表达猪蓝耳病毒GP5蛋白的重组杆状病毒的构建方法与流程

表达猪蓝耳病毒gp5蛋白的重组杆状病毒的构建方法
技术领域
1.本发明涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种表达猪蓝耳病毒gp5蛋白的重组杆状病毒的构建方法。


背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,prrs），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv )引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征的一种高度接触性传染病。目前该病在我国广泛流行，以母猪流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎，以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征，其发病率高、病死率高、治愈率低，给我国的养猪业造成严重的经济损失。
3.prrsv为有囊膜的单股正链rna病毒，基因组不分节段，全长约15kb，呈球形或卵圆形，直径为45-65nm,呈20面体对称。prrsv基因组含有9个开放阅读框，分别命名为orf1a、orf1b、orf2a、orf2b、orf3-orf7。其中，orf2a、orf2b、orf3-orf7编码结构蛋白，编码的相应结构蛋白依次为gp2、e、gp3、gp4、gp5、基质蛋白（m）和核衣壳蛋白（n）,gp5、m和n是主要的结构蛋白。gp5蛋白是重要的囊膜糖蛋白，分子量为24-26kd，含有4个糖基化位点。该蛋白含有一段较大的内部疏水结构域，与膜的锚定作用相关，同时，gp5蛋白是不同毒株间变异最大的蛋白，既有线性表位，又有构象表位，能诱导产生中和抗体，是prrsv主要的免疫原性蛋白。
4.目前，prrs的防控主要以免疫预防为主，在我国主要以疫苗免疫为主，常用的疫苗有弱毒活疫苗和灭活疫苗两大类。弱毒活疫苗免疫力较强，产生抗体快，用量少，成本低，但存在散毒及毒力返强的风险。灭活疫苗具有安全性好，诱导产生抗体时间长，但注射剂量高，成本高。因此亚单位疫苗的研究成为焦点。由于gp5蛋白含有多个糖基化位点，采用原核表达时容易导致蛋白活性低。杆状病毒表达为真核表达系统，可对目的蛋白进行加工修饰，更好的保持目的蛋白的生物活性，因此本研究采用杆状病毒表达系统制备gp5蛋白。


技术实现要素：

5.本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种路径简洁、免疫反应性好的表达猪蓝耳病毒gp5蛋白的重组杆状病毒的构建方法。
6.本发明是通过如下技术方案实现的：一种表达猪蓝耳病毒gp5蛋白的重组杆状病毒的构建方法，包括如下步骤：（1）gp5基因的扩增及重组供体质粒的构建：根据prrsv ch-1a株的基因序列，运用生物信息学软件设计引物，扩增获得orf5目的基因；使用通用引物鉴定重组杆粒；以prrsv ch-1a株基因组为模板，扩增gp5基因，回收纯化目的条带；将目的片段与转移载体pfastbac
tm
dual分别进行 bamh i和sal i双酶切，回收纯化后进行连接，化学法转化dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组供体质粒pfbd-gp5，并进行酶切测序鉴定；
（2）gp5重组穿梭质粒的构建与鉴定：将供体质粒pfbd-gp5转化至含有acbacmid和helper质粒的dh10bac感受态细胞，平板上培养后筛选，选取白色单菌落；抽提dna，以m13通用引物进行pcr检测，筛选阳性克隆杆粒，命名为rbacmid gp5，并提取rbacmid-gp5重组杆粒，用于细胞转染；（3）gp5重组杆状病毒的获得与鉴定：采用脂质体转染试剂盒，将rbacmid-gp5转染生长状态良好的sf9昆虫细胞，培养待出现细胞病变后，收集上清液作为p0代重组病毒；将细胞上清液在sf9昆虫细胞传3代，收集第3代细胞上清液，提取病毒dna为模板，以扩增gp5基因的引物f、r进行pcr检测，筛选获得阳性重组病毒命名为rbac-gp5；（4）gp5蛋白的western-blot鉴定：将重组病毒rbac-gp5接种sf9昆虫细胞，感染后离心收集细胞沉淀；用细胞裂解液pmsf裂解细胞并做超声处理，离心收集上清液，用于western-blot分析；（5）gp5蛋白的免疫荧光鉴定：将重组病毒rbac-gp5接种于sf9昆虫细胞，感染后用pbs洗涤，用甲醇固定后pbs洗涤；在使用nbs封闭，以pbs稀释prrsv阳性血清为一抗，孵育后用pbst洗涤；以nbs稀释anti-swine igg(h+l)为二抗，孵育后用pbst洗涤，置于荧光倒置显微镜下观察结果，处理sf9细胞为阴性对照。
