从大麦产生乙醇和含有降低的β-葡聚糖和肌醇六磷酸的DDGS的制作方法

专利名称：:从大麦产生乙醇和含有降低的β-葡聚糖和肌醇六磷酸的DDGS的制作方法从大麦产生乙醇和含有降低的P-葡聚糖和肌醇六磷酸的DDGS本发明要求在2007年3月14日提交的美国临时申请60/918,163的优先权，其内容以其整体引入作为参考。发明领域本发明涉及淀粉水解过程的方法，其用于在低于淀粉胶化温度的温度下，从碾碎的植物材料中获得适合于动物祠料的含降低水平的p-葡聚糖和肌醇六磷酸DDGS。发明背景来自可再生原料的乙醇具有作为化石燃料持久替代品满足当今社会最大挑战之一的可能性，尤其是在运输部门，可以减少温室气体排放。在2005年，在美国生产了151亿升(40亿加仑)的燃料乙醇。目前有109种投产的植物具有198亿升(52亿加仑)的容量，53种尚未投产植物的容量将增加至357亿升(94亿加仑)(2006年12月数据)。在美国，玉米是乙醇生产的主要原料，例如，在2006年，约20。/。的美国玉米供应用于生产燃料乙醇，以取代仅3-4%的汽油供应。为了避免"燃料对食物，，问题，需要玉米原料的替代品。其中，大麦具有成为乙醇生产备选原料的巨大可能性，尤其在中部大西洋州和其它州，在那里大麦是冬季农作物，允许与大豆复种。估计在北美洲，大麦每年可提供至少十亿加仑的乙醇，其为2006年美国总乙醇产量的约20%。然而，在美国没有工厂使用大麦作为原料，因为平常的去壳大麦因以下原因在不经修改的常规玉米到遗传工厂中不能被处理l)去壳大麦的磨蚀性质将损坏谷粒处理和研磨设备，因而提高资本成本，2)大麦的低淀粉含量(50-55%)与玉米相比将导致更低的乙醇产量，对于相同的容量，需要将大麦工厂建造的比玉米工厂更大，3)因P-葡聚糖造成的大麦醪液的高粘度，和4)产生具有高水平(5-葡聚糖的干酒糟与可溶物(DDGS)副产品，其不能用于家禽、猪和水产业饲料，这限制了该副产品在家禽和猪生产领域中的价值。为了大麦到燃料乙醇方法在经济上成功，必须克服上述技术障碍。该文章的目的是开发用于乙醇生产的基于大麦的STARGENtm方法。发明简述本发明涉及从碾碎的植物材料水解淀粉的方法，其包括在低于碾碎的植物材料中颗粒淀粉的初始胶化温度的温度下将碾碎的植物材料与内源植物肌醇六磷酸酶、葡糖淀粉酶和微生物a-淀粉酶的酶组合接触，以得到可发酵的糖。本发明还涉及在发酵微生物的存在下使可发酵糖发酵成终产物。在另一实施方案中，所述方法使用酶组合中的p-葡聚糖酶。在实施方案中提供了包含来自酵母发酵的DDGS的动物饲料，所述DDGS基本上不含肌醇六磷酸。在一个实施方案，低于起始胶化温度的温度为约25°C到约77°C,或约50。C到约80。C。一方面，终产物是DDGS并且所述DDGS基本上没有肌醇六磷酸。另一方面，终产物是DDGS并且所述DDGS基本上没有卩-葡聚糖。在任一情况下，DDGS均可用于动物饲料。一方面，碾碎的植物材料是大麦、小麦或黑麦。酶组合物还可包括次要酶，如第二种葡糖淀粉酶、第二种a淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、支链淀粉酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、P-葡聚糖酶、环糊精反式转糖基酶(transglycosyltransferase)、p-淀粉酶及其组合。一方面，浆液的pH处于约pH3到约pH7之间。浆液可与酶组合物保持接触约2小时至约240小时。酶组合可作为混合物或单独加入浆液中。在一个实施方案中，碾碎的植物材料包括大麦、高粱、玉米或其组合物，并在约3.5至约5.5的pH5范围内，在约30-约45°C的温度范围和约48小时至约90小时的时间内同时进行接触和发酵步骤，并且至少约50%的淀粉被溶解。在其它实施方案中，终产物是乙醇并且产量高于约8%。其它实施方案是从碾碎的植物材料发酵乙醇的方法，包括通过将碾碎的植物材料的浆液与葡聚糖淀粉酶及微生物a-淀粉酶的酶组合在低于碾碎植物材料中颗粒淀粉的初始胶化温度的温度下接触，以获得可发酵糖(其中所述碾碎植物材料包含内源肌醇六磷酸酶)；并且在发酵微生物的存在下使可发酵糖发酵成乙醇。酶的组合可作为混合物加入或单独加入，并且酶的所述组合还可包括p-葡聚糖酶。发酵也可导致产生具有降低的肌醇六磷酸和p-葡聚糖减少的DDGS,其可用于动物饲料。本发明的其它目标、特征和优势将在以下详细描述中变得显而易见。