一种胶原三肽产品及其制法和应用的制作方法

1.本发明涉及一种胶原三肽产品、一种胶原三肽产品的制备方法以及该胶原三肽产品在化妆品中的应用。


背景技术：

2.胶原蛋白是细胞外基质的重要组成物质，其含量为人体蛋白质的1/3左右，对维持机体的结构、功能起到了重要的作用。随着人年龄的增加，胶原蛋白流失。同时因为皮肤组织真皮细胞外机质中的胶原蛋白可逆转性低，更容易与葡萄糖等代谢分子发生非酶促反应生成糖化终末产物(advanced glycationend products,age)，如糖基化胶原等，对组织产生一系列不良影响。
3.胶原蛋白肽是将大分子胶原蛋白经酶解后制成的小分子肽类产品。据研究报道，胶原蛋白肽有提高皮肤水分、减少皱纹，抗衰老等作用。尤其是胶原三肽因其分子量小，极易为人体吸收和利用，因此具有非常好的延缓衰老的作用。胶原三肽中富含碱性氨基酸的胶原三肽具有抗糖化的作用，有利于维护组织的正常功能。目前市场上缺少富含碱性氨基酸的胶原三肽产品，胶原蛋白肽抗糖化效果差。


技术实现要素：

4.本发明为了填补市场空白，提供了一种胶原三肽产品，该胶原三肽产品含有丰富的碱性氨基酸。
5.因此，一方面，本发明提供了一种胶原三肽产品，其特征在于，该胶原三肽产品含有胶原三肽；其中，该胶原三肽含有至少一端为碱性氨基酸的三肽，该至少一端为碱性氨基酸的三肽的分子式包括gly-x-arg、gly-x-his和gly-x-lys，其中，x为氨基酸；以所述胶原三肽的总重量为基准，所述碱性氨基酸的含量不低于10％；优选地，所述碱性氨基酸的含量为12-20％。
6.另一方面，本发明提供了一种制备至少一端为碱性氨基酸的胶原三肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
7.1)向胶原蛋白中加水，调节胶原蛋白溶液的ph值为5-8，加入胶原蛋白重量0.5-5％的复合蛋白酶；在温度为45-60℃的条件下，酶解2-6小时，得到酶解液；其中，所述复合蛋白酶包括无花果蛋白酶和生姜蛋白酶；优选地，所述无花果蛋白酶和所述生姜蛋白酶的重量比为2-4:1；
8.2)调整酶解液ph值为7-8.5，加入胶原蛋白重量1-8％的发酵剂，在30-42℃发酵2-4小时，得到发酵液；所述发酵剂包含汉逊式德巴利酵母，戊糖片球菌和变异微球菌；优选地，所述汉逊式德巴利酵母、所述戊糖片球菌和所述变异微球菌的重量比为1：1.8-2.2:1.8-2.2；
9.3)将发酵液固液分离后，收集滤液。
10.第三方面，本发明提供了所述胶原三肽产品在化妆品和功能性食品中的应用。
65℃的条件下，优选为50-60℃的条件下酶解1-8小时，优选酶解2-6小时；得到酶解液；其中，所述复合蛋白酶包括无花果蛋白酶和生姜蛋白酶；优选地，所述无花果蛋白酶和所述生姜蛋白酶的重量比为2-4:1；
26.2)调整酶解液ph值为6.5-8.5，ph值优选为7-8，加入胶原蛋白重量1-8％的发酵剂，优选为2-7％的发酵剂，更优选为3-6％的发酵剂；在25-45℃下，优选为30-40℃下；发酵1-6小时，优选发酵2-5小时；得到发酵液；所述发酵剂包含汉逊式德巴利酵母，戊糖片球菌和变异微球菌；优选地，所述汉逊式德巴利酵母、所述戊糖片球菌和所述变异微球菌的重量比为1：1.5-2.5:1.5-2.5，优选为1：1.8-2.2:1.8-2.2；
27.3)将发酵液固液分离后，收集滤液。
28.在一种优选的实施方式中，在所述步骤2)中，所述发酵剂还包括清酒乳杆菌和/或肉糖葡萄球菌；优选地，所述汉逊式德巴利酵母，所述戊糖片球菌，所述清酒乳杆菌，所述变异微球菌和所述肉糖葡萄球菌的质量比为1:1.5-2.5：3.5-4.5:1.5-2.5：3.5-4.5，优选为1:1.8-2.2：3.8-4.2:1.8-2.2：3.8-4.2。