7.本发明根据genbank蓝耳病毒ch-1a株orf5基因序列，设计合成引物，扩增orf5基因片段，以pfastbac
tm
dual质粒为骨架，将orf5基因插入该质粒，获得一种杆状病毒转移载体pfbd-gp5，转化至dh10bac感受态细胞，获得重组杆粒rbacmidgp5；转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒。经鉴定，重组杆状病毒可在昆虫细胞中高效表达gp5蛋白，且该蛋白具有良好生物学活性和免疫原性。
8.本发明上述构建方法还包括步骤（6）gp5蛋白免疫原性鉴定：将重组病毒rbac-gp5接种sf9昆虫细胞，感染后离心收集细胞沉淀；用细胞裂解液pmsf裂解细胞并做超声处理，离心收集蛋白上清液；蛋白上清液经柱层析工艺纯化，与水包油包水佐剂混合制备疫苗，免疫14-21日龄仔猪，分别在免后14d、28d、56d采血，检测gp5抗体。
9.进一步优选的，步骤（1）中，上游引物f:5
’‑
cggatccatgttggggaaatgcttgacc-3’；下游引物r：5
’‑
gcgtcgacctagagacgaccccattgtt-3’；通用引物m13 f：5
’‑
cccagtcacgacgttgtaaaacg-3’；m13 r：5
’‑
agcggataacaatttcacacagg-3’。
10.进一步优选的，步骤（2）中，在含有卡那霉素50μg/ml、庆大霉素7μg/ml、四环素10μg/ml、x-gal 100μg/ml和iptg 40μg/ml的lb平板上培养48h，两轮蓝白斑筛选，选取白色单菌落。
11.进一步优选的，步骤（3）中，转染的昆虫细胞于28℃恒温培养箱中培养36-72h，待出现细胞病变后，收集上清液作为p0代重组病毒。
12.进一步优选的，步骤（4）中，sf9昆虫细胞感染72h后，离心收集细胞沉淀，用细胞裂解液pmsf裂解细胞并做超声处理，12000r/min离心10min收集上清，用于western-blot分
析；用抗体稀释液按1:200稀释prrsv阳性血清为一抗，以抗体稀释液按1:5000稀释hrp标记的抗猪igg作为二抗，正常sf9昆虫细胞蛋白样品作为阴性对照。
13.进一步优选的，步骤（5）中，sf9昆虫细胞感染12h后，用pbs洗3次；4℃预冷的甲醇2-8℃固定30min后pbs洗3次；使用5%nbs于37℃封闭1h；用pbs以1:200稀释prrsv阳性血清为一抗，37℃孵育1h，用pbst洗涤5次；用5%nbs以1:100稀释anti-swine igg(h+l)为二抗，37℃孵育1h，用pbst洗涤5次，置于荧光倒置显微镜下观察结果。
14.进一步优选的，步骤（6）中，sf9昆虫细胞感染72h后，离心收集细胞沉淀；超声处理后12000r/min离心10 min收集蛋白上清液；疫苗免疫14-21日龄、蓝耳抗原抗体双阴的仔猪，采血后，用海博莱蓝耳elisa抗体试剂盒检测gp5抗体。
15.本发明选择了真核表达系统-昆虫杆状病毒表达系统，可以对蛋白进行翻译后加工修饰，少去了原核系统的变形、复性等复杂过程，展示目的蛋白的天然构象，表达的蛋白具有良好的免疫反应性，这些研究将为进一步研发基于prrsv vlps的疫苗奠定了基础和准备材料。
附图说明
16.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
