一类刺激响应型多肽及其制备方法和用途

1.本发明具体涉及多肽，特指一类刺激响应型多肽及其制备方法和用途，所述的多肽能够用于制备抗肿瘤的药物。


背景技术：

2.近年来发现，肿瘤细胞需要利用大量胆固醇来维持其快速增殖的能力，而高密度脂蛋白（hdl）作为输送工具，为肿瘤细胞提供了大部分的胆固醇。在这一过程中，细胞表面的b族i型清道夫（sr
‑
bi）受体在大部分肿瘤细胞上都过表达，作为hdl的受体引导hdl向肿瘤细胞转运胆固醇。hdl主要通过其表面的载脂蛋白a
‑
i（apoa
‑
i）与sr
‑
bi受体结合来调控胆固醇的代谢。现对apoa
‑
i蛋白进行了广泛的研究，已开发出一系列apoa
‑
i模拟肽，其中模拟肽4f具有与apoa
‑
i蛋白相似的生物学功能，可与sr
‑
bi受体结合，且已被证实具有抗肿瘤作用。但sr
‑
bi受体虽然在肿瘤细胞表面高表达，但其作为胆固醇代谢机制的一部分，在正常的肝脏、乳腺和前列腺部位的表达量也较高，如果利用已报道的apoa
‑
i模拟肽长时间给药就有可能会造成肝脏等器官的损伤。所以提高apoa
‑
i模拟肽的生物利用度和肿瘤靶向能力，避免全身毒性作用显得尤为重要。
3.apoa
‑
i蛋白包含243个氨基酸残基，主要由10个两亲性α螺旋构成，属于a型结构模体（class a structural motif）。这类模体结构将带正电氨基酸分布在亲水/疏水界面，而带负电氨基酸则集中于亲水区的中心，疏水性氨基酸对α螺旋结构稳定至关重要。研究表明a型两亲性α螺旋模体与sr
‑
bi具有高度亲和性，可引导hdl与 sr
‑
bi的识别以及胆固醇酯的入胞转运。大量的实验结果表明：apoa
‑
i模拟肽没有特定序列的要求，只要具有a型两亲性α螺旋二级结构，就具有潜在的apoa
‑
i蛋白的生物活性。
4.因此，本发明响应肿瘤微环境低ph、高活性氧（ros）的特点，设计了一系列具有构象翻转能力的刺激响应型模拟肽以实现靶向抗肿瘤作用。


技术实现要素：

5.本发明公开一类刺激响应型靶向抗肿瘤多肽的设计与在抗肿瘤方面的应用。
6.本发明提供的刺激响应型靶向抗肿瘤多肽中含有特殊氨基酸衍生物b，氨基酸衍生物b缩写为xaa，分子式为c
17
h
24
no4sf2b，结构如下所示，因氨基酸残基的侧链长度与螺旋倾向性呈现正相关性，故本发明在氨基酸衍生物b的c
α
和卤代苯硼酸频哪醇酯基团之间设置有多个连接原子（c
‑
s
‑
c
n
‑
c, n=1,2），此外卤代苯硼酸频哪醇酯基团中的卤素原子包括氟、氯、溴或碘。
lys glu xaa phe；或seq.id.no.5：asp trp xaa lys ala phe xaa asp lys val xaa glu lys xaa lys glu xaa phe；其中，seq.id.no.1
‑
5中的xaa代表所述的特殊氨基酸衍生物b。
9.本发明采用固相合成的方法合成初始多肽（初始多肽的序列分别为将上述刺激响应型多肽序列中的氨基酸衍生物b替换为半胱氨酸），随后利用半胱氨酸的巯基与2
‑
(3,5
‑
二氟
‑4‑
乙烯基苯基)
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼烷发生巯基
‑
烯烃点击化学反应，合成氨基酸衍生物b，最终得到seq.id.no.1、seq.id.no.2、seq.id.no.3、seq.id.no.4和seq.id.no.5所示的目标多肽。
10.本发明提供了一类靶向抗肿瘤多肽可以响应肿瘤微环境低ph、高ros的特点，实现在不同环境下的变构行为，以达到靶向抗肿瘤的目的。本发明所述肿瘤包括但不限于乳腺癌。