然而，应理解详细说明和特定实施例在说明本发明优选实施方案的同时，仅作为说明给出，因为从该详细说明，本发明范围和精神内的多种改变和修改将对本领域技术人员变得显而易见。附图简述图l是说明大麦浆液粘度谱的图。图2说明了常规的大麦到乙醇的生产方法。图3概述了发酵过程中的乙醇生产。图4概述了30。/oDS去壳大麦发酵结果。图5是说明在30%DS去壳大麦中OPTIMASHtmBG对乙醇产量影响的图。图6概述了低能量乙醇生产方法。发明详述现在仅通过使用以下定义和实例的参考详细描述本发明。此处涉及的所有专利和出版物，包括该专利和出版物中公开的所有序列明确地引入本文作为参考。6除非此处另有说明，此处所用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义。Singleton,等，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，第二版，JohnWileyandSons,NewYork(1994)，和Hale&Marham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明中所用许多术语的常用字典。尽管类似于或等同于此处所述的任何方法和材料均可用于本发明的实施或测试中，^f旦描述了优选的方法和材料。数值范围包括定义该范围的数字。除非另有指出，核酸以5'到3'的方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。尤其指导从业者从Sambrook等，1989，和AusubelFM等，1993中获得本领域的定义和术语。应理解本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些都会变化。数值范围包括定义该范围的数字。除非另有指出，核酸以5，到3'的方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。此处提供的949)和Aspergillusshiro眼mi(参阅Chen等，(1996)Prot.Eng.9:499画505;Chen等(1995)Prot.Eng.8:575-582;和Chen等，(1994)BiochemJ.302:275-281)。也可以从踝节菌属(Talaromyces)菌林，如来源于T.emersonii、T.iileycetta扁、T.duponti和T，thermophilus(WO99/28488;USPNo.RE:32,153;USPNo.4,587,215);木霉属菌林，如里氏木霉(T.reesei)的葡糖淀粉酶，尤其是与美国专利公开号2006-0094080中公开的SEQIDNO:4具有至少80%、85%、90%和95%序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉属菌林，^口雪白才艮霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae);毛霉属菌林和腐质霉属(H腿icola)菌林，如灰腐质霉(H.grisea)(参阅，Boel等，(1984)EMBOJ.3:1097画1102;WO92簡81;WO00/04136;Chen等，(1996)Prot.Eng.9:499-505;Taylor等，(1978)CarbohydrateRes.61:301-308;USP.4,514,496;USP4，092，434;USP4,618,579;Jensen等，(1988)Can.J.Microbiol.34:218—223和WO2005/052148的SEQIDNO:3)的葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶将与WO05/052148的SEQIDNO:3的氨基餅列有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。用于本发明的其它葡糖淀粉酶包括从罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)及其变种(WO04/111218)获得的那些。具有葡糖淀粉酶活性的商用的酶可通过，例如，黑曲霉(参见例如商品名DISTILLASE,OPTIDEXL-400和GZYMEG9卯4X，产自GenencorInternationalInc.)或根霉属物种(参见例如商品名CU.CONC，产自ShinNihonChemicals,日本)产生。