连续生产鞣花酸的方法及装置

1.本发明涉及单宁降解技术，具体地，涉及一种连续生产鞣花酸的方法及装置。


背景技术：

2.鞣花酸的植物来源多是五倍子，但五倍子是动物的虫瘿，虽属于中药但是仅限于外用，其产生的花酸不能用于食品添加剂。石榴皮中含有大量的鞣花酸前体，如安石榴苷、鞣花单宁等，经水解可生产鞣花酸，进而实现利用废物资源来生产制备鞣花酸。由此，探索由石榴皮到鞣花酸的绿色高效降解途径成为资源利用的一个热点研究领域。
3.目前，对石榴皮的降解主要有化学酸水解、酶催化反应降解法和微生物发酵降解法，其中，化学酸水解法通常应用硫酸、盐酸等对单宁提取液进行水解，鞣花酸纯度在20％
‑
40％，具有较高的产率和纯度，但对设备的抗腐蚀能力要求很高，存在反应时间长、反应条件剧烈、设备腐蚀、污水难以处理、区域选择性差等确定；酶催化反应降解法反应条件温和、选择性高且产物稳定性好，但是存在着溶剂对底物溶解、溶剂极性对酶活抑制等制约，且不能反复利用、易失活；微生物发酵降解法制备鞣花酸，主要过程分为液态发酵产酶阶段和酶促转化阶段，此法过程繁琐，酶促转化条件要求严格，不易控制，且产物分离纯化困难。此外，现有石榴皮的降解方法均不能实现连续生产，只能进行间歇性的生产。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种连续生产鞣花酸的方法和装置，能够实现连续、高效地生产鞣花酸。
5.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种连续生产鞣花酸的方法，包括以下步骤：将单宁酶经多巴胺涂层固定后，与含有单宁的底物溶液进行接触。
6.优选地，所述多巴胺涂层的制备方法包括：将硅胶表面进行氨基化处理后得到氨基化硅胶，利用含有多巴胺的固定溶液对所述氨基化硅胶进行修饰。
7.优选地，所述氨基化处理的过程包括：将所述硅胶的表面与氨基化溶液进行接触、孵育后，再将所述硅胶进行冲洗、干燥得到所述氨基化硅胶。
8.优选地，所述氨基化溶液采用体积分数为5
‑
15％的3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷
‑
乙醇溶液，所述固定溶液中多巴胺的含量为0.5
‑
1.5mg/ml，所述冲洗采用低级有机醇；
9.所述孵育的条件至少满足：温度为50
‑
70℃、时间为2
‑
4h，所述干燥的条件至少满足：温度为110
‑
140℃、时间为0.5
‑
1.5h。
10.优选地，相对于表面积为1cm2的所述硅胶，所述3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷的用量为20
‑
25μl，所述多巴胺的用量为300
‑
340μg，所述单宁酶的用量为50
‑
320μg。
11.优选地，所述含有单宁的底物溶液为石榴皮的乙醇提取液；所述单宁酶以单宁酶
‑
水溶液的形式进行所述固定，所述单宁酶
‑
水溶液中单宁酶的浓度为0.5
‑
3mg/ml；所述固定的条件至少满足：温度为20
‑
30℃、时间为8
‑
12h。
12.优选地，所述接触的条件至少满足：温度为40
‑
55℃、时间为20
‑
45min。
13.本发明第二方面提供一种连续生产鞣花酸的装置，包括硅胶管、用于将含有鞣花酸的底物输送至所述硅胶管内的注射器、用于驱动所述注射器的恒流泵和用于收集所述硅胶管内的反应产物的产物收集器，所述硅胶管的内腔表面形成为固定有单宁酶的多巴胺涂层，所述硅胶管的一端与所述注射器连接、另一端与所述产物收集器连接。
14.优选地，所述恒流泵的流速为0.5
‑
100μl/min，所述硅胶管的内径为0.2
‑
0.5mm、长度为0.4
‑
0.6m。
15.优选地，该装置还包括恒温箱，所述硅胶管位于所述恒温箱内。
16.通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
17.本发明提供的连续生产鞣花酸的方法，采用多巴胺涂层固定单宁酶，对底物溶液中的单宁进行催化降解，多巴胺具有高效的酶负载率和载体吸附性，且作为温和材料，其营造的微环境对单宁酶具有保护作用，对单宁酶实现高效、安全的固定，单宁酶经固定化后可显著提高其催化活性的稳定性和重复利用度，以能够对单宁降解进行高效、连续的催化，以实现利用石榴皮连续、高效地生产高纯度的鞣花酸；该方法绿色环保、无污染。