29.为了除去胶原蛋白中杂质的干扰，在一种优选的实施方式中，该方法还包括在所述步骤1)之前对胶原蛋白进行精制的步骤。
30.在一种优选的实施方式中，所述澄清采用加入澄清剂，搅拌后静置。
31.在一种优选的实施方式中，将澄清剂加入胶原蛋白溶液中，调整胶原蛋白溶液的ph值为2-7，优选胶原蛋白溶液的ph值为3-6；搅拌均匀后静置2-8小时，优选静置3-6小时，获得精制的胶原蛋白。
32.所述澄清剂没有特别的限制，但为了获得更好的去杂效果，在一种优选的实施方式中，所述澄清剂为鸡蛋清，酪蛋白酸钠，黄秋葵多糖；优选地，所述鸡蛋清，所述酪蛋白酸钠和所述黄秋葵多糖的重量比为1:1-4:2-5，优选为1:1-3:2.5-4。
33.为了获得更好的去杂效果，在一种优选的实施方式中，所述澄清剂的加入量为胶原蛋白重量的0.5-3％，优选为胶原蛋白重量的1-2％。
34.为了获得更好的去杂效果，在一种优选的实施方式中，所述澄清剂的ph值为3-5。
35.为了获得更好的去杂效果，在步骤3)中，均相膜过滤流速为2-6cm/s，操作电压为100-150v，电流为50-100a，收集流出时间在30分钟-60分钟之间的液体。
36.本发明还提供了一种从含有胶原的原料中制备富含碱性氨基酸的抗糖化胶原三肽的方法，该方法包括以下步骤：
37.步骤s1总蛋白粗提物的制备：称取原料，加入氢氧化钠溶液浸泡2-4小时，清洗2-3次，加入化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
38.步骤s2胶原蛋白粗提物的制备：将总蛋白粗提物调整ph值为2-4，加热至75-90℃，保温提胶3-8小时，制得胶原蛋白粗提物；
39.步骤s3胶原蛋白粗提物的精制：将澄清剂加入胶原蛋白粗提物中，调整ph值为2-7，搅拌均匀后静置2-8小时，制得胶原蛋白精制物；
40.步骤s4胶原蛋白肽的制备：将胶原蛋白精制物调节ph值为5-8，加入无花果提取物和生姜提取物酶解；在温度为45-60℃的条件下，酶解2-6小时，得到酶解液；再调整ph值为7-8.5，加入汉逊式德巴利酵母、戊糖片球菌、清酒乳杆菌、变异微球菌、肉糖葡萄球菌，在温度为30-40℃的条件下发酵2-4小时，得到酶解发酵液；
41.步骤s5富含碱性氨基酸胶原蛋白三肽的制备：将酶解发酵液解液过滤除去杂质。
42.优选地，步骤s1所述的原料为动物的皮、鳞或骨中的一种，氢氧化钠溶液的质量百分比为0.6-1％。
43.步骤s2制备的胶原蛋白粗提物在精制时，不容易分层，导致收率很低。为了提高收率，促进分层，优选地，步骤s3所述的澄清剂为鸡蛋清，酪蛋白酸钠，黄秋葵多糖，且鸡蛋清，酪蛋白酸钠，黄秋葵多糖的质量比1:1-4:2-5，混合并静置2-6小时，澄清剂的加入量为胶原蛋白粗提物质量的0.5-3％，澄清剂的ph值为3-5。
44.优选地，步骤s4所述的复合蛋白酶为无花果蛋白酶和生姜蛋白酶组合，两种酶的质量比为3-2:1，组合酶的加入量为胶原蛋白精制物质量的0.5％-5％，酶解ph值为6.5-8。加入的发酵剂为汉逊式德巴利酵母，戊糖片球菌，清酒乳杆菌，变异微球菌，肉糖葡萄球菌组合，重量比为1-0.5：1：1.5-2.5：1：1.5-2.5，组合发酵剂加入量为胶原蛋白精制物质量的1-8％，发酵ph值为7.0-8.5。
45.优选地，步骤5均相膜过滤流速为2-6cm/s，操作电压为100-150v，电流为50-100a，检测不同时间段流出液的胶原三肽含量。
46.本发明还提供了所述胶原三肽产品在化妆品和功能性食品中的应用。