也包括商购的消化酶，商品名GLUCZYME，产自AmanoPharmaceuticals,曰本(参见例如Takahashietal"(1985)J.Biochem.98:663-671)。其它酶包括来自一种根霉属的三种形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3),命名为"Glucl"(MW74,000)，"Gluc2"(MW58，600)和"Gluc3"(MW61,400)。也发现酶制剂GC480(GenencorInternationalInc.)可用于本发明。微生物来源的a-淀粉酶在本发明的另一优选实施方案中，方法包括使碾碎的植物材料与外源植物a-淀粉酶、葡糖淀粉酶及微生物来源的a-淀粉酶的组合接触。任何合适的a-淀粉酶均可用作本发明的微生物a-淀粉酶。在一些实施方案中，所述a-淀粉酶来源于细菌菌林，而在其它实施方案中，所述a-淀粉酶来源于真菌菌林。在其它实施方案中，优选的a-淀粉酶是细菌a-淀粉酶。在其它实施方案中，所述a-淀粉酶是酸稳定的a-淀粉酶。合适的a-淀粉酶可以是天然发生的以及重组的(杂合和变体)和突变a-淀粉酶(WO99/19467和WO97/41213)。在一些优选的实施方案中，所述a-淀粉酶来源于芽孢杆菌种。优选的芽孢杆菌种包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、迟緩芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)(USP5,093,257;USP5,763,385;USP5,824,532;USP5,958,739;USP6,008,026、USP6,361，809;USP6,867,031;WO96/23874;WO96/39528和WO05/001064)。特别优选的a-淀粉酶来源于芽孢杆菌菌林嗜热脂肪芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌((USP6,187,576;USP6，093，562;USP5,958,739;US2006/0014265和WO99/19467)。这种a-淀粉酶包括野生型、杂合的及变异的a-淀粉酶。参阅Suzuki等，(1989)J.Biol.Chem.264:18933-18938和US2006/0014265,尤其是SEQIDNO:3、4和16。也参考具有美国典型培养物保存中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC)号-ATCC39709;ATCC11945;ATCC6598;ATCC6634;ATCC8480;ATCC9945A和NCIB8059的菌林。除细菌a-淀粉酶外，也考虑真菌a-淀粉酶用于本发明的方法。合适的真菌a-淀粉酶来自丝状真菌菌林，如曲霉，如米曲霉和黑曲霉(例如FUNGAMYL和CLARASEL)和木霉属、根霉属、毛霉属和青霉属。考虑用于本发明方法的市售a-淀粉酶包括SPEZYMEAA;SPEZYMEFRED;SPEZYMEETHYL;GZYMEG997;CLARASEL(GenencorInternationalInc.);TERMAMYL120-L,LC，SC和SUPRA(NovozymesBiotech);LIQUOZYMEX和SANSUPER(NovozymesA/S)和ULTRATHIN(A/alleyResearch)。13在本发明另一优选实施方案中，方法包括使植物材料与外源植物a-淀粉酶、葡糖淀粉酶和p-葡聚糖酶的组合接触。P-葡聚糖酶的类型并不是至关重要的，但优选地，所述P-葡聚糖酶能够水解P-葡聚糖。因此，具有该性质的已知的或开发的任何p-葡聚糖酶可用于本发明的方法。也称作内切葡聚糖酶I、II和III的P-葡聚糖酶(内切纤维素酶-酶分类法EC3.2.1.4)是攻击纤维素纤维以释放更小纤维素片段的酶，所述纤维素片段被外切纤维素酶进一步攻击释放葡萄糖。P葡聚糖酶也可用于本发明的方法。用于本发明方法中的商品化p-葡聚糖酶包括OPTIMASHBG和OPTMASHTBG(Danisco，US,Inc.GenencorDivision)。