蛮龙液中有效成分抗人脐带间充质干细胞衰老的用途的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及蛮龙液中有效成分抗人脐带间充质干细胞衰老的用途，有效成分为地黄苦苷。


背景技术：

2.蛮龙液是以雄蚕蛾、淫羊藿、补骨脂、菟丝子、刺五加、熟地黄等十余种名贵中药材精制而成的口服液制剂。具有填精益肾、助阳滋阴、益气活血、调和脏腑、固本培元等作用。经临床验证，对慢性前列腺炎、前列腺肥大引起的尿频、尿急、尿潴溜、夜尿多等症状具有显著疗效；对腰膝酸软、神倦乏力、小便频数、夜尿多起等肾虚症状有明显的治疗作用。此外，对于妇女体寒肢冷、月经不调也有较好的疗效。蛮龙液由云南云龙制药有限公司独家生产，申请人在对蛮龙液的基础研究中发现蛮龙液处方中熟地黄的有效成分为地黄苦苷，地黄苦苷具有抗人脐带间充质干细胞衰老的用途。
3.衰老又称为老化，通常指在正常情况下机体发育成熟后，随着年龄的增加，自身机能减退，内环境稳定能力与应激能力下降，结构组织逐步退行性变，趋向死亡的现象。从整体器官水平分析，衰老伴随而来的老年退行性疾病所导致的组织器官结构和功能减退。从细胞衰老的角度分析，人体衰老源于以下几方面的综合作用：(1)组织细胞的衰老与凋亡；(2)干细胞的衰退导致正常衰老死亡细胞无法得到更新换代，功能细胞总量下降；(3)外环境对基因的作用加速细胞老化；(4)体内衰老基因的活跃和年轻化基因的失活；(5)细胞内外环境的有害因素积累导致细胞中的大分子、自由基等受损，细胞自噬作用下调。组织细胞的凋亡与再生受体内细胞因子、神经内分泌、免疫与炎症反应、代谢与营养等多种因素共同调节。
4.干细胞是一类具有自我更新能力与多向分化潜能的重要细胞群体。并且，在阿尔茨海默症、帕金森症等研究领域干细胞转化医学的研究已经取得了丰硕的成果。其中，脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，huc-mscs)具有取材方便，低免疫原性，分化能力强等等优势，成为转化医学研究的重要实验对象。但是，huc-mscs在体外培养条件下，随着操作中不可避免的机械损伤、化学处理，使得细胞增殖分化能力也随之减弱，最为重要的是干细胞的干性也随之降低。如果对huc-mscs产生促进增殖、延缓衰老的作用，一直是实验室和药厂追求的目标。研究发现，细胞的衰老是受一系列基因调控的，许多基因都参与这一复杂的生物过程，如p16、p21、p53、pcna和sirt2等，其中p21、p53为衰老正相关蛋白。


技术实现要素：

5.本技术人在实验中发现蛮龙液中有效成分地黄苦苷在抗人脐带间充质干细胞衰老的用途，因此本发明目的在于克服现有技术不足，提供蛮龙液中有效成分地黄苦苷在抗人脐带间充质干细胞衰老的用途，地黄苦苷作为人脐带间充质干细胞的培养基。
6.本发明目的通过如下技术方案实现：
7.蛮龙液中有效成分抗人脐带间充质干细胞衰老的用途，有效成分为地黄苦苷。
8.所述蛮龙液中有效成分抗人脐带间充质干细胞衰老的用途，蛮龙液中有效成分地黄苦苷作为人脐带间充质干细胞的培养基。
9.所述蛮龙液中有效成分抗人脐带间充质干细胞衰老的用途，蛮龙液中有效成分地黄苦苷抑制人脐带间充质干细胞衰老蛋白p53、p21蛋白的表达。
10.蛮龙液中有效成分地黄苦苷能促进人脐带间充质干细胞增殖，可以作为促进人脐带间充质干细胞的培养基，
11.地黄苦苷，英文名：rehmapicroside，cas号：104056-82-8，分子式：c
16h26
o8，分子量：346.376，成都植标化纯生物技术有限公司提供。
12.技术效果：