47.这种化妆品有助于延缓皮肤衰老，尤其有利于糖尿病人皮肤护理。
48.本发明提供的所述胶原三肽产品可以用于功能性食品，尤其是用于酸性饮料，例如，在饮料中的胶原三肽溶液的浓度为10重量％，饮料ph值为2.5。
49.实施例1：一种富含碱性氨基酸的胶原三肽及其制备
50.步骤s1：称取罗非鱼鱼皮100g切成小块，加入2000ml质量分数0.8％的氢氧化钠溶液中浸泡4小时，清洗3次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
51.步骤s2：将总蛋白粗提物调整ph值为2.6，加热至90℃，保温提胶5小时，制得胶原蛋白粗提物；
52.步骤s3：称取1g鸡蛋蛋清，3g酪蛋白酸钠，4g黄秋葵多糖，加入胶原蛋白粗提物中，调整ph值为3，搅拌均匀后静置4小时，收集上清液，获得胶原蛋白精制物；
53.步骤s4：将胶原蛋白精制物调整ph值为7.5，温度为55℃，加入3g无花果蛋白酶和1g生姜蛋白酶，酶解时间为6小时，得到酶解液；将酶解液ph值调整到8.0，温度为37℃，加入汉逊式德巴利酵母1g，戊糖片球菌1g，清酒乳杆菌2g，变异微球菌1g，肉糖葡萄球菌组合2g，发酵4小时，得到发酵酶解液。
54.步骤s5：将发酵酶解液采用错峰过滤去除杂质后，采用1kd超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸，采用均相膜过滤流速为5cm/s，操作电压为120v，电流为70a，截流30-60min之间的液体，喷雾干燥后得到富含碱性氨基酸的胶原三肽产品。
55.实施例2：一种富含碱性氨基酸的胶原三肽及其制备
56.步骤s1：称取罗非鱼鱼皮100g切成小块，加入2000ml质量分数0.8％的氢氧化钠溶液中浸泡4小时，清洗3次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
57.步骤s2：将总蛋白粗提物调整ph值为2.6，加热至90℃，保温提胶5h，制得胶原蛋白粗提物；
58.步骤s3：称取0.5g鸡蛋蛋清，0.5g酪蛋白酸钠，2g黄秋葵多糖，加入胶原蛋白粗提物中，调整ph值为3，搅拌均匀后静置4h，收集上清液，获得胶原蛋白精制物；
59.步骤s4：将胶原蛋白精制物调整ph值为7.5，温度为55℃，加入3g无花果蛋白酶和1g生姜蛋白酶，酶解时间为6h，得到酶解液；将酶解液ph值调整到8.0，温度为37℃，加入汉逊式德巴利酵母0.1g，戊糖片球菌0.2g，清酒乳杆菌0.4g，变异微球菌0.2g，肉糖葡萄球菌组合0.4g，发酵4h，得到发酵酶解液。
60.步骤s5：将发酵酶解液采用错峰过滤去除杂质后，采用1kd超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸，采用均相膜过滤流速为6cm/s，操作电压为100v，电流为50a，截流30-60min之间的液体，喷雾干燥后得到富含碱性氨基酸的胶原三肽产品。
61.实施例3：一种富含碱性氨基酸的胶原三肽及其制备
62.一种胶原三肽及其制备方法，由如下步骤制成：
63.步骤s1：将10克市购胶原蛋白加入100克水中，搅拌均匀；
64.步骤s2：将胶原蛋白溶液调整ph值为7.5，温度为55℃，加入2g无花果蛋白酶和0.8g生姜蛋白酶，酶解时间为6h，得到酶解液；将酶解液ph值调整到8.0，温度为37℃，加入汉逊式德巴利酵母0.4g，戊糖片球菌0.6g，变异微球菌0.4g，，发酵4h，得到发酵酶解液。
65.步骤s5：将发酵酶解液采用错峰过滤去除杂质后，采用1kd超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸，采用均相膜过滤流速为4-6cm/s，操作电压为110v，电流为60a，截流30-60min之间的液体，喷雾干燥后得到胶原三肽产品。