发酵生物发酵生物的实例是产乙醇微生物和产生乙醇的微生物，如表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱氩酶并可从Zymomonasmoblis获得的产乙醇细菌(参阅例如USP5，000，000;USP5,028,539，USP5，424，202;USP5,514,583和USP5，554，520)。在额外的实施方案中，产乙醇微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，其为转化木糖成木酮糖的酶。在其它实施方案中，木糖异构酶用于将木糖转化成木酮糖。在特别优选的实施方案中，利用能够将戊糖和己糖发酵成乙醇的微生物。例如，在一些实施方案中，所述微生物可以是天然的或非遗传改造的微生物，或在其它实施方案中，所述微生物可以是重组微生物。在一些实施方案中，优选的发酵微生物包括来自芽孢杆菌、乳杆菌(Lactobacillus)、大肠杆菌(E.coli)、欧文氏菌(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)(例如，柠檬泛菌(P.citrea))、假单胞菌(Pseudomonas)和克雷伯氏菌(Klebsiella)(例如产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca))的细菌菌林。(参阅例如USP5,028,539、USP5，424，202和WO95/13362)。用于发酵步骤的发酵微生物将取决于待生产的终产物。在其它优选实施方案中，产生乙醇的微生物是真菌微生物，如酵母，并尤其是酵母属,i口酉良酒酵母(S.cerevisiae)菌林(USP4,316,956)。酿酒酵母的变种可通过商业途径获得，并且这些包括但不限于FALI(Fleischmann'sYeast)、SUPERSTART(Alltech)、FERMIOL(DSMSpecialties"REDSTAR(Lesaffre)和Angel乙醇酵母(AngelYeastCompany,China)。次要酶尽管本发明的实施方案包括内源植物肌醇六磷酸酶、微生物来源的葡糖淀粉酶和微生物来源的a-淀粉酶，但是接触步骤和/或发酵步骤还包括其它酶与发酵微生物和其它组分。额外的酶包括但不限于纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、支链淀粉酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、P-葡聚糖酶、环糊精反式转糖基酶、p-淀粉酶及其组合。p-葡聚糖酶的使用可帮助降低醪液粘度。方法步骤在一些实施方案中，包含颗粒淀粉的碾碎植物材料与水溶液混和，以获得浆液。浆液可以具有约5-约60%;10接触步骤的pH范围在约pH3.0到约pH7.0之间；也在约pH3.5到约6.5之间；也在约pH4.0到约6.0之间并且进一步在约pH4.0到约5.5之间。浆液在低于碾碎植物材料中颗粒淀粉的淀粉胶化温度的温度下与酶保持接触。在一些实施方案中，温度保持在约25。C到约75。C之间；在其它实施方案中，温度保持在约30。C到约70°C之间；约30。C到约65。C之间；约40。C到约65°C之间；约55°C到约70。C之间、约60°C到约65°C之间；约55°C到约65°C之间、约55°C到约78°C之间，和在约55°C到约68。C之间。在其它实施方案中，温度为至少约25°C、30°C、35°C、40。C、45。C、48。C、50oC、53。C、55。C、58。C、60oC、63。C、65。C和680C。在其它实施方案中，温度不高于约65。C、68。C、70。C、73。C、750C和80。C。根据本文方法^f吏用的许多颗粒淀粉的初始淀粉胶化温度范围包括大麦(52。C到59。C)、小麦(58。C到64。C)、黑麦(57。C到70。C)、玉米(62。C到72。C)、高直链淀粉玉米(67。C到80。C)、稻(68。C到77。C)、高粱(68。C到77。C)、马铃薯(58。C到68。C)、木薯淀粉(59。C到69。C)和甘薯(58。C到72。C)。(JJ.M.Swinkels第32—38页，StarchConversionTechnology,编辑VanBeynum等，(1985)MarcelDekkerInc.NewYork和TheAlcoholTextbook第三版AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries,编辑Jacques等，(1999)NottinghamUniversityPress,UK)。