢子悬液100μl用900μl无菌水稀释，重复该操作直至孢子悬液的孢子浓度为1×106个/ml停止。(3)取100μl浓度为1×106个/ml的蛹虫草孢子悬液与步骤(1)od600＝0.6-0.8农杆菌菌液等体积混合均匀后，得到混合菌液；将无菌玻璃纸紧密贴合在im固体培养基表面，混合菌液均匀涂布至玻璃纸表面，25℃恒温共培养2d后，连同玻璃纸转到含200μg/ml潮霉素、50μg/ml卡那霉素和100μg/ml头孢菌素的im固体培养基表面(涂布菌种面朝上，培养基厚度3mm)，之后在玻璃纸表面再倒一层含200μg/ml潮霉素、50μg/ml卡那霉素和100μg/ml头孢菌素的im固体培养基且完全覆盖玻璃纸(培养基厚度3mm)，25℃恒温避光培养5-7d后，蛹虫草菌株菌丝穿透上层im固体培养基后，挑取平板上穿透im固体培养基的单菌落，分别接种至含200μg/ml潮霉素的pda培养基，25℃恒温避光培养5d，连续培养五代(单菌落接种至含200μg/ml潮霉素的pda培养基，25℃恒温避光培养5d)后，获得稳定遗传的含潮霉素抗性的蛹虫草突变菌株，即含腺苷琥珀酸合酶(ccm_06768)基因(seqidno.1所示)的蛹虫草突变菌株，分别计为cm-ccm_06768-1～10。(4)分别挑取上述含腺苷琥珀酸合酶(ccm_06768)基因的蛹虫草突变菌株cm-ccm_06768-1～10接种至50ml发酵培养基，在25℃,150rpm条件下发酵培养5d，发酵液5000r/min离心10min，收集菌丝体。用真菌基因组dna快速抽提试剂盒(生工生物工程有限公司,产品编号：b518229)抽提含腺苷琥珀酸合酶(ccm_06768)基因的蛹虫草突变菌株的基因组dna，具体操作同重组载体的构建中蛹虫草菌丝基因组dna提取，提取的dna溶液作为pcr阳性鉴定的模板dna。pcr阳性鉴定的引物见表8，反应体系如表9。pcr的扩增程序：94℃预变性5min，循环次数1；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环次数30；72℃终延伸10min，循环次数1。根据1％琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果可判断是否为阳性克隆，结果如图5。把鉴定结果为阳性的转化子接种至pda培养基斜面上，25℃恒温避光培养7d，-4℃保存。表8pcr鉴定引物表9pcr反应体系(5)虫草素含量的检测分别收集蛹虫草野生型菌株(梁山正大食用菌研究所)和步骤(4)中连续传代后获得的各个突变菌株的新鲜孢子悬浮液，浓度调至1×106个/ml，取500μl接种至50ml上述蛹虫草发酵培养基，25℃恒温，150rpm摇床振荡培养9d；发酵液10000r/min离心10min,用蒸馏水重复洗涤菌丝体三次后60℃干燥至恒重，收集蛹虫草的菌丝体和发酵上清液。准确称取干重菌丝体50mg，加入40ml去离子水，80℃加热提取3h。5000r/min离心取上清液，减压蒸馏后定容至1ml，经0.45μm滤膜过滤后供检测，记为待测品1，用于检测胞内虫草素含量。另外取1ml发酵上清液加入9ml去离子水稀释并混匀后过0.45μm微孔滤膜供检测，记为待测品2，用于检测胞外虫草素含量。采用hplc法检测待测品1和2中虫草素的含量，色谱条件：c18色谱柱(250mm×4.6mm)，紫外检测波长260nm，流动相甲醇(25ml)：水(75ml)，流速1.0ml/min，进样量5μl。结果如图6所示，相对于野生型菌株，突变型菌株的胞内、外虫草素含量均有所提高。将菌株cm-ccm_06768-1～10进行保藏(保藏号依次为：cctccaf2021021～2021030保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2021年01月04日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。)。另外，在菌株cm-ccm_06768-1～10中选取出胞内、外虫草素表达量分别高于57mg/l(发酵液)和880mg/l(发酵液)的菌株，分别为cm-ccm_06768-5(cctccaf2021025)和cm-ccm_06768-9(cctccaf2021029)。实施例2构建含腺苷琥珀酸裂合酶基因的蛹虫草突变菌株蛹虫草(cordycepsmilitariscgmcc3.14242)基因组dna的提取同实施例1。利用表10引物ccm_05789-f/ccm_05789-r经pcr扩增获得腺苷琥珀酸裂合酶(ccm_05789)基因，pcr反应体系如表11，pcr扩增程序：94℃预变性5min，循环次数1；94℃变性30s，63.6℃退火30s，72℃延伸2min，循环次数3；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸2min，循环次数27；72℃终延伸10min，循环次数1。扩增获得的产物先进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据条带的长度初步判断序列是否扩增成功，结果如图1。之后，通过sanprep柱式dna胶回收试剂盒将扩增得到的基因片段胶回收，具体操作同实施案例1，收集目的基因腺苷琥珀酸裂合酶(ccm_05789)基因的dna溶液，-20℃保存。表10腺苷琥珀酸裂合酶(ccm_05789)pcr扩增引物表11pcr反应体系接下来的载体pcambia0380dna溶液的收集及线性化载体dna的制备，同实施案例1。