一种食酸菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种食酸菌及其应用。


背景技术：

2.食酸菌属(acidovorax)，是1990年由willems等将假单胞菌属中的2个种分出来新建的一个属，菌体杆状，直或微弯，革兰氏染色阴性，最适生长温度为30-35℃。这个属在bergey细菌分类手册中收录7个种，至今，食酸菌属共计发布18个种，食酸菌属的功能也在被陆续报道，如，a.delftia fzul-63可去除电镀废水和电子垃圾消解液中的金离子，acidovorax sp.no1可氧化三价砷以降低环境中的砷毒性，acidovorax sp.no1 shs-01可降解四环素等。
3.多相分类是由colwell于1970年提出的细菌分类学术语，指综合利用包括表型、基因型、系统发育学研究等微生物多种信息进行分类的方法，被认为现代各级分类单元最有效的手段。利用多相分类鉴别食酸菌属新种类，可增强人们对食酸菌多样性的了解，对食酸菌的科学研究和实际应用具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种食酸菌新种及其应用。
5.本发明提供了一种食酸菌，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：cctccno：m2021276的食酸菌ccyzu-2555
t
(acidovorax sp.ccyzu-2555t)。
6.其中，它的16s rdna序列如seq id no.1所示。
7.本发明还提供了上述食酸菌的培养方法，将其接种于lb培养基，在30℃、ph7.0的条件下生长。
8.本发明还提供了一种细菌培养物，它含有上述食酸菌。
9.本发明还提供了保藏号：cctcc no：m2021276的食酸菌ccyzu
‑‑
2555
t
在制备硝酸盐还原微生物制剂中的用途。
10.本发明还提供了保藏号：cctcc no：m2021276的食酸菌ccyzu
‑‑
2555
t
在治理硝酸盐污染中的用途。
11.其中，所述硝酸盐污染包括水体、土壤的硝酸盐污染。
12.本发明保藏号为cctcc no：m2021276的食酸菌ccyzu
‑‑
2555t(acidovorax sp.ccyzu-2555
t
)，经多相分类鉴定为食酸菌属新种，命名为扬州食酸菌(acidovorax yangzhouensis sp.nov)。于2021年3月25日，将本发明菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，其地址为：中国
·
武汉
·
武汉大学，保藏号为cctcc no：m2021276。
13.本发明提供了一种食酸菌属新种，该新种的发现和利用，丰富了人类可利用的微生物资源，有利于对食酸菌属的科学研究及开发利用。本发明的食酸菌，能实现硝酸盐的生物转化，可应用于污水、土壤的生物脱氮，可应用于土壤固氮，对于治理环境、保护人类健康具有重要意义。
14.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
15.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
16.图1本发明菌株ccyzu-2555
t
极性脂薄层色谱结果。
17.图中，a：5％w/v乙醇磷钼酸；b：钼蓝喷雾；c：0.2％w/v茚三酮；pe,磷脂酰乙醇胺；dpg,二磷酸甘油酯；pl,不明磷脂；al,氨基脂质；l,未知极性脂质。
18.图216srrna基因邻接法系统发育树图。星号(*)和加号(+)分别表示使用最大似然法和最大简约法获得的节点。节点上的数字是基于1000次复制的百分比引导值(仅显示大于50％的值)。单位长度，每个核苷酸位置0.005个替换。
19.图316srrna最大似然法系统发育树图。节点上的数字是基于1000次复制的百分比引导值(仅显示大于50％的值)。单位长度，每个核苷酸位置0.010个替换。
20.图416srrna最大简约法系统发育树图。节点上的数字是基于1000次复制的百分比引导值(仅显示大于50％的值)。
具体实施方式
21.本发明涉及到的参考菌株及试剂均为购买获得。其中，a.valerianellae(dsm 16619
t
)和a.anthurii(cfbp 3232
t
)购自the german collection of microorganisms and cell cultures(dsmz)，a.monticola(k-4-16t)购自the biological resource center,nite(nbrc)。
22.实施例1本发明食酸菌ccyzu-2555
t
的分离鉴定