在接触步骤中，浆液与酶保持接触约2小时到约240小时；还保持约2小时到约120小时；还保持约5小时到约卯小时；约5小时到约72小时；和约5小时到约48小时。用于接触步骤中的a-淀粉酶的有效浓度将根据所用的特定方法条件和颗粒淀粉而变化。然而，通常所用的a-淀粉酶的量将在约0.001到约50AAU/gDS、约0.01到约30AAU/gDS、约0.01到约10AAU/gDS和约0.05到约5.0AAU/gDS的范围内。在一些实施方案中，接触步骤和/或发酵步骤中a-淀粉酶的有效剂量是约0.01到约25SSU/gDS;也是约0.01到约15SSU/gDS;也是约0.05到约10SSU/gDS;也是约0.1到约10SSU/gDS;也是约0.1到约10SSU/gDS和约0.5到约5SSU/gDS。在一些实施方案中，接触步骤和/或发酵步骤中葡糖淀粉酶的有效剂量在约0.01到约20GAU/gDS;还在约0.01到约15GAU/gDS;还在约0.05到约10GAU/gDS;还在约0.1到约10GAU/gDS并甚至在约0.5到约5GAU/gDS的范围内。在接触步骤中，溶解约20-约95%的颗粒淀粉以产生可发酵糖，如寡糖。在一些实施方案中，溶解高于约40%、高于约50%、高于约60%、高于约70%、高于约80%和高于约90%的淀粉。在一些实施方案中，溶解的淀粉包含高于约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%和80%的葡萄糖。在一些实施方案中，包含可发酵糖的醪液可进一步转化成终产物，如高果糖。在其它实施方案中，可发酵糖与发酵微生物进行发酵。接触步骤和发酵步骤可在同一反应容器中同时或顺序进行。通常，在TheAlcoholTextbook第三版，AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries,编辑Jacques等，(1999)NottinghamUniversityPress,UK中描述了发酵方法。在一些优选实施方案中，醪液与酵母在约15到约40。C、约20到约38°C，还在约25到约35°C的温度下；在约pH3.0到约6.5;还在约pH3.0到约6.0;约pH3.0到约5.5、约pH3.5到约5.0，并且还在约pH3.5到约4.5的pH范围中发酵约5小时到约120小时，优选约12到约120并更优选约24到约90小时，产生醇产物，优选乙醇。通常以每ml发酵液104到1012，优选107到10"个活酵母菌数的量供应酵母细胞。发酵除了发酵微生物(例如酵母)营养物外，还将包括任选的酸和额外的酶。在一些实施方案中，除了上述原料，发酵培养基将含有补充物，包括但不限于维生素(例如维生素H、叶酸、烟酸、核黄素)、辅因子和大量和微量营养素及盐(例如(NH4)2S04;K2HP04;NaCl;MgS04;H3B03;ZnCl2;和CaCl2)。在一些优选实施方案中，碾碎的植物材料包括大麦、高粱、玉米及其组合，并且接触和发酵步骤在3.5到5.5的pH范围、30围内同时进行48到90小时，其中至少50%的淀粉净皮溶解。回收醇和其它终产物本发酵方法的优选终产物是醇产物，优选乙醇。可从发酵培养基中分离和/或纯化根据本方法产生的终产物。分离和纯化方法是已知的，例如通过使培养基进行提取、蒸馏和柱层析。在一些实施方案中，通过使培养基经过高压液相层析(HPLC)分析直接鉴定终产物。在其它实施方案中，例如通过离心将醪液分离成液相和固相，并回收终产物如醇和固体。通过例如蒸馏和分子筛脱水或超滤回收醇。在一些实施方案中，乙醇的产量以体积计将高于约8%、10%、12%、14%、16%和18%。根据本发明方法获得的乙醇可用作燃料乙醇、饮料乙醇或工业乙醇。17酒糟加可溶物(DDGS)，其可用作动物饲料。在其它实施方案中，通过使用本领域已知的适当发酵微生物，发酵终产物可包括但不限于甘油、1，3-丙二醇、葡糖酸、2-酮基-D-葡糖酸、2，5-二酮基-D-葡糖酸、2-酮基-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更尤其是当乳酸是想要的终产物时，可使用乳杆菌(干酪乳杆菌(L.casei));当甘油或1，3-丙二醇是想要的终产物时，可使用大肠杆菌；当2-酮基-D-葡糖酸、2，5-二酮基-D-葡糖酸和2-酮基-L-古洛糖酸是想要的终产物时，可使用柠檬泛菌作为发酵微生物。以上列表仅是实例，本领域技术人员将知道可适用于获得想要的终产物的许多发酵微生物。