17.图1为本发明构建方法的流程示意图；图2为猪蓝耳病毒ch-1a株gp5基因序列扩增图；图中：m表示dl5000的dna分子质量标准；1-4表示gp5基因的扩增；图3为实施例提供的重组穿梭质粒的pcr鉴定图；图中，m表示dl-5000的dna分子质量标准；1-10表示重组穿梭质粒的pc；图4为实施例提供的重组供体质粒的酶切鉴定图；图中：m表示dl5000的dna分子质量标准；1表示pfbd-gp5质粒；2表示pfbd-gp5质粒的双酶切产物；图5为重组gp5穿梭质粒的蓝白斑筛选图；图6为重组感染病毒感染sf9细胞后cpe；图中，a表示rbac-gp5感染sf9细胞；b表示正常sf9细胞；图7为重组杆状病毒表达gp5蛋白的sds-page鉴定图；图中，m：蛋白marker，18-120kd；1：h5细胞对照；2：gp5蛋白；图8为杆状病毒表达gp5蛋白的western-bolt检测结果图；图中，m：蛋白marker，10-120kd；1：bsa对照;2：gp5蛋白；图9为重组杆状病毒rbac-gp5感染sf9细胞免疫荧光图；图10为gp5蛋白免疫仔猪后elisa抗体结果图。
具体实施方式
18.下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
19.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种表达猪蓝耳病毒gp5蛋白的重组杆状病毒及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
20.如附图1所示，本发明实施例提供的杆状病毒病表达猪蓝耳病毒gp5蛋白的方法及其免疫原性鉴定方法包括以下步骤：（1）基因的扩增及重组供体质粒的构建；（2）gp5重组穿梭质粒的构建与鉴定；（3）重组杆状病毒的获得与鉴定；（4）western-blot鉴定gp5蛋白的表达；（5）gp5蛋白的间接免疫荧光鉴定；（6）gp5蛋白免疫原性鉴定结果。
21.1．材料与方法1.1 材料pfastbac dual载体、prrsv ch-1a毒株、猪蓝耳病毒阳性血清和sf9昆虫细胞由本实验室保存，限制性内切酶购自takara公司，感受态大肠杆菌dh5α、dh10bac购自上海唯地生物公司，昆虫细胞培养基sf-900
tm iii sfm(1
×
)及转染试剂盒cellfectin@ii reagent均购自gibco公司，hrp标记的猪二抗，anti-swine igg(h+l)购自sigma公司。
22.1.2 gp5基因的扩增及重组供体质粒的构建根据prrsv ch-1a株序列，运用生物信息学软件设计引物。
23.目的基因扩增引物如下，上游引物f:5
’‑
cggatccatgttggggaaatgcttgacc-3’，下游引物r：5
’‑
gcgtcgacctagagacgaccccattgtt-3’；以prrsv ch-1a株核算为模板，扩增得到gp6基因，回收纯化目的条带。将纯化后目的片段和pfastbac-dual载体分别进行bamh i、sal i双酶切，回收纯化后连接，化学法转dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组供体质粒pfbd-gp5，并进行酶切、测序鉴定。
24.1.3 gp5重组穿梭质粒的构建与鉴定将供体质粒pfbd-gp5转化至含有acbacmid和helper质粒的dh10bac感受态细胞，在含有卡那霉素(50μg/ml)，庆大霉素(7μg/ml)，四环素(10μg/ml)，x-gal(100μg/ml)和iptg(40μg/ml)的lb平板上培养48h，两轮蓝白斑筛选，选取白色单菌落。以m13通用引物（m13-f：cccagtcacgacgttgtaaaacg，m13-r：agcggataacaatttcacacagg；）进行pcr检测，筛选阳性克隆杆粒，命名为rbacmid-gp5，并提取rbacmid-gp5重组杆粒，用于细胞转染。
25.1.4重组杆状病毒的获得与鉴定参照脂质体转染试剂盒cellfectinii reagent的说明书，将rbacmid-gp5转染生长状态良好的sf9昆虫细胞，28℃恒温培养箱培养36-72h，待出现细胞病变后，收集上清作为p1代重组病毒。将细胞上清在sf9昆虫细胞盲传3代，收集第3代细胞上清，提取病毒dna为模板，以扩增gp5基因的引物p1、p2进行pcr检测，筛选获得阳性重组病毒命名为rbac-gp5。