23.从江苏扬州茱萸湾动物园细尾獴饲养区的洞穴土壤中，采用lb平板稀释法分离得到本发明菌株，使用多相分类法对该菌株进行鉴定分类，具体如下：
24.1、形态学特征鉴定
25.对菌株ccyzu-2555
t
进行形态学特征鉴定，肉眼观察ccyzu-2555
t
在lb培养基上的菌落形态为：灰白色、圆形菌落，表面光滑，菌落不透明，有完整的边界。投射电镜观察显示ccyzu-2555
t
宽9
–
1.2μm、长2.0
–
2.2μm，两端有鞭毛。符合食酸菌属的特征。
26.2、生理生化特征鉴定
27.考察菌株ccyzu-2555
t
在lb培养基中，在不同温度(4、10、20、30、35、37、40、42、45℃)、ph(4.0～10.0，30℃)和nacl浓度(0～4％nacl，w/v，30℃)下培养3d的最佳条件。
28.结果表明，ccyzu-2555
t
在4-42℃、ph4.0-9.0和0-3％nacl条件下生长。菌株ccyzu-2555
t
在不添加nacl的条件下，在30℃、ph7.0条件下生长最适。
29.采用gen-iii微板(biolog)测试碳源利用率和化学敏感性。其他生化特性和酶活性采用api20ne试剂盒(biom
é
rieux)进行测试。将菌株ccyzu-2555
t
(即a.yangzhouensisccyzu-2555
t
))与近缘菌株进行比较，差异特性见表1。
30.表1菌株ccyzu-2555
t
的与近缘菌株的特征比较
[0031][0032][0033]
注：表中所有数据均来自本技术人的实验研究，+表示阳性，-表示阴性，w表示弱阳性。
[0034]
结果表明，本发明菌株ccyzu-2555
t
的生理生化特征如下：ccyzu-2555
t
能够还原硝
酸盐，同化己二酸，能够耐受1％nacl，能够利用乳酸钠和丙三醇作为碳源，符合食酸菌属的特征。
[0035]
3、细胞化学分析
[0036]
(1)脂肪酸分析
[0037]
使用气相色谱仪(安捷伦(agilent)6890n)对细胞壁脂肪酸组分进行分析,通过微生物脂肪酸快速鉴定系统(midi)检测菌株的全细胞脂肪酸组成。
[0038]
经分析，菌株ccyzu-2555
t
与食酸菌属内邻近种的细胞脂肪酸谱见表2。
[0039]
表2菌株ccyzu-2555
t
的与近缘菌株的脂肪酸比较
[0040][0041]
summed feature 3为(c16:1ω7c和/或c16:1ω6c)；summed feature 5为(c8:0ante和/或c18:2ω6,9c.)；
[0042]
summed feature 8为(c18:1ω7c和/或c18:1ω6c)。
[0043]
注：表中所有数据均来自本技术人的实验研究，表中数值是总脂肪酸的百分比。nd表示未检出，tr表示微量(《0.1％)。
[0044]
结果显示，ccyzu-2555
t
的主要细胞脂肪酸为summed feature 3(c
16:1
ω7c和/或c
16:1
ω6c)(32.02％),c
16:0
(30.20％)，c
17:0
cyclo(15.98％)和summed feature 8(c
18:1
ω7c和/或c
18:1
ω6c)(10.14％)。
[0045]
ccyzu-2555
t
与acidovorax属内参考菌株的脂肪酸谱不完全相同，比如c
17:0
cyclo
的比例就表现出差异，相较于参考菌株，ccyzu-2555
t
含有更高比例的c
17:0
cyclo。同时，ccyzu-2555
t
中summedfeature3(c
16:1
ω7c和/或c
16:1
ω6c)的比例也明显高于参考菌株。ccyzu-2555
t
含有c
8:0
3-oh,c
19:0
,c
17:1
ω7c,and summed feature 5(c
8:0
ante和/或c
18:2
ω6,9c)，而这些组分在参考菌株中是缺失的。ccyzu-2555
t
没有检测到c
18:0
和c
15:1
ω6c，而这些组分在参考菌株中却是存在的。
[0046]
(2)呼吸醌和极性脂分析
[0047]
根据minnikin等人的方法【minnikin de,o'donnell ag,goodfellow m,alderson g,athalye m et al.an integrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones and polar lipids.journal of microbiological methods 1984；2(5):233-241】，从冷冻干燥细胞中分析呼吸醌和极性脂。
[0048]
ccyzu-2555
t