18.本发明提供的连续生产鞣花酸的装置，形成固定化单宁酶催化单宁降解的微流控反应器，不仅能够实现连续催化反应，而且绿色、高效，以能够进行模拟放大，具备工业化前景。
附图说明
19.图1是本发明中连续生产鞣花酸的装置的一种具体实施方式的结构示意图；
20.图2是实施例1中固定化单宁酶和游离单宁酶的酶相对活性与使用次数的关系图。
21.附图标记说明
22.1注射器
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2硅胶管
23.3产物收集器
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4固定化单宁酶
具体实施方式
24.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
25.第一方面，本发明提供一种连续生产鞣花酸的方法，包括以下步骤：将单宁酶经多巴胺涂层固定后，与含有单宁的底物溶液进行接触。
26.本发明中，单宁酶经多巴胺涂层固定可以采用常规的固定化酶的制备方法；底物溶液中含有的单宁能够经相应的单宁酶催化降解成鞣花酸，所述接触的过程为单宁酶催化单宁进行降解反应的过程；该方法还包括将多巴胺涂层固定单宁酶后，利用柠檬酸钠溶液进行冲洗；该方法还包括将接触得到的反应产物进行纯化处理，得到高纯度的鞣花酸。
27.根据本发明，所述多巴胺涂层的制备方法包括：将硅胶表面进行氨基化处理后得到氨基化硅胶，利用含有多巴胺的固定溶液对所述氨基化硅胶进行修饰。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高多巴胺涂层对单宁酶的固定效率和固定稳定性。
28.根据本发明，利用含有多巴胺的固定溶液对所述氨基化硅胶进行修饰的温度为
40
‑
60℃，具体可以为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，或者上述两个值之间的任意值。所述修饰后可以对经修饰的硅胶进行冲洗，例如可以采用tris
‑
hcl缓冲液以流速50
‑
150μl/m进行冲洗。
29.根据本发明，所述氨基化处理的过程包括：将所述硅胶的表面与氨基化溶液进行接触、孵育后，再将所述硅胶进行冲洗、干燥得到所述氨基化硅胶。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，通过冲洗、干燥使得氨基化后的硅胶表面不存在氨基化溶液的残留，不仅提高对硅胶表面进行氨基化后的稳定性，而且避免对多巴胺的修饰产生干扰。
30.优选地，所述氨基化溶液采用体积分数为5
‑
15％的3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷
‑
乙醇溶液，所述固定溶液中多巴胺的含量为0.5
‑
1.5mg/ml；所述冲洗采用低级有机醇，优选为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇中的至少一种，进一步优选为乙醇。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，多巴胺能够被3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷氧化成醌式结构，以形成更加稳定的多巴胺粘附层，进而能够与单宁酶中的氨基酸通过迈克加成反应共价交联，提高对单宁酶的固定化效率。
31.根据本发明，所述孵育的条件至少满足：温度为50
‑
70℃，具体可以为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，或者上述两个值之间的任意值；时间为2
‑
4h，具体可以为2h、2.5h、3h、3.5h、4h，或者上述两个值之间的任意值；所述干燥的条件至少满足：温度为110
‑