13.本发明研究结果发现，蛮龙液中有效成分地黄苦苷在抗人脐带间充质干细胞衰老的用途，地黄苦苷可以作为人脐带间充质干细胞的培养基，能促进人脐带间充质干细胞增殖，抑制人脐带间充质干细胞衰老蛋白p53、p21蛋白的表达。
附图说明
14.图1地黄苦苷对人脐带间充质干细胞活力的影响；
15.图2地黄苦苷对人脐带间充质干细胞衰老蛋白p53、p21蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
16.下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
17.实施例1：地黄苦苷对人脐带间充质干细胞增殖的影响
18.1.1取材
19.(1)取足月剖腹产新生儿脐带，经检测产妇排除hav、hbv、hiv、eb病毒、巨细胞病毒等传染性疾病。无菌条件下，将采集的脐带用生理盐水反复冲洗，去掉残留血液。将脐带剪碎为1mm3组织块，转移到培养瓶中，用含20％fbs dmem/f12培养基培养，次日补液，3d后换液，7d后观察细胞生长状态，达到90％融合后传代培养。
20.(2)细胞传代培养：当细胞融合度达到90％左右时，进行细胞传代。首先，倒去废液，吸走剩余残液，加入1ml pbs轻轻吹打几次，冲掉剩余的培养基，吸走pbs后，加入1ml0.25％胰酶消化液，37℃孵育30s后，吸走胰酶，显微镜下观察细胞形态由长梭状变为圆球状时，加入1m l培养基终止消化，冲洗瓶壁上细胞，转移至离心管中，1500rpm离心细胞3min后，弃上清，然后加入2ml培养基重悬细胞，分于两个新的25cm2细胞培养瓶中，添加培养基至5ml，在37℃、5％co2浓度、饱和湿度条件下培养。一般2天后细胞融合度达到90％以上，可进行下一次传代培养。
21.1.2消化离心获得细胞：(1)加入与组织等体积的0.1％的胶原酶后，37℃水浴中消化20-30min。(2)消化过程中每10min摇晃一次。(3)过200目筛网，用deme冲洗几次肺组织。(4)4℃，300g离心10min，去上清。(5)用dmem重悬后，4℃，400g离心10min，去上清。(6)用dmem重悬后，加入红细胞裂解液裂解5min。(7)1000rpm离心5min，去上清。(8)用含10％的fbs的dmem重悬细胞后计数。
22.1.3绘制生长曲线：按2
×
104/ml密度，接种huc-mscs于96孔培养板，每组4个复孔，每隔24h，mtt法检测吸光度值(od值)，连续7d。以时间为横坐标、平均od值为纵坐标，绘制生长曲线，计算细胞倍增时间(td)：td＝t
×
lg2(lgnt-lgn0)；t为培养时间，n0及nt为接种后及培养t小时所测得的od值。分为两组，模型组为d-半乳糖8g/l+基础培养基，本发明组为d-半乳糖8g/l+地黄苦苷(终浓度为0.01μmol/l)+基础培养基。
23.1.4细胞增殖与生长曲线变化：传代培养至第7代，本发明组细胞于3-7d处于对数增殖期，而模型组细胞则3-5d有所增殖，但增殖数量明显减少，本发明组huc-mscs 2-7d的扩增数量远远高于模型组，见图1。
24.研究表明，采用d-半乳糖处理huc-mscs作为衰老模型组，衰老模型组的细胞形态与增殖能力发生了明显的衰老改变，即细胞变得宽大扁平，星形及多角星形细胞比例增加，生长速度缓慢，倍增时间延长，细胞扩增数量极低的明显改变。本发明组huc-mscs 2-7d的扩增数量远远高于模型组，说明地黄苦苷能促进人脐带间充质干细胞增殖。
25.实施例2：western blot检测人脐带间充质干细胞衰老蛋白p53、p21的表达
26.(1)分组：取实施例1制备的huc-mscs，按2