中唯一的呼吸醌为泛醌8(q-8)，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(pe)和二磷酸甘油(dpg)。此外，还检测到3种不明氨基脂质(al1-al3)、两种未知极性脂质(l1-l2)和两种未识别磷脂(lp1-pl2)(图1)。
[0049]
4、分子生物学特征鉴定
[0050]
(1)16s rrna基因序列分析
[0051]
使用天根细菌dna试剂盒(tianamp bacteria dna kit)提取菌株ccyzu-2555
t
的基因组dna。采用通用引物：正向引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)和反向引物1492r(5
’‑
ggytaccttgttacgactt-3’)扩增菌株的16srrna基因。测序获得16srdna序列后，将其在ncbi网站进行blast比对，分析菌株分类地位。应用ezbiocloud服务器，确定16srrna序列的系统发育近邻。
[0052]
结果显示，本发明菌株的16srdna基因序列长度为1529bp，序列如下(seq id no.1)：
[0053]
tatagagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcatgccttacacatgcaagtcgaacggtaacagctcttcggaggctgacgagtggcgaacgggtgagtaatacatcggaacgtgcccgatcgtgggggataacggagcgaaagctttgctaataccgcatacgatctacggatgaaagcaggggaccctcgggccttgcgcgaacggagcggccgatggcagattaggtagttggtgggataaaagcttaccaagccgacgatctgtagctggtctgagaggacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggcgaaagcctgatccagcaatgccgcgtgcaggatgaaggccttcgggttgtaaactgcttttgtacggaacgaaaagtctcgggataataccctgggaccatgacggtaccgtaagaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggttatataagacagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatttgtgactgtatagctagagtacggtagagggggatggaattccgcgtgtagcagtgaaatgcgtagatatgcggaggaacaccgatggcgaaggcaatcccctggacctgtactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgtcaactggttgttgggtcttcactgactcagtaacgaagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggtttaattcgatgcaacgcgaaaaaccttacccacctttgacatgtacggaagttaccagagatggtttcgtgctcgaaagagaaccgtaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgccattagttgctacatttagttgggcactctaatgggactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttataggtggggctacacacgtcatacaatggctggtacagaaggttgccaacccgcgagggggagctaatcctataaagccagtcgtagtccggatcgcagtc
tgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagcgggtctcgccagaagtaggtagcctaaccgcaaggagggcgcttaccacggcggggttcgtgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacctccttt
[0054]
经blast序列比对，菌株ccyzu-2555
t
的16srrna基因序列与a.anthurii cfbp 3232
t
的相似性最高(97.5％)，其次是a.valerianellae dsm 16619
t
(97.2％)，a.radicis n35
t
(97.1％)、a.temperans ccug 11779