140℃，具体可以为110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃，或者上述两个值之间的任意值；时间为0.5
‑
1.5h，具体可以为0.5h、1h、1.5h，或者上述两个值之间的任意值。
32.根据本发明，相对于表面积为1cm2的所述硅胶，所述3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷的用量为20
‑
25μl，具体可以为20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl，或者上述两个值之间的任意值；所述多巴胺的用量为300
‑
340μg，具体可以为300μg、310μg、320μg、330μg、340μg，或者上述两个值之间的任意值；所述单宁酶的用量为50
‑
320μg，具体可以为50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、320μg，或者上述两个值之间的任意值。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高对硅胶的使用率，且提高单宁酶固定化的效率。
33.优选情况下，所述含有单宁的底物溶液为石榴皮的乙醇提取液，其具体的制备方法可参见常规的利用乙醇提取石榴皮中有效成分的方法；所述单宁酶以单宁酶
‑
水溶液的形式进行所述固定，所述单宁酶
‑
水溶液中单宁酶的浓度为0.5
‑
3mg/ml；所述固定的条件至少满足：温度为20
‑
30℃，具体可以为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，或者上述两个值之间的任意值；时间为8
‑
12h，具体可以为8h、9h、10h、11h、12h，或者上述两个值之间的任意值。
34.优选地，所述接触的条件至少满足：温度为40
‑
55℃，具体可以为40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃，或者上述两个值之间的任意值；时间为20
‑
45min，具体可以为20min、25min、30min、35min、40min、45min，或者上述两个值之间的任意值。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高单宁酶对单宁底物降解的催化效率。
35.第二方面，本发明提供一种连续生产鞣花酸的装置，参见图1，包括硅胶管2、用于将含有鞣花酸的底物输送至硅胶管2内的注射器1、用于驱动注射器1的恒流泵和用于收集硅胶管2内的反应产物的产物收集器3，硅胶管2的内腔表面形成为固定有单宁酶的多巴胺涂层，硅胶管2的一端与注射器1连接、另一端与产物收集器3连接。
36.根据本发明，连续生产鞣花酸的装置形成固定化单宁酶催化单宁降解的微流控反
应器，优选情况下，恒流泵采用微流泵，其流速为0.5
‑
100μl/min，相应地，注射器1将含有鞣花酸的底物输送至硅胶管2内的速率可以控制在0.5
‑
100μl/min；硅胶管2的内径为0.2
‑
0.5mm、长度为0.4
‑
0.6m。
37.根据本发明，连续生产鞣花酸的装置在进行催化单宁底物降解前，先利用注射器1将氨基化溶液输入硅胶管2内(流速为50
‑
150μl/min)，对硅胶管2的内腔表面进行氨基化处理，再利用注射器1将固定溶液输入硅胶管2内(流速为0.5
‑
1.5μl/min)，对硅胶管2的内腔表面进行修饰以形成多巴胺涂层，然后再利用注射器1将含有单宁酶的溶液输入硅胶管2内(流速为0.5
‑
1.5μl/min)，将单宁酶固定在多巴胺涂层上形成固定化单宁酶4，以完成将单宁酶经多巴胺涂层固定的过程。该装置连续生产鞣花酸的过程为：在恒流泵的推动下，利用注射器1将含有单宁的底物溶液输入硅胶管2内(流速为5
‑
15μl/min)，与硅胶管2内腔表面的多巴胺涂层固定的单宁酶进行接触，单宁酶催化单宁进行降解反应生成鞣花酸，通过产物收集器3收集硅胶管2排出的反应产物。
38.本发明中，硅胶管2使用前需进行预处理，例如，可以利用浓度为1m的氢氧化钠溶液进行清洗，利用注射器1将氢氧化钠溶液输入硅胶管2内，其流速为50