在以下实验7>开内容中，应用以下缩写eq(当量)；M(摩尔的)；jiM(微摩尔的)；N(正常)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；nmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克);mg(毫克)；kg(千克)；网(微克)；L(升);ml(毫升)；jil(微升);cm(厘米)；mm(毫米)；,(微米)；nm(纳米)；°C(摄氏度)；h(小时)；min(分);sec(秒);msec(毫秒)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；nCi(微居里);TLC(薄层层析)；Ts(曱苯磺酰基)；Bn(节基)；Ph(苯基)；Ms(曱磺酰基)；Et(乙基)、Me(曱基)。实施例在以下实施例中进一步详细描述了本发明，所述实施例旨在不以任何方式限制本发明的范围。认为附图是说明书的整体部分和本发明的描述。供以下实施例以阐明，但不限制本发明。在以下实施例中，所用的材料是去壳大麦(ThoroughbredLot1504-1，于2005年生长)获得于VirginiaFoundationSeedCenterFarmatMt.Holly,Virginia。通过USDAEasternRegionalResearchCenter(ERRC)进行去壳大麦的表征并总结于下表中(在干重基础上)。表l去壳大麦的化学及物理表征水分％(碾磨的米粒)7.85灰分％2.32油％1.92淀粉％59.89蛋白质％7.60《饗3.90酸性去污剂纤维(。/。ADF)5.47中性去污剂纤维(。/。NDF)17.22泮JL纤维(Y。CF)4.66Ibs/bu52.94商品化里氏木霉(Trichodermareesd)OPTIMASHTMBG(卩-葡聚糖酶)、酸稳定的a-淀粉酶、STARGENtm001(颗粒淀粉水解酶)、FERMGENtm(蛋白酶)来自GenencorDivision,ADaniscoCompany。实施例1该实施例说明了p-葡聚糖酶对粘度降低的影响使用大麦用于乙醇生产的具体问题是大麦醪液的粘度因P-葡聚糖含量成为了较高固体水平下的关键问题。大麦醪液的高粘度使得搅拌、液化、糖化和发酵在技术上变得困难并大大增加了操作成本。因此，对于大麦的干研磨发酵处理，需要非淀粉水解酶，如纤维素酶和p-葡聚糖酶用于降低粘度至可接受水平。检测的p-葡聚糖酶是OPTIMASIFMBG，其含有有效修饰并消化非淀粉碳水化合物——植物细胞壁的结构物质的酶组合。在30%DS制备大麦醪液并调整至pH3.6。在混和并调整pH后，将浆液转移到HaakeViscotesterVT550的测定管中。粘度计预热至57°C。在粘度测定开始时直接加入OPTIMASHtmBG。在57。C的温度下开始启动粘度计并允许运行90分钟。90分钟后，温度降至32°C(发酵温度)，粘度计保持运行额外30分钟。图1显示了浆液的粘度谱。结果表明OPTIMASHtmBG帮助降低了大麦醪液的粘度。此外，对照在没有OPTIMASIFMBG的情况下运行。粘度计不能达到57。C测试温度，因为转子在54。C停止，表明对照醪液对于测定而言过于粘稠。用OPTIMASHTMBG处理大麦浆液可以有效减少与含有高水平卩-葡聚糖的浆液相关的粘度问题。粘度的降低可以解决泵送并处理醪液的问题。实施例2以下实施例详细描述了颗粒淀粉水解酶(GSHE)用于大麦发酵的用途。在典型的干研磨谷粒乙醇生产中，首先碾碎整个谷粒，然后进行处理而不将谷粒的多种成分分离出去。碾碎的谷粒与水和成浆液。加入a淀粉酶和P葡聚糖酶后，在58-60。C蒸煮浆液以降低大麦醪液的粘度。然后在高温(85-88°C)蒸煮所述浆液以在称作液化的过程中使淀粉胶化并液化。高温也降低了所得醪液中的微生物污染物水平。液化后，冷却醪液并加入第二种酶(葡糖淀粉酶)以在称作糖化的过程中将液化的淀粉转化成可发酵糖(葡萄糖，也称为右旋糖)。向醪液中加入酵母，以将糖发酵成乙醇和二氧化碳。该过程称作发酵。图2说明了常规大麦到乙醇的生产过程。通常，这是能量密集过程，其需要向淀粉颗粒浆液中加入热能直至超过淀粉的胶化温度。在Genencor，我们已经开发了酶产品的STARGENtm系，其为用于有效水解颗粒(未蒸煮的)状态中淀粉的低能过程中的颗粒淀粉水解酶。该新技术具有消除需要淀粉高能处理并提供成本更有效的葡萄糖生产用于转化成乙醇和其它生物产品及生物材料的可能性。