×
104/ml密度，接种huc-mscs于96孔培养板，培养条件为dmem/f12培养基中含10％胎牛血清和1％青链霉素，置于37℃，5％co2培养箱中培养，分为三组，一种为对照组，加dmso，一组为20μg/ml地黄苦苷，一组为40μg/ml地黄苦苷，继续培养24小时。
27.(2)蛋白提取：分别取出诱导4w，生长状态良好的各组细胞，弃掉原培养基，pbs冲洗3次，放入适量的pbs，刮下培养瓶中的细胞，转移到预冷的15ml离心管中。将收集好的细胞在常温1500rpm，离心7min，弃掉上清液，保留管底的细胞块；蛋白裂解：每5
×
106个细胞中加入500μl预冷的裂解液(每1ml预冷的ripa裂解液中加入5μl蛋白酶抑制剂)，混匀，在4℃条件下放置30min。在4℃，12000rpm离心10min，吸取上清液转移到新的离心管中；
28.(3)蛋白定量：检测每个蛋白样品的浓度；
29.(4)蛋白变性：加入5x sds-page蛋白上样缓冲液(以1:5的比例配制)，震荡混匀，在沸水中加热10min，使蛋白样品充分变性，将变性好的蛋白样品离心；
30.(5)sds-聚丙稀酰胺凝胶电泳(sds-page凝胶电泳)：在凝胶孔内加入已变性的蛋白样品和蛋白marker，电压设置为160v，时间设置为50min，进行电泳；
31.(6)激膜：取出pvdf膜，剪去一角做好marker部位标记，放入15ml甲醇溶液，摇床上慢摇5min，期间加入60ml蒸馏水，加入蒸馏水时需要摇床快速摇晃，蒸馏水缓慢加入(切勿蒸馏水冲到膜上)，加蒸馏水完成后摇床慢摇10min，随后将pvdf膜放入不含sds转膜液中继续慢摇20min；
32.(7)转膜：打开玻璃板，去除上部分浓缩胶，将剩下的分离胶放在不含sds转膜液中待用。按照正极-垫片-滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸-垫片-负极次序依次放好，夹子夹紧，放入转膜槽中，转膜槽中添加含sds转膜液，在冰浴条件下，电压设置在100v，时间60min，开始转膜；
33.(8)封闭：封闭液的配置，是含有5％脱脂牛奶的1
×
tbst缓冲液(以1:20的比例配置)，把膜放在封闭液中，摇床上慢摇封闭2h；
34.(9)孵育一抗：一抗需用封闭液稀释，按照1:10000的比例配制β-actin；按照1:1000的比例配制p53、p21，配好后摇床上慢摇1min，将膜放入稀释液中，摇床上慢摇5h或4℃
条件下过夜；
35.(10)洗膜：室温条件下，用1
×
tbst缓冲液在摇床上快摇洗膜(3次
×
7min)；
36.(11)孵育二抗：用封闭液配制二抗稀释液，按照1:10000的比例配制goat anti-rabbit igg/hrp，配好后，摇床上慢摇1min，将洗好的膜放在稀释液中，室温条件下，孵育2h；
37.(12)洗膜：室温条件下，用1
×
tbst缓冲液在摇床上快摇洗膜(3次
×
7min)；
38.(13)显影：滤纸吸干多余的液体，膜上滴加新鲜配置的ecl发光液，发光液需均匀铺在膜上，注意有无气泡，用护卡膜封好，ai600超灵敏化学发光成像仪成像后进行结果分析，见图2。
39.通过灰度定量分析结果显示，地黄苦苷抑制人脐带间充质干细胞衰老蛋白p53、p21蛋白的表达，与模型组相比具有统计学差异(p＜0.05)。
40.本发明研究结果发现，地黄苦苷抑制人脐带间充质干细胞衰老蛋白p53、p21蛋白的表达，可用于促进人脐带间充质干细胞的增殖。
41.上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。