11.本发明的优点在于：（1）本发明提供的一类刺激响应型多肽的细胞毒性作用具有选择性。体外细胞毒性实验证明，针对人乳腺癌细胞mcf
‑
7和小鼠乳腺癌细胞4t1，本发明的多肽在弱酸性培养基中具有较强的抑制细胞增殖的作用，而在正常培养基中没有细胞杀伤作用。
12.（2）动物体内抗肿瘤实验证明，本发明的多肽具有较强的抗肿瘤作用；（3）小动物活体成像实验证明，本发明的多肽能够显著富集到肿瘤组织部位，具有靶向治疗的作用。
附图说明
13.图1为氨基酸衍生物b侧链基团2
‑
（3,5
‑
二氟
‑4‑
乙烯基苯基）
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼烷的核磁氢谱图。
14.图2为刺激响应型多肽的基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱图。
15.图3为刺激响应型多肽序列中氨基酸衍生物b的侧链基团在不同环境下的变构行为。
16.图4为刺激响应型多肽序列中氨基酸衍生物b在不同时间点的响应性荧光检测结果。
17.图5为刺激响应型多肽序列中氨基酸衍生物b的响应性高效液相色谱检测结果，其中a为原始化合物的液相检测结果，b为模拟肿瘤微环境下的液相检测结果。
18.图6为seq.id.no.5所示模拟肽的apoa
‑
i活性模拟实验结果。
19.图7为seq.id.no.5所示模拟肽对人源乳腺癌细胞mcf
‑
7和鼠源乳腺癌细胞4t1的细胞毒性结果图。
20.图8为seq.id.no.5所示模拟肽对4t1
‑
荷瘤小鼠的肿瘤抑制效果图。以空白对照为参考，利用统计学分析方法考察5
‑
b的体内抗肿瘤效果。
21.图9为seq.id.no.5所示模拟肽对4t1
‑
荷瘤小鼠体重影响图。
22.图10为seq.id.no.5所示模拟肽和阳性对照4f的小动物活体成像图，包括小鼠及其肿瘤组织和心肝脾肺肾脏器。
具体实施方式
23.以下结合附图通过具体的实施例对本发明作进一步描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不是对本发明保护范围的限制。
24.实施例1刺激响应型多肽的合成实验第一步：在n2下于0℃向甲基三苯基溴化膦（6.92g,19.4mmol）的thf（20 ml）溶液中添加双（三甲基硅基）氨基钠（17.8 ml, 1 mol/l in thf），搅拌30 min后向其中加入4
‑
溴
‑
2,6
‑
二氟苯甲醛（3.0 g, 13.6 mmol）, 然后在0℃下搅拌3h，反应液用水（20 ml）淬灭，etoac（20 ml*3）萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶色谱纯化得目标产物4
‑
溴
‑
2,6
‑
二氟苯乙烯，收率为61%。
25.第二步：称取4
‑
溴
‑
2,6
‑
二氟苯乙烯（500 mg, 2.6 mmol）、醋酸钾（764 mg, 7.8 mmol）、4,4,4’,5,5,5’,5
’‑
八甲基
‑
2,2
’‑
bi(1,3,2
‑
二氧杂硼烷)（1.76 g, 7.8 mmol）、氯化钯（18 mg, 0.26 mmol）置于50 ml圆底烧瓶中，加入13 ml dmso，80℃n2保护反应16h，反应液用水（20 ml）淬灭，etoac（20 ml*3）萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶色谱纯化，石油醚洗脱，得到氨基酸衍生物b的侧链基团2
‑
（3,5
‑
二氟
‑4‑
乙烯基苯基）
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼烷为白色固体（图1），收率为18%。