66.实施例4：一种富含碱性氨基酸的胶原三肽及其制备
67.步骤s1：称取罗非鱼鱼皮100g切成小块，加入2000ml质量分数0.8％的氢氧化钠溶液中浸泡4小时，清洗3次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
68.步骤s2：将总蛋白粗提物调整ph值为2.6，加热至90℃，保温提胶5h，制得胶原蛋白粗提物；
69.步骤s3：称取1g鸡蛋蛋清，0.8g酪蛋白酸钠，1g黄秋葵多糖，加入胶原蛋白粗提物中，调整ph值为3，搅拌均匀后静置4h。粗提取液体不能形成分层，没有上清液。
70.胶原三肽产品物理特性检测
71.通过以下方法对实施例1-3制备的胶原三肽产品以及市购胶原蛋白肽，胶原三肽(北京盛美诺生物技术有限公司提供)检测其相应物理特性：
72.采用hplc-ms检测检测胶原三肽产品中三肽的含量，结果如表1所示；以及三肽的序列，结果如表2-4所示)。
73.hplc－ms检测方法：zorbaxsb-c18色谱柱(2.1mm
×
150mm，5μm)；流动相a-水(0.1％tfa)，b-乙腈(0.1％tfa)；梯度洗脱，0-7min，5％-20％b；7-50min，20％-32％b；50-90min，32％-72％b；进样量50μl；流速0.2ml
·
min-1。喷雾电压4.5kv；毛细管温度300℃；氮气(n2)253kpa；正离子模式，一级质谱扫描范围m/z 300-1500，精确质量数扫描(zoom scan)和二级质谱(ms/ms)扫描均为数据依赖型扫描(data dependent scan)；动态排除次数1；动态排除时间0.5min；二级质谱碰撞能量35％。
74.按照国标gb22729海洋低聚肽的方法检测平均分子量，结果如表1所示。
75.采用氨基酸自动分析仪(赛卡姆型号是s433d)检测碱性氨基酸含量，结果如表1所示。
76.表1
[0077][0078]
表2为实施例1制备的胶原三肽产品中含碱性氨基酸的胶原三肽序列
[0079]
表2
[0080][0081][0082]
表3为实施例2制备的胶原三肽产品中含碱性氨基酸的胶原三肽序列
[0083]
表3
[0084]
序号胶原三肽序列分子量1gly-pro-arg328.362gly-hyp-arg344.333gly-hyp-his325.294gly-hyp-lys316.325gly-pro-his308.966gly-pro-lys300.357gly-glu-arg360.368gly-ser-arg318.329gly-ala-his283.2810gly-phe-lys350.4111gly-leu-his325.3612gly-ile-lys316.3913gly-ala-arg302.3214pro-gly-arg328.8615hyp-gly-arg344.33
[0085]
表4为实施例3制备的胶原三肽产品中含碱性氨基酸的胶原三肽序列
[0086]
序号胶原三肽序列分子量1gly-hyp-lys316.322gly-pro-lys300.353gly-glu-arg360.364gly-ser-arg318.325gly-phe-lys350.416gly-ala-arg302.32
[0087]
抗糖化能力检测
[0088]
通过以下两种方法对实施例1-3制备的胶原三肽产品以及市购胶原蛋白肽，胶原三肽(北京盛美诺生物技术有限公司提供)进行抗糖化能力检测：
[0089]