‑
150μl/min。
39.优选情况下，该装置还包括恒温箱，硅胶管2位于恒温箱内，以能够对多巴胺涂层固定的硅胶管2内进行羟基化、修饰和接触酶解反应的温度进行控制。
40.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
41.以下实施例中，鞣花酸的含量通过高效液相色谱法测得，具体的检测方法为：色谱柱采用acquity uplc beh
‑
c18(2.1mm
×
100mm,1.7μm)，柱温30℃，检测器为紫外检测器，检测波长为254nm，进样体积为20μl，流动相为超纯水和甲酸溶液，流速为1.0ml/min；线性洗脱程序为：0
‑
6min，5％甲酸，95％水；6
‑
10min，60％甲酸，40％水；10
‑
12min，100％甲酸；12
‑
14min，5％甲酸，95％水。
42.石榴皮的乙醇提取液制备方法：称取30g石榴皮粉末，倒入500ml圆底烧瓶，再向烧瓶中加入300ml提取剂(体积分数为70％的乙醇溶液)；在水浴锅中90℃回流，搅拌提取2h；放置室温，抽滤，取出上清即为石榴皮的乙醇提取液。
43.在没有特殊说明的情况下，其他原料试剂均为市售品。
44.下述实施例中，采用的连续生产鞣花酸的装置包括硅胶管、注射器、微流泵、产物收集器和恒温箱，硅胶管2的一端与注射器连接、另一端与产物收集器3连接。
45.实施例1
46.s1、选用长度为0.5m、内径0.03cm的硅胶管，首先用注射器将1m氢氧化钠溶液输入硅胶管内进行清洗(流速为100μl/min、流量为1ml)，然后用注射器将体积分数为10％的3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷(aptes)
‑
乙醇溶液(流速为100μl/min，流量为1ml)注入硅胶管内，调节恒温箱的温度为60℃，将硅胶管在60℃孵育3h以对硅胶管的内腔表面进行氨基化，经aptes处理的硅胶管用注射器注入的乙醇冲洗后，在温度为125℃的恒温箱内烘烤1h进行干燥，得到氨基化硅胶；
47.s2、调节恒温箱的温度为50℃，用注射器将1.5ml固定溶液(多巴胺浓度为1mg/ml)以1μl/min的流速在50℃下注射到硅胶管内，再用注射器注入10mmol的tris
‑
hcl缓冲液(流速为100μl/min、流量为1ml)冲洗后，用多巴胺成功地修饰了氨基化硅胶，得到具有多巴胺涂层的硅胶管；
48.s3、用注射器将500μl浓度为1.5mg/ml的单宁酶
‑
水溶液以1μl/min的流速注射到具有多巴胺涂层的硅胶管中，并在温度为25℃的恒温箱内保持10h以固定单宁酶，再用注射器将500μl浓度为0.1mol/l的柠檬酸钠溶液以10μl/min的流速输入硅胶管内进行冲洗，得到含有固定化单宁酶的硅胶管；
49.s4、用注射器将300μl石榴皮的乙醇提取物，以流速为10μl/min注入含有固定化单宁酶的硅胶管，在温度为45℃的恒温箱内反应30min，反应产物用产物收集器收集，得到含有鞣花酸的反应液。
50.实施例2
51.s1、选用长度为0.4m、内径0.05cm的硅胶管，首先用注射器将1m氢氧化钠溶液输入硅胶管内进行清洗(流速为100μl/min、流量为1ml)，然后用注射器将体积分数为5％的3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷(aptes)
‑
乙醇溶液(流速为50μl/min、流量为2.6ml)注入硅胶管内，调节恒温箱的温度为50℃，将硅胶管在50℃孵育4h以对硅胶管的内腔表面进行氨基化，经aptes处理的硅胶管用注射器注入的乙醇冲洗后，在温度为110℃的恒温箱内烘烤1.5h进行干燥，得到氨基化硅胶；
52.s2、调节恒温箱的温度为40℃，用注射器将3.8ml固定溶液(多巴胺浓度为0.5mg/ml)以1.5μl/min的流速在40℃下注射到硅胶管内，再用注射器注入10mmol的tris
‑
hcl缓冲液(流速为100μl/min、流量为1ml)冲洗后，用多巴胺成功地修饰了氨基化硅胶，得到具有多巴胺涂层的硅胶管；
53.s3、用注射器将165μl浓度为3mg/ml的单宁酶