26.第三步：采用固相合成的方法合成初始多肽序列（刺激响应型多肽序列中氨基酸衍生物b的取代位点取代为半胱氨酸），随后利用半胱氨酸的巯基与2
‑
(3,5
‑
二氟
‑4‑
乙烯基苯基)
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼烷发生巯基
‑
烯烃点击化学反应，合成氨基酸衍生物b,最终得到序列seq.id.no.1、seq.id.no.2、seq.id.no.3、seq.id.no.4和seq.id.no.5所示的目标多肽（图2）。
27.实施例2氨基酸衍生物b的刺激响应性实验取刺激响应型多肽序列中氨基酸衍生物b的侧链基团2
‑
(3,5
‑
二氟
‑4‑
乙烯基苯基)
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼烷10mg溶于10 ml四氢呋喃中，配制成1 mg/ml的待测溶液。利用紫外分光光度计测定其激发波长，利用荧光分光光度计测定其发射波长，随后调节待测溶液的ph至6.5，并加入质量分数为30%的过氧化氢溶液配制成摩尔浓度为10 nm的反应液，分别于5 min、10 min、20 min、30 min、60 min测定溶液的荧光值。
28.取氨基酸衍生物b的侧链基团2
‑
(3,5
‑
二氟
‑4‑
乙烯基苯基)
‑
4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼烷10mg溶于10 ml四氢呋喃中，配制成1 mg/ml的待测溶液。取20μl按如下检测条件（仪器：安捷伦1260；色谱柱：unitary c18 柱（4.6 mm
×
250 mm，5μm）；检测波长：280 nm；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；流动相：80%乙腈
‑
20%超纯水）进液相，确定其出峰时间。调节待测溶液的ph至6.5，并加入质量分数为30%的过氧化氢溶液配制成摩尔浓度为10 nm的反应液，反应30 min后取20 μl按相同的检测条件进液相，检测其出峰时间。
29.响应性荧光检测结果（图4）显示，化合物的荧光值会迅速发生变化，在5min内基本上结构就从苯硼酸转变成苯酚结构，说明氨基酸衍生物侧链基团对ph为6.5，质量分数为30%的过氧化氢溶液的敏感性较强，会产生较为迅速的变化行为。液相检测结果（图5）显示，原始化合物的保留时间为22.967 min，而在ph为6.5，含有质量分数为30%的过氧化氢溶液的反应液中化合物的保留时间为3.184 min和27.099 min。依据经验3.184 min为h2o2的出峰时间，27.099 min出现一个新峰，且峰面积与原始化合物基本一致，由此可以看出化合物结构已发生变化，对模拟的肿瘤微环境产生了积极的响应。
30.实施例3以seq.id.no.5所示模拟肽为例进行apoa
‑
i活性模拟实验精密称取10 mg罗丹明b溶于10ml超纯水中，配制成1 mg/ml的母液。利用紫外分光光度计测定其激发波长，利用荧光分光光度计测定其发射波长。随后将母液依次配制成浓度为1、2、3、4、5 μg/ml的待测溶液，利用荧光分光光度计测定罗丹明b浓度梯度的荧光值，绘制得到罗丹明b荧光标准曲线。