采用uniseamlesscloningandassemblykit(北京全式金生物技术有限公司，cu101-02)将腺苷琥珀酸裂合酶(ccm_05789)基因与线性化载体pcambia0380连接，得到重组产物，具体操作流程同实施案例1。转化大肠杆菌dh5α、转化根癌农杆菌及同源重组载体蛹虫草中的转化同实施例1，挑取平板上穿透im固体培养基的单菌落，分别接种至含200μg/ml潮霉素的pda培养基，25℃恒温避光培养5d，连续培养五代(单菌落接种至含200μg/ml潮霉素的pda培养基，25℃恒温避光培养5d)后，获得稳定遗传的含潮霉素抗性的蛹虫草突变菌株，即含腺苷琥珀酸裂合酶(ccm_05789)基因(seqidno.2所示)的蛹虫草突变菌株，分别计为cm-ccm_05789-1～8。分别挑取上述含腺苷琥珀酸裂合酶(ccm_05789)基因的蛹虫草突变菌株cm-ccm_05789-1～8接种至50ml发酵培养基，在25℃,150rpm条件下发酵培养5d，发酵液5000r/min离心10min，收集菌丝体。蛹虫草突变菌株的基因组dna提取方法同实施案例1，以此作为pcr阳性鉴定的dna模板。pcr阳性鉴定的引物、反应体系及扩增程序同实施案例1，根据1％琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果可判断是否为阳性克隆，结果如图5。把鉴定结果为阳性的转化子接种至pda培养基斜面上，25℃恒温避光培养7d，-4℃保存。虫草素含量的检测具体操作同实施案例1。测定的蛹虫草突变菌株的胞内、外虫草素含量结果如图6所示。将菌株cm-ccm_05789-1～8进行保藏(保藏号依次为：cctccaf2021013～2021020保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2021年01月04日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072)。另外，在菌株cm-ccm_05789-1～8中选取出胞内、外虫草素表达量分别高于57mg/l(发酵液)和880mg/l的菌株(发酵液)，分别为cm-ccm_05789-3(cctccaf2021015)和cm-ccm_05789-4(cctccaf2021016)。实施例3构建含5’-核苷酸酶基因的蛹虫草突变菌株蛹虫草(cordycepsmilitariscgmcc3.14242)基因组dna的提取同实施例1。利用表12引物ccm_02831-f/ccm_02831-r经pcr扩增获得5’-核苷酸酶(ccm_02831)基因，pcr反应体系如表13，pcr扩增程序：94℃预变性5min，循环次数1；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸2min，循环次数3；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸2min，循环次数27；72℃终延伸10min，循环次数1。扩增获得的产物先进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，根据条带的长度初步判断序列是否扩增成功，结果如图1。之后，通过sanprep柱式dna胶回收试剂盒将扩增得到的基因片段胶回收，具体操作同实施案例1，收集目的基因5’-核苷酸酶(ccm_02831)基因的dna溶液，-20℃保存。表125’-核苷酸酶(ccm_02831)pcr扩增引物表13pcr反应体系接下来的载体pcambia0380dna溶液的收集及线性化载体dna的制备，同实施案例1。采用-uniseamlesscloningandassemblykit(北京全式金生物技术有限公司，cu101-02)将5’-核苷酸酶(ccm_02831)基因与线性化载体pcambia0380连接，得到重组产物，具体操作流程同实施案例1。。转化大肠杆菌dh5α、转化根癌农杆菌及同源重组载体蛹虫草中的转化同实施案例1，挑取平板上穿透im固体培养基的单菌落，分别接种至含200μg/ml潮霉素的pda培养基，25℃恒温避光培养5d，连续培养五代(单菌落接种至含200μg/ml潮霉素的pda培养基，25℃恒温避光培养5d)后，获得稳定遗传的含潮霉素抗性的蛹虫草突变菌株，即含5’-核苷酸酶(ccm_02831)基因(seqidno.3所示)的蛹虫草突变菌株，分别计为cm-ccm_02831-1～6。分别挑取上述含5’-核苷酸酶(ccm_02831)基因的蛹虫草突变菌株cm-ccm_02831-1～6接种至50ml发酵培养基，在25℃,150rpm条件下发酵培养5d，发酵液5000r/min离心10min，收集菌丝体。蛹虫草突变菌株的基因组dna提取方法同实施案例1，以此作为pcr阳性鉴定的dna模板。pcr阳性鉴定的引物、反应体系及扩增程序同实施案例1，根据1％琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果可判断是否为阳性克隆，结果如图5。把鉴定结果为阳性的转化子接种至pda培养基斜面上，25℃恒温避光培养7d，-4℃保存。虫草素含量的检测具体操作同实施案例1。测定蛹虫草突变菌株的胞内、外虫草素含量的结果如图6所示。将菌株cm-ccm_02831-1～6进行保藏(保藏号依次为：cctccaf2021007～2021012保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2021年01月04日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。)