t
(97.1％)、a.facilis ccug 2113
t
(97.0％)和a.monticola k-4-16
t
(97.0％)，与食酸菌属内其他菌种的相似性均低于97.0％，这些值均低于细菌新种鉴定的阈值98.7％，表明ccyzu-2555
t
为食酸菌属的新种。
[0055]
使用mega-x软件，采用muscle算法进行序列比对，采用邻接、最大似然和最大简约算法重建基于16srrna基因序列的进化树。对于nj方法，使用jukes和cantor模型计算进化距离矩阵。对于ml分析，选择了最佳模型(gtr+g+i)。所有的系统发育树都是基于1000次重新采样的bootstrap分析。基于16srrna基因序列分析菌株ccyzu-2555
t
与相关物种之间的关系。结果见图2-4。
[0056]
可知，基于16s rrna基因分析的邻接树(图2)显示，菌株ccyzu-2555
t
在食酸菌菌属内形成了一个单独的谱系，并与a.valerianellae cfbp 4730
t
、acidovorax anthurii cfbp 3232
t
、a.monticola k-4-16
t
和a.lacteus m36
t
聚类在一起。最大似然树(图3)和最大简约树(图4)也支持这种拓扑结构。三种方法构建的系统发育树均表明菌株ccyzu-2555
t
在系统上属于食酸菌属(acidovorax)，但与acidovorax属已知种的序列相似度较低，表明ccyzu-2555
t
是一个新种。
[0057]
(2)基因组测序及生物信息学分析
[0058]
利用illumina平台对ccyzu-2555
t
进行了基因组测序，使用a5 miseq和spades进行从头组装，并通过pilon软件进行碱基校正。用pgcgap软件对全基因组序列进行注释。
[0059]
结果表明，ccyzu-2555
t
基因组全长为5765020bp，基因组dnag+c含量为65.4mol％，符合食酸菌属基因组dnag+c含量62.0～66.0mol％的变化范围。
[0060]
为了确定基因组的相关性，通过
[0061]
jspeciesws(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws)计算anib和anim。利用genome-to genome distance calculator(ggdc；http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php)计算ddh值。
[0062]
表3菌株ccyzu-2555
t
的与近缘菌株的平均核苷酸一致性比较
[0063][0064]
可知，菌株ccyzu-2555
t
与近缘菌株之间的anib和anim值均小于85％(表3)，低于临界值(将菌株分类为不同物种的标准值95-96％)；而且菌株ccyzu-2555
t
与a.valerianellae dsm 16619
t
、a.anthurii cfbp 3232
t
、a.monticolak-4-16
t
的ddh值分别为21.3％、21.2％、21.8％，也低于种界阈值(70％)。支持菌株ccyzu-2555
t
为食酸菌属的一
个新种。
[0065]
综合形态学特征、生理生化特征、细胞化学组分分析以及系统发育和遗传数据，将菌株ccyzu-2555
t
鉴定为食酸菌属的一个新种，并命名为扬州食酸菌(acidovorax yangzhouensis sp.nov)。于2021年3月25日，将本发明菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccno：m2021276。
[0066]
实施例2本发明食酸菌ccyzu-2555
t
的用途
[0067]
经api鉴定系统测定，本发明食酸菌ccyzu-2555
t
具有硝酸盐还原能力，能够降解硝酸盐，实现硝酸盐的生物转化。
[0068]
硝酸盐作为环境污染物，广泛存在于海水、土壤中，硝酸盐污染已成为全球关注的问题之一。硝酸盐还原，在微生物中是以硝酸盐为氮源加以利用和同化的第一阶段反应，对于整个氮素循环极为关键，其将环境中的硝酸盐还原成亚硝酸盐，生成的亚硝酸盐可进一步还原为氮气或一氧化二氮(即反硝化作用)而进入大气得以循环，或还原为氨态氮，降低土壤氮素流失。
[0069]
本发明食酸菌ccyzu-2555
t
能实现硝酸盐的生物转化，可应用于生物脱氮，为环保、化工等领域提供了新的微生物资源。
[0070]
综上，本发明保藏号：cctcc no：m2021276的食酸菌ccyzu-2555
t
能实现硝酸盐的生物转化，可应用于污水、土壤的环境治理，对于保护生态环境、保护人类健康具有重要意义，应用前景良好。