31.精密称取1 mg罗丹明b、3.75mg胆固醇和30mg 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（dmpc）。将dmpc和胆固醇充分溶于5 ml氯仿中，随后将氯仿蒸干，瓶底会出现透明脂膜。分别配制两种缓冲液，包括：ph 为6.5，h2o2摩尔浓度为10 nm的罗丹明b的pbs缓冲液5 ml；ph 7.4的罗丹明b的pbs缓冲液5 ml。将两种缓冲液分别加入2种脂膜中，不断振摇即可生成2种粒径约为1～5 μm的脂质体。随后利用探头式超声仪超声5 min，得到100 nm左右的脂质体，透析12小时除去未包封罗丹明b，脂质体混悬液于4℃下保存。取1 mg/ml的模拟肽5
‑
b 1 ml分别加入2种脂质体混悬液中，锡箔纸避光，室温搅拌，分别于2h、4h、6h、12h、24h测定混合溶剂的荧光强度，计算荧光物质罗丹明b的释放比例。
32.apoa
‑
i活性模拟实验结果（图6）表明，正常环境下脂质体包裹的罗丹明b在24h内累计释放在13.5%左右；但是在肿瘤微环境下，罗丹明b在24h累计释放比例高达83%，呈现出显著差别。说明本发明所构建的模拟肽对环境的变化会产生较为敏感的响应，并且具有apoa
‑
i蛋白的活性，对肿瘤微环境下脂质体模拟的肿瘤细胞膜有较强的破坏作用。
33.实施例4 以seq.id.no.5所示模拟肽为例进行体外抗肿瘤活性实验取人源乳腺癌mcf
‑
7细胞和鼠源乳腺癌4t1细胞，配制相应的弱酸性dmem高糖培养基和弱酸性1640培养基，检测模拟肽seq.id.no.5在正常培养基和弱酸性培养基下的肿瘤细胞抑制作用。具体实验方案如下：（1）酸性培养基配制：取674mg的dmem高糖培养基粉末于重蒸水中溶解，加5ml的mes缓冲液，定容到50ml，测定其ph为6.5，过0.22μm的无菌微孔滤膜后，于培养箱中空培，48h后再次测定ph仍为6.5，再次过膜后得到酸性dmem不完全培养基于4℃保存。酸性1640不完全培养基配制方法同上。
34.（2）种板：从培养箱中取出mcf
‑
7细胞和4t1细胞，观察形态确定长满后于超净台中弃去培养基，pbs清洗2遍，加胰酶消化2分钟，随后加完全培养基终止消化，混悬液1500rpm离心5min，弃去上清，在两种细胞中分别加入相应的完全培养基（mcf
‑
7：含有体积分数10％的胎牛血清和体积分数为1％的青霉素
‑
链霉素双抗的dmem培养基；4t1：含有体积分数15％的胎牛血清和体积分数为1％的青霉素
‑
链霉素双抗的rpmi1640培养基），吹打均匀，接种于96孔板中，每孔100μl。
35.（3）给药：将多肽seq.id.no.5过0.45μm的无菌微孔滤膜后，取1 ml于1.5 ml的无菌离心管中，分别用相应的培养基稀释成20 μg/ml、15 μg/ml、10 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml。mcf
‑
7细胞培养24h后弃去培养液。向细胞中添加用酸性dmem不完全培养基和正常dmem高糖培养基稀释的一系列药物，每孔100μl，重复3个复孔。向4t1细胞中添加用酸性1640不完全培养基和prmi
‑
1640培养基稀释的一系列药物，每孔100μl，重复3个复孔。给药后于培养箱培养48h。
36.（4）细胞增殖活性检测：孵育48h后，吸出孔内原有培养基，每孔加入100
µ
l体积分数为 5% 的cck
‑
8试剂，转移至细胞培养箱中孵育1
‑
2h。然后使用酶标仪在450nm处检测各
孔的od值。计算多肽seq.id.no.5在不同培养基环境下对mcf
‑
7、4t1细胞的ic50值。
37.计算结果显示，多肽seq.id.no.5在酸性培养基环境下对mcf
‑
7、4t1细胞的ic
50
值分别为2.446 μg/ml、17.06 μg/ml（图7），均具有一定的抗肿瘤活性；在正常培养基环境下对两种细胞系均没有杀伤作用。证明本发明所设计的模拟肽具有明显的刺激响应性，且具有较强的抑制细胞增殖的作用。