26.1.5 western-blot鉴定gp5蛋白的表达将重组病毒rbac-gp5 p3代细胞毒接种sf9昆虫细胞，感染72h后，离心收集细胞沉淀。用细胞裂解液pmsf裂解细胞并做超声处理，12000r/min离心10 min收集上清，用于western-blot分析。用抗体稀释液按1:200稀释prrsv阳性血清为一抗，以抗体稀释液按1:5000稀释hrp标记的抗猪igg作为二抗，正常sf9昆虫细胞蛋白样品作为阴性对照。
27.1.6 gp5蛋白的间接免疫荧光鉴定
将重组病毒rbac-gp5 p3代细胞毒接种于生长状况良好的sf9昆虫细胞，感染12h后，用pbs洗3次；4℃预冷的甲醇2-8℃固定30min后pbs洗3次；使用5%nbs 37℃封闭1h；以pbs 1:200稀释prrsv阳性血清为一抗，37℃孵育1h，用pbst洗涤5次；5%nbs 1:100稀释anti-swine igg(h+l)为二抗，37℃孵育1h，用pbst洗涤5次，置于荧光倒置显微镜下观察结果，处理sf9细胞为阴性对照。
28.1.7动物免疫试验14-21日龄仔猪（蓝耳抗体抗原双阴性）15头，随机分为3组，其中组1注射rbac-gp5制备的疫苗，组2注射灭活的野生型杆状病毒感染的sf9昆虫细胞的上清液，组3注射pbs溶液。免前及免后14d、28d和56d采血分离血清，测定蓝耳gp5 elisa抗体。
29.2．结果2.1 gp5基因的扩增及重组供体质粒pfbd-gp5的鉴定以prrsv ch-1a基因组为模板，f、r分别为引物扩增gp5基因，获得约为603bp的目的条带(见附图2)，与预计大小相符。筛选获得重组供体质粒pfbd-gp5，进行bamh i和salⅰ双酶切验证，结果(见附图3)显示，双酶切后有2条特异条带，其中一条为gp5基因约为603bp，另一条为载体片段约为6000 bp，均与预计大小相符。进一步对pfbd-gp5重组质粒进行测序验证，结果表明插入序列没有碱基突变，完全正确。
30.2.2重组穿梭质粒及杆状病毒的获得将pfbd-gp5重组供体质粒转化dh10bac感受态细胞，筛选白色单菌落纯化（见附图4）。提取重组杆粒，经m13引物pcr检测可以扩增到一约3100bp的目的条带，结果见附图5。将重组杆粒bacmid-gp5脂质体法转染sf9细胞昆虫细胞，28℃培养，第一代没有明显细胞病变，盲传到第3代培养72h后出现明显的细胞病变，主要表现为细胞变大变圆，边界透亮，细胞核明显，结果见附图6。
31.2.3重组蛋白表达的western-blot鉴定半干法对重组蛋白进行western-blot鉴定(见附图7、8)。检测结果显示，重组病毒感染的sf9昆虫细胞样品中，有一约22kda的特异条带，而正常细胞未出现该条带。表明prrsv的gp5基因在sf9昆虫细胞中成功表达，且表达产物具有一定的反应原性。
32.2.4重组蛋白表达的间接免疫荧光鉴定rbac-gp5杆状病毒感染sf9昆虫细胞，进行免疫荧光检测后，在荧光显微镜下观察结果显示，rbac-gp5感染的sf9细胞出现绿色荧光，而正常的sf9细胞未出现荧光，表明prrsv的gp5基因在sf9昆虫细胞中获得正确表达(见附图9)。
33.2.5 elisa抗体检测gp5蛋白免疫仔猪，检测血清中elisa抗体。结果显示，免前各组仔猪血清gp5抗体均为阴性，说明试验动物正常；免后14d，蛋白组抗体阳性率100%，28d达极值，56d略有下降，两个对照组仔猪抗体均为阴性，说明重组杆状病毒表达的gp5蛋白具有很好的免疫原性，结果如附图10所示。
34.prrsv疫苗分为弱毒活疫苗和灭活疫苗，且两种疫苗在prrs疫病的防控过程中起到关键作用。商品化弱毒疫苗品种繁多，常存在毒力返强或与野毒发生重组的问题；全病毒灭活疫苗，成分复杂，起效速度慢；因此研制高效、安全的新型prrsv疫苗对有效控制和彻底根除该病具有重要意义。vlps疫苗由病毒结构蛋白自组装形成，不含病毒核酸且可介导高
效的体液免疫和细胞免疫应答，目前被认为是安全有效的候选疫苗。本发明选择了真核表达系统-昆虫杆状病毒表达系统，可以对蛋白进行翻译后加工修饰，少了原核系统的变性，复性等复杂过程，展示目的蛋白的天然构象，表达的蛋白具有良好的免疫反应性，这些研究将为进一步研发基于prrsv vlps的疫苗奠定了基础和准备材料。
35.以上所述仅为本发明的优选实例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都将处于本发明的保护范围内。