因为能在同一容器中同时进行多个谷粒处理步骤(液化、糖化和发酵)，该方法也具有在乙醇设施中降低设备和投资成本的能力。产品的STARGENtm系包括酶的混合物，其对颗粒淀粉具有协同活性。混合物包括a淀粉酶和葡糖淀粉酶，其可根据底物在淀粉颗粒中"钻"孔或"剥落"淀粉颗粒。在该文中，我们对大麦发酵应用该新的酶才支术。20制备27-30%DS碾磨的去壳大麦并使用硫酸调整pH至3.6。以等同于每p屯谷粒(kg/吨)0.2kg的剂量向浆液加入OPTIMASHTMBG，并以0.13kg/吨加入酸稳定的a淀粉酶(t-57。C，pH=3.6)(见表2-粘度降低情况)。然后将浆液置于57。C水浴中1.5小时。在温育过程中，用高架混合机轻轻搅拌浆液。大麦淀粉在57。C不被胶化，所述温度低于大麦的胶化温度。在该步骤中没有观察到粘度问题。表3显示了去壳大麦HPLC谱、上清液Brix和％溶解的结果。HPLC组成显示19.78%葡萄糖、20.90%DP2、8.80。/oDP3和50.53。/o更高级的糖。28.4%的大麦淀粉#皮溶解。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>加入400ppm尿素的情况下，同时进行糖化和发酵(SSF)。在每一剂量下，以一式三份进行发酵。以1.56kg/吨STARGENtm001和0.1kg/吨FERMGENTM加入酶。在多个时间间隔，取出啤酒样品用于HPLC分析。图3概述了发酵过程中的乙醇生产。结果显示发酵在45-50小时内结束，产生11.80%v/v乙醇。在另一实验中，使用30。/oDS去壳大麦。同样，没有粘度问题。图4概述了30。/。DS去壳大麦发酵的结果。尤其是，在发酵过程中葡萄糖浓度保持非常低(0.048-0.067%)的事实(见表4中用STARGENtm001进行发酵期间的HPLC结果)将导致增加活性酵母群并限制不想要的污染孩t生物的生长。使用STARGENTM酶对颗粒淀粉的直接转化允许非常低的可溶性固体的极高比重发酵。这显著降低了酵母的渗透应力并可导致更高浓度的乙醇和最终蒸馏步骤中更高的吞吐量。所施加的更低的渗透应力也导致酵母产生更低水平的废物，像甘油，并且降低的甘油生产使得更多的葡萄糖被转化成乙醇。表4用STARGENtm001发酵期间的HPLC结果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>除了以上剂量的STARGENtm和FERMGENtm，在发酵过程中以0.1kg/吨加入OPTIMASHTMBG对乙醇产量没有影响，如图5中所示。然而，在SSF步骤中加入OPTIMASHtmBG具有进一步降低醪液粘度的益处，因此改善下游处理。通常，STARGENTM酶技术(图6)为乙醇生产提供了多种潜在的益处，所述技术能够通过SSF过程中淀粉解聚成葡萄糖将不可溶颗粒(未蒸煮的)淀粉水解成可发酵糖。上述结果清楚地证明了利用STARGENTM酶消除了喷射蒸煮(jetcooking),其可导致明显的能量节省。此外，STARGENtm方法比表5中所见的常规方法产生更高的乙醇产量(14.87%相比于14.60%)(ComparisonofHulledBarleyFermentation)。对于STARGENtm方法，可获得0.538kg乙醇/kg淀粉，对应于95.8%的发酵效率。表5去壳大麦发酵的比较乙醇。/oV/V标准差％常规方法14.600.08STARGENtm方法14.870.06实施例3该实施例描述了DDGS在残留淀粉、P-葡聚糖和肌醇六磷酸方面的表征。发酵后，在强制空气烘箱中将啤酒干燥以获得DDGS。然后测定残留的淀粉含量、P-葡聚糖和肌醇六磷酸。DDGS中的残留淀粉和P-葡聚糖总结于表6中(DDGS中的残留淀粉和P-葡聚糖含量)。可以看出，常规方法产生低于1%的残留淀粉，而STARGENTM方法产生2.5%的残留淀粉，表明在SSF过程中淀粉的极好转化。去壳大麦中的p-葡聚糖含量是3.90y。并且SSF后的残留p-葡聚糖水平在0.3-0.4%之间。换言之，高于95%的P-葡聚糖被水解，导致具有极低水平p-葡聚糖的DDGS。表6DDGS中的残留淀粉和P-葡聚糖残留淀粉％p-葡聚糖。/。STARGENtm方法2.510.37常规方法0.960.39玉米的干研磨发酵通常产生含有高水平肌醇六磷酸的DDGS，因为肌醇六磷酸中存在的磷酸盐因单胃动物有限的消化能力而不能得到利用，所以从动物饲料制剂观点看，高水平的肌醇六磷酸是不想要的。