1.糖化抑制率：采用bsa-果糖模拟反应体系，将1ml果糖溶液(1.5mol/l)与1ml胶原蛋白肽组分溶液混合，37℃孵育2小时后，加入1ml30mg/ml bsa溶液，以上反应物均用50mmol/lph7.4磷酸盐缓冲液(含有0.1％叠氮化钠)溶解，用同质量浓度的氨基胍溶液代胶原蛋白肽各组分溶液作为阳性对照组，用磷酸盐缓冲液代替胶原蛋白肽各组分溶液作为空白组，用磷酸盐缓冲液代替果糖溶液作为bsa、胶原蛋白肽共孵育组，将各样品于生化培养箱中37℃孵育6d后，在激发波长370nm、发射波长440nm条件下测定各样品的荧光强度，胶原蛋白肽对荧光性ages生成的抑制率r通过以下公式进行计算。
[0090]
r/％＝(1-fa/fb)*100
[0091]
式中：fa为各样品组的荧光强度；fb代表空白组的荧光强度。
[0092]
检测结果如表5所示。
[0093]
2.以野生型ab品系斑马鱼为研究对象，进行体内评价抗糖化效果。
[0094]
一、检测材料
[0095]
1.实验动物
[0096]
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率约为500μs/cm；ph约为7；硬度约为80mg/l caco3)，由本公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2012-0171，饲养管理符合国际aaalac认证(认证编号：001458)的要求。
[0097]
野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，共300尾。
[0098]
2.仪器、耗材与试剂
[0099]
紫外线光疗仪(kn-4006，徐州市科诺医学仪器设备有限公司)；精密电子天平(cp214，ohaus，america)；多功能酶标仪(spark，tecan，switzerland)；6孔板(nest biotech，china)；96孔板(nest biotech，china)；糖化血红蛋白elisa检测试剂盒(批号202004，台湾力钧生物，china)。
[0100]
二、检测方法
[0101]
1.抗糖化功效评价
[0102]
随机选取210尾3dpf野生型ab品系斑马鱼，平均分成7组，置于两个6孔板中，每孔30尾斑马鱼，每孔3ml养鱼用水。实验组分别给予终浓度1250μg/ml的实施例1-3制备的胶原三肽产品、市购胶原蛋白肽，以及胶原三肽(北京盛美诺生物技术有限公司提供)处理2小时；正常对照组和模型对照组分别给予相同体积的水。之后，除正常对照组外，其余组分别采用紫外照射导致斑马鱼紫外损伤：28℃处理24h。紫外线照射结束后，将斑马鱼匀浆，利用糖基化elisa检测试剂盒进行反应，以组织中糖化血红蛋白含量统计学分析结果评价胶原蛋白肽的抗糖化功效。统计学处理结果用mean
ꢀ±
se表示，胶原蛋白肽对斑马鱼的抗糖化功效计算公式如下：
[0103][0104]
用spss软件进行统计学分析，p《0.05表明具有显著性差异。
[0105]
表5
[0106][0107]
[0108]
表6
[0109][0110]
从上表5和6可以看出：本发明提供的富含碱性氨基酸的胶原三肽产品，其抗糖化效果远远高于市购胶原蛋白肽和胶原三肽的抗糖化效果，本技术提供的富含碱性氨基酸的胶原三肽产品的糖化抑制率最低为53％，最高达到98％，而市购胶原蛋白肽的糖化抑制率仅仅为16％，市购胶原三肽的糖化抑制率仅仅为22％。本技术提供的富含碱性氨基酸的胶原三肽产品的体内抗糖化功效也远远高于市购胶原蛋白肽和胶原三肽的体内抗糖化功效。此外，碱性氨基酸的种类越多，越有利于糖化抑制。