。另外，在菌株cm-ccm_02831-1～6中选取出胞内、外虫草素表达量分别高于57mg/l(发酵液)和880mg/l(发酵液)的菌株，为cm-ccm_02831-4(cctccaf2021010)。表13各个菌株的保藏号与原始编号cctcc编号属名种名原始编号cctccaf2021007cordycepsmilitariscm-ccm_02831-1cctccaf2021008cordycepsmilitariscm-ccm_02831-2cctccaf2021009cordycepsmilitariscm-ccm_02831-3cctccaf2021010cordycepsmilitariscm-ccm_02831-4cctccaf2021011cordycepsmilitariscm-ccm_02831-5cctccaf2021012cordycepsmilitariscm-ccm_02831-6cctccaf2021013cordycepsmilitariscm-ccm_05789-1cctccaf2021014cordycepsmilitariscm-ccm_05789-2cctccaf2021015cordycepsmilitariscm-ccm_05789-3cctccaf2021016cordycepsmilitariscm-ccm_05789-4cctccaf2021017cordycepsmilitariscm-ccm_05789-5cctccaf2021018cordycepsmilitariscm-ccm_05789-6cctccaf2021019cordycepsmilitariscm-ccm_05789-7cctccaf2021020cordycepsmilitariscm-ccm_05789-8cctccaf2021021cordycepsmilitariscm-ccm_06768-1cctccaf2021022cordycepsmilitariscm-ccm_06768-2cctccaf2021023cordycepsmilitariscm-ccm_06768-3cctccaf2021024cordycepsmilitariscm-ccm_06768-4cctccaf2021025cordycepsmilitariscm-ccm_06768-5cctccaf2021026cordycepsmilitariscm-ccm_06768-6cctccaf2021027cordycepsmilitariscm-ccm_06768-7cctccaf2021028cordycepsmilitariscm-ccm_06768-8cctccaf2021029cordycepsmilitariscm-ccm_06768-9cctccaf2021030cordycepsmilitariscm-ccm_06768-10序列表seqidno.1seqidno.2seqidno.3序列表<110>浙江工业大学<120>过表达虫草素的重组蛹虫草<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1690<212>dna<213>蛹虫草(cordycepsmilitariscgmcc3.14242)<400>1atgagtattacagtcattctcggctcccagtggggtatgtcgcaatttcagccgttcgcg60caaacagcccctccatgaggcataagggccaagtcgcgaccacgaaagctaactgagcat120tcttgcgcttgcaatttctaggcgacgaaggaaaaggaaagattagcgatatcctctgcg180gcgaggctgatttgtgttgtcgcgctgccgggggggcaaacgcaggccactccgtccagt240acgttgcgacgttgttttcattttcgcgtctatggatgtaggtcttgctaacatttgaat300gcgcagtgccaatggagtctcctacgagtacgtacacttcgaaccgaaactgacgagaca360caataagtaataaccaactaacgcacatgcagcttccacttgctgccgtctggtctcatc420agcccgcgctgcatgaacctgattggctccggtgtcgtcttcagcgtccatgccttcttc480tccgagctgcaggcgctcgaggacaagggcctcaaggacgtgcgggagcgcatcctcgtc540agcgaccgcgcccaggtcaacctggagctccacgcccgcgtcgacggtctggaggaggcg600gagctaggaacccgcaagattggcacgaccgggcgaggcatcggccccagctacgccgag660tttgttttccaaaacactgagcgttttttgcggtcaaactaacttcccttgtagtaaagc720tagccgcagcggaatccgggtccacgagattttcaaccaggcgaaatttgaaaagaggct780ccgcgagttggcaagtgggtacaagaagcgcttcggcgacctcctcgattacaatgtcga840ggacgagatcaagaaatttcaggagtggcgcgagatgctaagaccgttttgcatcaatgc900cgtcacctttatggagaatgcccaggacgacgcttccaagaagatcttggtcgaaggtgc960caatgcgctcatgctggacgtggactacggcacctacccgttcgtcaccagctccaacac1020tgatatcggcggtgccatcaaaggtctggctctgagcccgttcaagctcaaggaaatcat1080tgggtatgcaccagtacagaaaatgcacccgagtccgtactcgaggctaaccagaacagc1140gttgtcaaggcgtacacgacgcgggtgggtggcgggcccttcaagacggaggatctcggc1200gaagccggcaacaagctgcaggagattggccgcgaatggggcgtgtcgaccggccgccgc1260cgtcgctgcggctggctcgacctggcagtgctcaagtactcgtgtgccatcaacaagtac1320acggcgctgaacctgaccaagctcgacatcctcgacacctttcccgtcatccaggtcgcc1380gtcgcgtacaaggaccctgagacgggcgacttgattgactactttcccgccgacctcgac1440cagctcgaggcgctcgaggtcgtctacgaggagttcaagggctggcagacgcccatcacg1500tccatcaagacgtatgcggagctgcccgaggaggccaaggagtacattgagtacattgaa1560aagttcctcaacgtccccatcaagtggatcggtaccggacgtaagtacatgcctgagaag1620aggtcgttgggtgcaacgtgctaatgctaatccgactatagctaaacgcgacgacatgat1680ttaccggtaa1690<210>2<211>1755<212>dna<213>蛹虫草(cordycepsmilitariscgmcc3.14242)<400>2atggcaactgacggaaaaaatgctgggacgtcgccctacgatacgtatcagacgtcgctg60acggcgagatattgcagcccggagatgtcacgactctttggccagcgctctcgccactca120caatggcgcaggctttggctgctgctcgccgagtctgagagagagctcggcatccagacc180atcacgacggaagcgctcgagcaaatgaagcagcatctggaagtcaccgaccaagacttt240gaggttgccagggtcgaggagaagatccgccgccacgacgtcatggctcatgtacacgcc300ttcggagctgtcgcgccggcagcggccggtatcatccactacggtgtaagtcgaagttga360aattgccgccgtttttgatgctttgtgataatttgtcctgcaagtctttgtcaattgagt420ctaacggttgaaaatcaggcgacaagctgctttgtaaccgacaatgcggagctgattctc480atgcgtgatgccatggatcttctcctcccaagactggcgaaggttatttccaacctttgc540aaacttgctagggaatggaaggcaacaccaactctggcatacacgcatttgcagccaggt600attttttaccgatcatcaccaagccggtagaaggttgctaaccattcacagctcaactga660ttacaggtaaccgaagcagtgccgccttttgatgatattatcccttgaaaaaatattgat720atacgtctagttggaaagcgggcagcccaatgggcccaagatctcgttttcgaccttgag780agtatcgagcacgctcgcaatggtctacttcttcgaggtgagccgccatacacatggtgc840atctgacagcgagagactgaatgacaggtaattccaggtgcacaaggaactacgggaact900caagcttcgttcctcgagatttttggcggtgatggttccaagtgtgacgagttgaacgca960ctattgtgcaagaagatcgacttccctgggtgctacgacgtgtcgacgcaaacgtacacc1020cgcaaggttgaccttctcgtagccaacgccatctgcggcctgggtgctacggcccaaaag1080attgccggagatgtccgccatctcgcctcgtggcaggaagccgaggagccttttgaaacc1140aaacaggtggggtcaagtgccatgcccttcaaaagaaacccgatgcgttccgagagagtc1200tccagtctcgcccgagagcttttgtccaagcaggcgacgactgcaaacaccctcgcggcg1260caatggatggagcgctcactggacgacagtgccgtccgcagaatggacttgcccgagatt1320ttcctcttggccgatgccatcattggcagcctggacaacatcaccgacggcatggtcatt1380taccctcaggtggtttcctcgcgggtgcaggaacaactgccttttatgtgcgcagagaat1440atcatcatgaagctttgtgccaaaggcgtctccaggcaggaagcccacgagcagatccgc1500gtcttgtcgcaccaagctgccggtgtcgtgaagctcgagggtaagcccaatgatcttatc1560gatagaatcaaggccaccgagttcttccaaccgatctgggctgatctggacaatatgctg1620agacctgagctctacattggtcgtagtgttgaaattgtggaccgttactgtggtctagaa1680ggcgtagccgagcgaaagatccagaaatacagggccgtcttcgagaagtcagcaacgacg1740gagctgaatgtctaa1755<210>3<211>1871<212>dna<213>蛹虫草(cordycepsmilitariscgmcc3.14242)<400>3atgaagactgctgctactctcctcgcggcccttggcgttgcctcgtgtgccgccgccgat60gatgtcttatacagcaagcgtcacctctccaagcgcttcattgacagcgatggccactac120aacatgagtaggagaagacgaaatcggtcgagaaaagaagcctcgctaatctaggaatgt180caatagcctttatccacgtcaatgatatccacgcacatctggacgagtttgccaagtccg240gctcagactgcacagacccctccaagggctgcttcggtggctatgcgcgcatcaagacca300aggtcgaggagcttcgcgagacgtttcccgaccacctgctcctcaacgccggtgacgagt360ttcagggcaccctgttcttttcgtactatggtggtgagaagattgccgagacagtcaaca420atctcaagtttgacgtcatgaccctgggcaaccacgaatgggatcatggtgacgaggagc480ttggtgcgtttctcacgaacctgactttccccgtcgtctcttgcaatgtcaagtccgact540atgaggctctcaacaaaacggtcaagaactaccacatctttgaccagcacaagctggccg600tcatcggcgccaccacggagacgaccaagggtatttccaacgtcggcagcggaaccaact660ttctcgatgtcacgaccgaggtccaaaaggccatctgggagattcgcaacacgaccgaca720tccgccgcattgtcgccctcactcacattggctacgaggaggaccagaaactggccgaga780ataccgaaggcctttccctcattgttggcggccacagccacaccctgattggtgacatgc840ccaacgccgctggaaagtaccctaccattatcaaggacaagtctggcaaggaggtctttg900tcgtcacctcgtaccgatggggcgagtatctcggctccattgatctgacctttgacaagg960agggccgcgctctctcgtaccacggtgcgcccatccacatgaccaacacgacgaagctcg1020aaacgtcgcttcaggacaagatcctggcttggcgcaagccctttgaggagtttggcagcg1080aggtcattggaacgaccaagaacgagctcgaccagaccacctgccaaaagggcgactgcc1140tcctcggccaggtcatggtcgacgccatgctcgactaccgccgcaacatttccaagaatg1200ctggcgacgagcttgccgactttgcctttatgaacgctggcggtgtccgggccaccattg1260acgccggcaacatcacgcgcggcgaggtcatcacctcatttccctttggcaacgccgttg1320tccagctcccctactcgggcaaggacctgcgcaagattatcgagggctgggtctcgcgcg1380agaaccagttcagcaagaagaagacgtcgtcttggttccaaatctccaaggacatcaaga1440ttgagtacaacccggacaacgcggccggcagcaagctgattagcgtgaccgtgggcggga1500agccgctggacgagagccgtgaggagtaccgggtcgtgacgctcgacttcatcgcgcgtg1560gcggtgacaatctcctcgagcccacgacgggctttgccgcccttgatgccgattcggatg1620tattcgaggcttacgtcaaggcgaatacgcccctgacaaacgctctcgagaagcgcgtgg1680tcacgacggataagaaggccccgaatgcaacttcgactcccggaggcaacaatgccacga1740gcacaaccagctccggcagcggcagctccagcactggtggcgccgcgaaccccaacggcg1800ctgctgcgggtcttgcgatgtcgactggccttgcctttgtcgtggctgttgtcatggctt1860tggcgatttag1871当前第1页12