‑
水溶液以0.5μl/min的流速注射到具有多巴胺涂层的硅胶管中，并在温度为20℃的恒温箱内保持12h以固定单宁酶，再用注射器将500μl浓度为0.1mol/l的柠檬酸钠溶液以10μl/min的流速输入硅胶管内进行冲洗，得到含有固定化单宁酶的硅胶管；
54.s4、用注射器将180μl石榴皮的乙醇提取物，以流速为5μl/min注入含有固定化单宁酶的硅胶管，在温度为40℃的恒温箱内反应45min，反应产物用产物收集器收集，得到含有鞣花酸的反应液。
55.实施例3
56.s1、选用长度为0.6m、内径0.02cm的硅胶管，首先用注射器将1m氢氧化钠溶液输入硅胶管内进行清洗(流速为100μl/min、流量为1ml)，然后用注射器将体积分数为15％的3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷(aptes)
‑
乙醇溶液(流速为150μl/min，流量为0.62ml)注入硅胶管内，调节恒温箱的温度为70℃，将硅胶管在70℃孵育2h以对硅胶管的内腔表面进行氨基化，经aptes处理的硅胶管用注射器注入的乙醇冲洗后，在温度为140℃的恒温箱内烘烤0.5h进行干燥，得到氨基化硅胶；
57.s2、调节恒温箱的温度为60℃，用注射器将0.85ml固定溶液(多巴胺浓度为1.5mg/ml)以0.5μl/min的流速在60℃下注射到硅胶管内，再用注射器注入10mmol的tris
‑
hcl缓冲液(流速为100μl/min、流量为1ml)冲洗后，用多巴胺成功地修饰了氨基化硅胶，得到具有多巴胺涂层的硅胶管；
58.s3、用注射器将2.41ml浓度为0.5mg/ml的单宁酶
‑
水溶液以1.5μl/min的流速注射到具有多巴胺涂层的硅胶管中，并在温度为30℃的恒温箱内保持8h以固定单宁酶，再用注射器将500μl浓度为0.1mol/l的柠檬酸钠溶液以10μl/min的流速输入硅胶管内进行冲洗，
得到含有固定化单宁酶的硅胶管；
59.s4、用注射器将300μl石榴皮的乙醇提取物，以流速为15μl/min注入含有固定化单宁酶的硅胶管，在温度为55℃的恒温箱内反应20min，反应产物用产物收集器收集，得到含有鞣花酸的反应液。
60.实施例4
61.s1、选用长度为0.6m、内径0.02cm的硅胶管，首先用注射器将1m氢氧化钠溶液输入硅胶管内进行清洗(流速为100μl/min、流量为1ml)，调节恒温箱的温度为60℃，用注射器将0.85ml固定溶液(多巴胺浓度为1.5mg/ml)以0.5μl/min的流速在60℃下注射到硅胶管内，再用注射器注入10mmol的tris
‑
hcl缓冲液(流速为100μl/min、流量为1ml)冲洗后，用多巴胺成功地修饰了硅胶，得到具有多巴胺涂层的硅胶管；
62.s2、用注射器将2.41ml浓度为0.5mg/ml的单宁酶
‑
水溶液以1.5μl/min的流速注射到具有多巴胺涂层的硅胶管中，并在温度为30℃的恒温箱内保持8h以固定单宁酶，再用注射器将500μl浓度为0.1mol/l的柠檬酸钠溶液以10μl/min的流速输入硅胶管内进行冲洗，得到含有固定化单宁酶的硅胶管；
63.s3、用注射器将300μl石榴皮的乙醇提取物，以流速为15μl/min注入含有固定化单宁酶的硅胶管，在温度为55℃的恒温箱内反应20min，反应产物用产物收集器收集，得到含有鞣花酸的反应液。
64.实施例5
65.按照实施例3的方法制备含有鞣花酸的反应液，不同的是，3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷(aptes)
‑
乙醇溶液的流速为1.5ml/min，固定溶液流速为50μl/min，单宁酶
‑
水溶液流速为100μl/min。
66.实施例6
67.s1、选用长度为0.6m、内径0.02cm的硅胶管，首先用注射器将1m氢氧化钠溶液输入硅胶管内进行清洗(流速为100μl/min、流量为1ml)，然后用注射器将体积分数为15％的3
‑
氨基丙基三甲氧基硅烷(aptes)
‑
乙醇溶液(流速为150μl/min，流量为0.62ml)注入硅胶管内，调节恒温箱的温度为70℃，将硅胶管在70℃孵育2h以对硅胶管的内腔表面进行氨基化，得到氨基化硅胶；
68.s2、调节恒温箱的温度为60℃，用注射器将0.85ml固定溶液(多巴胺浓度为1.5mg/ml)以0.5μl/min的流速在60℃下注射到硅胶管内，再用注射器注入10mmol的tris
‑
hcl缓冲液(流速为100μl/min、流量为1ml)冲洗后，用多巴胺成功地修饰了氨基化硅胶，得到具有多巴胺涂层的硅胶管；
69.s3、用注射器将2.41ml浓度为0.5mg/ml的单宁酶
‑
水溶液以1.5μl/min的流速注射到具有多巴胺涂层的硅胶管中，并在温度为30℃的恒温箱内保持8h以固定单宁酶，再用注射器将500μl浓度为0.1mol/l的柠檬酸钠溶液以10μl/min的流速输入硅胶管内进行冲洗，得到含有固定化单宁酶的硅胶管；
70.s4、用注射器将300μl石榴皮的乙醇提取物，以流速为15μl/min注入含有固定化单宁酶的硅胶管，在温度为55℃的恒温箱内反应20min，反应产物用产物收集器收集，得到含有鞣花酸的反应液。
71.对比例1
72.按照实施例3的方法制备含有鞣花酸的反应液，不同的是，步骤s2中，利用浓度为1.5mg/ml的戊二醛溶液作为固定溶液。
73.对比例2
74.利用1mg常规的游离单宁酶催化300μl石榴皮的乙醇提取物进行降解反应，得到含有鞣花酸的反应液。
75.测试例1
76.以牛血清蛋白作为对照，将单宁酶替换成牛血清蛋白(浓度为1mg/ml)，重复上述实施例1中的步骤s1
‑
步骤s3，制得含有固定化牛血清蛋白的硅胶管；通过下述公式计算得到实施例1
‑
实施例6和对比例1中的步骤s3获得的含有固定化单宁酶的硅胶管的蛋白负载量和蛋白装载效率，结果见表1。
77.其中，蛋白浓度(单宁酶或者牛血清蛋白的浓度)通过bca蛋白定量试剂盒(来自源叶生物)测得，分别以0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/ml的蛋白浓度作出蛋白浓度与吸光度的标准曲线，并由此计算出相应的硅胶管上的蛋白浓度。
78.蛋白负载量(μg/cm2)＝(c0v
i
‑
c1v
w
)/a
r
，
79.蛋白装载效率(％)＝(c0v
i
‑
c1v
w
)/c0v
i
×
100％，
80.c0为初始蛋白浓度(μg/μl)，v
i
为初始蛋白体积(μl)，c1为冲洗出蛋白浓度(μg/μl)，vw为初始蛋白体积(μl)，ar：反应器表面积(cm2)。
81.表1
82.编号蛋白负载量(μg/cm2)蛋白装载效率(％)实施例13095实施例22692实施例32787实施例41976实施例51875实施例61777对比例11369
83.测试例2
84.取实施例1
‑
实施例6和对比例1
‑
对比例2中得到的含有鞣花酸的反应液，测定其鞣花酸的含量及转化率，结果见表2。
85.表2
86.编号鞣花酸的含量(μg/ml)鞣花酸转化率(％)实施例15792实施例25995实施例35189实施例42773实施例53252实施例62850对比例11642对比例22446
87.通过表1和表2的结果可以看出，实施例1
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实施例6采用本发明提供的连续生产鞣花酸的方法，与对比例1相比，对单宁酶的固定化效果更优，蛋白负载量和蛋白装载效率更高；与对比例1和对比例2相比，实施例1
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实施例6中的单宁酶经固定化后可显著提高其催化活性的稳定性和重复利用度，能够实现高效催化单宁降解生成鞣花酸。
88.测试例3
89.利用实施例1的步骤s3中的含有固定化单宁酶的硅胶管和游离的单宁酶，分别以石榴皮的乙醇提取物为底物，重复10次催化降解反应，测试固定化单宁酶和游离单宁酶的重复使用性能，结果见图2。在进行10次循环使用后，实施例1中获得的含有固定化单宁酶的硅胶管仍然保持着较高的酶相对活性，酶活性大于70％，相比游离酶具有很大的提升。
90.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。