38.实施例5 以seq.id.no.5所示模拟肽为例进行体内抗肿瘤活性实验及活体成像实验通过建立4t1
‑
荷瘤小鼠模型来考察多肽seq.id.no.5的体内抗肿瘤活性，方法与结果如下：（1）材料与分组：6
‑
8周的雌性balb/c小鼠40只订购自常州卡文斯实验动物有限公司。将模拟肽seq.id.no.5溶解到含有体积分数为10% 的dmso的pbs溶液，经计算浓度最高可达15 mg/kg，但由于模拟肽seq.id.no.5反应后出现沉淀，过膜后用改良型bca法蛋白质浓度测定试剂盒检测其浓度后，动物给药的剂量最高可达到6 mg/kg。将小鼠随机分为8组，每组5只：seq.id.no.5（2 mg/kg）、seq.id.no.5（4 mg/kg）、seq.id.no.5（6 mg/kg）、4f（5 mg/kg）、4f（10 mg/kg）、4f（15 mg/kg）、5
‑
fu（25 mg/kg）、空白对照（生理盐水）。
39.（2）4t1
‑
荷瘤小鼠模型构建：收集培养细胞悬浮于pbs中制备成1
×
107/ml细胞悬液，在小鼠背部接种乳腺癌细胞4t1，每只0.2 ml。
40.（3）给药：待肿瘤生长到体积大概100 mm3时开始给药，每只每次尾静脉注射0.2 ml，隔天给药，给药2周。给药时测量肿瘤体积和小鼠体重。
41.（4）肿瘤解剖：给药结束第二天使用二氧化碳窒息法处死小鼠，然后使用手术器械将给药组和模型组的小鼠解剖，完整剥离出肿瘤组织。
42.体内抗肿瘤活性实验结果表明seq.id.no.5高剂量组的肿瘤体积最小，且与生理盐水组存在显著性差异（p<0.0001）。seq.id.no.5高剂量组的平均肿瘤体积小于4f(15mg/kg)组和5
‑
fu(25 mg/kg)组，且远小于4f(5 mg/kg)组（p<0.0001），证明模拟肽seq.id.no.5具有比阳性对照4f和传统抗肿瘤药物5
‑
fu更强的体内抗肿瘤活性（图8）。此外，seq.id.no.5高剂量组和4f高剂量组均对小鼠体重无显著影响（图9），安全性较高。
43.通过活体成像实验来考察多肽seq.id.no.5的肿瘤靶向性，方法与结果如下：（1）多肽荧光标记：低温保存的sulfo
‑
cy7 nhs置于室温回温30 min，往1 mg粉末内加入100 μl高品质无水dmso充分溶解。取0.35 mg多肽seq.id.no.5溶于942.5 μl pbs溶液中，加入50 μl sulfo
‑
cy7 nhs，再加入7.5 μl三乙胺，常温避光搅拌反应混合物过夜，用稀盐酸调节反应液ph为7.4，即得浓度为0.35 mg/ml的sulfo
‑
cy7 nhs标记seq.id.no.5，cy7 nhs标记4f合成方法同上。
44.（2）活体成像实验：取2只4t1荷瘤小鼠，分别尾静脉给药0.2 ml 荧光标记的seq.id.no.5和4f，于12h和24h活体成像（ex/em:747/774nm）监测多肽在小鼠体内的分布情况。随后二氧化碳法处死小鼠，完整剥离肿瘤组织、心、肝、脾、肺、肾等脏器，活体成像监测多肽在肿瘤组织和小鼠脏器中的分布情况。
45.活体成像实验结果表明多肽seq.id.no.5在24h时基本蓄积于肿瘤部位，在肝肾的代谢器官也有少量蓄积，但是其他器官都没有蓄积；而4f组药物在心肝脾肺肾及肿瘤部位均有蓄积（图10）。证实本发明设计的刺激响应型模拟肽5
‑
b具有良好的肿瘤靶向能力。
46.以上数据通过graphpad软件oneway anova检验分析，显著性水平定义为：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。