因而，来自粪肥中携带的未使用肌醇六磷酸的进入土壤中的显著量的磷因来自动物粪便，尤其是来自猪和家禽的粪便对环境的污染已经成为一些国家关注的问题。有趣的是，在大麦STARGENtm方法中，由于推测在57°C下1.5小时的粘度降低步骤过程中内源大麦肌醇六磷酸酶对肌醇六磷酸的水解，从酵母发酵中所得的DDGS基本上没有肌醇六磷酸(去壳大麦样品中的肌醇六磷酸是0.36。/。)。因而，大麦STARGENTM方法能够产生含有减少的j3-葡聚糖且没有肌醇六磷酸的DDGS。清楚地证明了使用非淀粉水解酶和STARGENTM酶技术用于大麦发酵的优势更高的乙醇产量、含有减少的P-葡聚糖并且不含有肌醇六磷酸的DDGS、用更少的步骤消除了喷射蒸煮、更少的资产装备和更少的能量。同时，发酵罐中低浓度的可发酵糖导致增加活性酵母群，和SSF的低pH，限制了不想要的污染微生物的生长。这些结果表明STARGENtm醉与非淀粉粘度降低酶的使用允许乙醇生产者更多工具，其将帮助在增加总的工厂产量和吞吐量的同时处理谷粒浆液成为乙醇。应理解此处所述的实施例和实施方案仅为说明性目的，并且多种修改或改变将被暗示给本领域技术人员，并且包括在该申请的精神和范围和所述权利要求的范围内。此处引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的特此引入作为参考。权利要求1.水解来自碾碎的植物材料的淀粉的方法，其包括将碾碎植物材料的浆液与葡糖淀粉酶和微生物α-淀粉酶的酶组合在低于该碾碎植物材料中颗粒淀粉的初始胶化温度的温度下接触，以获得可发酵糖，其中所述碾碎的植物材料包含内源肌醇六磷酸酶。2.权利要求1的方法，其还包括在发酵微生物的存在下将所述可发酵糖发酵成终产物。3.权利要求l的方法，其中所述酶组合还包括p-葡聚糖酶。4.权利要求1的方法，其中所述低于初始胶化温度的温度为约250C到约77°C。5.权利要求1的方法，其中所述低于初始胶化温度的温度为约50。C到约80。C。6.权利要求2的方法，其中所述终产物是DDGS并且所述DDGS基本上没有肌醇六磷酸。7.权利要求3的方法，其中所述终产物是DDGS并且所述DDGS基本上没有p-葡聚糖。8.权利要求6的方法，其中所述DDGS用作动物伺料。9.权利要求7的方法，其中所述DDGS用作动物饲料。10.权利要求1的方法，其中所述碾碎的植物材料是大麦、小麦或黑麦。11.权利要求1的方法，其中所述酶组合物还包含至少一种次要酶，其选自第二种葡糖淀粉酶、第二种a淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、支链淀粉酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、p-葡聚糖酶、环糊精反式转糖基酶、P-淀粉酶及其组合。12.权利要求l的方法，其中所述浆液的pH为约pH3到约pH7。13.权利要求1的方法，其中所述浆液与酶组合物保持接触约2小时到约240小时。14.权利要求l的方法，其中所述酶组合是混合物。15.权利要求l的方法，其中所述酶组合不是混合物。16.权利要求2的方法，其中所述碾碎的植物材料包括大麦、高粱、玉米或其组合，并且所述接触步骤和发酵步骤在约3.5到约5.5的pH范围内，约30到约45。C的温度范围内同时进行约48到约卯小时，其中至少约50%的淀粉纟皮溶解。17.权利要求2的方法，其中所述终产物是乙醇并且所述产量高于约8%。18.从碾碎的植物材料发酵乙醇的方法，其包括将碾碎的植物材料的浆液与葡糖淀粉酶和微生物a-淀粉酶的酶组合在低于该碾碎的植物材料中颗粒淀粉的初始胶化温度的温度下接触，以获得可发酵糖，其中所述碾碎的植物材料包含内源肌醇六磷酸酶；和在发酵微生物存在下将可发酵糖发酵成乙醇。19.权利要求18的方法，其中所述酶组合还包括p-葡聚糖酶。20.权利要求18的方法，其中所述发酵还导致产生具有减少的肌醇六磷酸和p-葡聚糖的DDGS。21.权利要求20的方法，其中所述DDGS用于动物饲料。专利摘要本文描述的是制备含有降低水平的β-葡聚糖和肌醇六磷酸的DDGS的方法，所述DDGS适合用于动物饲料。文档编号C12P19/20GKCN101680005SQ200880007886公开日2010年3月24日申请日期2008年3月12日发明者G·科普涅茨尼-扬达,J·K·舍蒂,P·特尼塞恩,勉李申请人:丹尼斯科美国公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan