专利名称:一种肝素钠的提取方法
技术领域：
本发明方法涉及猪小肠粘膜深加工技术领域：
，具体涉及一种肝素钠的提取方法， 是一种以猪小肠粘膜为原料，通过生物酶解技术.从而提取肝素钠的方法。
背景技术：
肝素钠Ofeparin Sodium)是粘多糖硫酸酯类抗凝血药。它是从猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。近年来研究证明肝素钠还有降血脂作用。
肝素钠是目前世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其中在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素钠除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床用途，包括降血脂作用、 抗中膜平滑肌细胞(SMC)增生、促进纤维蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素是由肝素原料药作为原料进一步加工成的一大类抗血栓的药物，具有更为广泛的临床医学用途，成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物。肝素是世界上迄今已知的分子结构最复杂的化合物，短期内无法通过人工化学合成，目前只有来源于猪小肠粘膜的肝素钠能够用于临床治疗。肝素原料药的原料是肝素粗品，其提取只能源自健康生猪的小肠粘膜，由于含有大量杂质蛋白、杂质核酸以及杂质微生物等，需经过物理和化学提取分离过程，定向获取天然结构基团完整的肝素，从而制成肝素钠原料药。肝素钠原料药是标准肝素制剂的唯一有效成分和低分子肝素原料的生产起点，目前肝素制剂只有按照注射给药方式用于临床，这使得肝素原料药需要有很高的纯度，方可保证制剂的用药安全。 本品不论在体内或体外，都有迅速的抗凝血作用。
传统生产肝素钠的方法一般如下猪小肠粘膜酶解、树脂吸附、洗涤、洗脱、沉淀、 精制。此工艺树脂吸附难，时间长，产品收率低、效价低。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种肝素钠的提取方法， 是一种以简化工艺、提高收率、节能省时为目的而开发出来的新方法，该方法有利于工业化生产。
为了实现上述技术目的，本发明的一种肝素钠的提取方法的步骤如下
1、酶解称取健康猪的小肠粘膜作为原料，投入反应釜，加入原料重量的0. 5%的酶活力为3. 5万U/g的牛胰脂肪酶，混勻后调至pH8. 0-9. 0，升温至45_50°C，恒温搅拌酶解 2. 8h，酶解过程中控制反应体系的pH值稳定；
2、灭酶将所得酶解液升温至90°C，维持IOmin灭酶，然后立即冷却；
3、过滤冷却液用过滤机过滤两次，先用孔径为2μπι的滤膜粗滤，再用孔径为 0. 22 μ m的滤膜过滤，以除去杂质，得过滤液；
4、酶解蛋白质将过滤液调至pH7. 5-9.0，然后升温至45_55°C，加入原料重量的0. 5%的风味蛋白酶(酶活力为3. 8万U/g)，在45-55°C搅拌酶解4_6h，酶解过程中控制反应体系的PH值稳定，然后将酶解液升温至90°C，维持IOmin以灭酶，然后立即冷却，得冷却液；
5、除蛋白将冷却液用滤膜孔径为5nm的过滤机过滤以除去蛋白质并浓缩，得浓缩液；
6、沉淀向浓缩液中加入与其等体积的95wt%乙醇，搅拌均勻后沉淀10h，然后除去上清液，收集沉淀，沉淀中加入与其等体积的无水乙醇脱水，脱水后冷冻干燥得肝素钠粗
P
m ；
7、精制加入9倍粗品重量的纯水将粗品溶解，然后调PH至1.5，过滤除杂，所得滤液再调PH至11，记下此时溶液的体积，再按此体积的4 %加入30wt %过氧化氢，250C下放置氧化，注意控制反应体系的PH稳定在11，氧化30h后，调pH至6. 5，然后加入与此时的溶液等体积的95wt%乙醇，搅拌均勻后静置沉淀10h，然后除去上清液，向沉淀中加入与其等体积的无水乙醇进行脱水，然后过滤掉乙醇得沉淀，沉淀经晾晒蒸发去残留乙醇，再真空干燥得肝素钠精品。
本发明方法中用于调节和控制pH值的酸碱分别为35-37wt%的盐酸和固体氢氧化钠。
与现有技术相比，本发明方法的优点和有益效果如下
1、采用微孔过滤，更有效地去除了酶解液中的杂质；
2、剔除了传统工艺中树脂吸附的繁琐操作，工艺简单，国内尚未见有关报道；
3、生产周期短、成本低、不产生任何有毒有害物质，安全，无毒副作用。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明方法做进一步的详细说明。
下述实施例中用于调节和控制pH值的酸碱分别为35-37wt%的盐酸和固体氢氧化钠。
实施例1
一种肝素钠的提取方法，其步骤如下
1、酶解称取健康猪的小肠粘膜Ikg为原料，投入反应釜，加入5g酶活力为3. 5万 U/g的牛胰脂肪酶，混勻后调至pH8. 0，升温至50°C，恒温搅拌酶解2-池，酶解过程中控制反应体系的PH值稳定；
2、灭酶将所得酶解液升温至90°C，维持IOmin灭酶，然后立即冷却；
3、过滤冷却液用过滤机过滤两次，先用孔径为2μπι的滤膜粗滤，再用孔径为 0. 22 μ m的滤膜过滤，以除去杂质，得过滤液；
4、酶解蛋白质将过滤液调至pH7. 5，然后升温至55°C，加入5g风味蛋白酶(酶活力为3.8万U/g)，在55 °C下搅拌酶解4h，酶解过程中控制反应体系的pH值稳定，然后将酶解液升温至90°C，维持IOmin以灭酶，然后立即冷却，得冷却液；
5、除蛋白将冷却液用滤膜孔径为5nm的过滤机过滤以除去蛋白质并浓缩，得浓缩液；
6、沉淀向浓缩液中加入与其等体积的95wt%乙醇，搅拌均勻后沉淀10h，然后除
4去上清液，收集沉淀，沉淀中加入与其等体积的无水乙醇进行脱水，脱水后冷冻干燥得肝素钠粗品7g ；
7、精制加入63g纯水将粗品溶解，然后调pH至1. 5，过滤除杂，所得滤液再调pH 至11，记下此时溶液的体积，再按此体积的4%加入30wt%过氧化氢，25°C下放置氧化，注意控制反应体系的PH稳定在11，氧化30h后，调pH至6. 5，然后加入与该溶液等体积的 95wt%乙醇，搅拌均勻后静置沉淀10h，除去上清液，沉淀中加入与其等体积的无水乙醇进行脱水，然后过滤掉乙醇得沉淀，沉淀经晾晒蒸发去残留乙醇，再真空干燥得肝素钠精品 4g。所得产品的检测报告见表1。
表1实施例1所得产品的检测报告
检测项目标准规定检测结果性状白色或类白色粉末白色粉末pH值(1衬%水溶液)5. 5-8. 07. 3吸光度(0.物丨%水溶液)彡0. 20 (260nm)；彡0. 13(260nm)；彡 0. 15(280nm)彡0. 09 (280nm)干燥失重彡5%3. 2%炽烧残渣28. 0%-41. 0%33. 0%蛋白质含量彡 2. 5%1. 1%重金属含量(以1 元素计)<3. Oppm0. 5ppm含硫量(以S元素计)彡 10. 0%16%效价(USP)彡150U/mg160U/mg
实施例2
一种肝素钠的提取方法，其步骤如下
1、酶解称取健康猪的小肠粘膜2kg为原料，投入反应釜，加入IOg酶活力为3. 5 万U/g的牛胰脂肪酶，混勻后调至pH8. 3，升温至48°C，恒温搅拌酶解2.他，酶解过程中控制反应体系的PH值稳定；
2、灭酶将所得酶解液升温至90°C，维持IOmin灭酶，然后立即冷却；
3、过滤冷却液用过滤机过滤两次，先用孔径为2μπι的滤膜粗滤，再用孔径为 0. 22 μ m的滤膜过滤，以除去杂质，得过滤液；
4、酶解蛋白质将过滤液调至PH8.0，然后升温至52°C，加入IOg风味蛋白酶(酶活力为3. 8万U/g)，在52°C搅拌酶解4. 5h，酶解过程中控制反应体系的pH值稳定，然后将酶解液升温至90°C，维持IOmin以灭酶，然后立即冷却，得冷却液；
5、除蛋白将冷却液用滤膜孔径为5nm的过滤机过滤以除去蛋白质并浓缩，得浓缩液；
6、沉淀向浓缩液中加入与其等体积的95wt%乙醇，搅拌均勻后沉淀10h，然后除去上清液，收集沉淀，沉淀中加入与其等体积的无水乙醇脱水，脱水后冷冻干燥得肝素钠粗品 16g ；
7、精制加入144g纯水将粗品溶解，然后调pH至1.5，过滤除杂，所得滤液再调 PH至11，记下此时溶液的体积，再按此体积的4%加入30wt%过氧化氢，25°C下放置氧化， 注意控制反应体系的PH稳定在11，氧化30h后，调pH至6. 5，然后加入与该溶液等体积的95wt %乙醇，搅拌均勻后静置沉淀10h，除去上清液，沉淀中加入与其等体积的无水乙醇进行脱水，然后过滤掉乙醇得沉淀，沉淀经晾晒蒸发去残留乙醇，再真空干燥得肝素钠精品 7g。所得产品的检测报告见表2。 表2实施例2所得产品的检测报告
权利要求
1. 一种肝素钠的提取方法，其步骤如下A、酶解称取健康猪的小肠粘膜作为原料，投入反应釜，加入原料重量的0.5%的比活力为3. 5万U/g的牛胰脂肪酶，混勻后调至pH8. 0-9. 0，升温至45_50°C，恒温搅拌酶解 2. 8h，酶解过程中控制反应体系的pH值稳定；B、灭酶将所得酶解液升温至90°C，维持IOmin灭酶，然后立即冷却；C、过滤冷却液用过滤机过滤两次，先用孔径为2μ m的滤膜粗滤，再用孔径为0. 22 μ m 的滤膜过滤，以除去杂质，得过滤液；D、酶解蛋白质将过滤液调至pH7.5-9. 0，然后升温至45-55°C，加入原料重量的0. 5% 的比活力为3. 8万U/g风味蛋白酶，在45-55°C搅拌酶解4_6h，酶解过程中控制反应体系的 PH值稳定，然后将酶解液升温至90°C，维持IOmin以灭酶，然后立即冷却，得冷却液；E、除蛋白将冷却液用滤膜孔径为5nm的过滤机过滤以除去蛋白质并浓缩，得浓缩液；F、沉淀向浓缩液中加入与其等体积的95wt%乙醇，搅拌均勻后沉淀10h，然后除去上清液，收集沉淀，沉淀中加入与其等体积的无水乙醇脱水，脱水后冷冻干燥得肝素钠粗品；G、精制加入9倍粗品重量的纯水将粗品溶解，然后调pH至1.5，过滤除杂，所得滤液再调pH至11，记下此时溶液的体积，再按此体积的4%加入30wt%过氧化氢，25°C下放置氧化，注意控制反应体系的PH稳定在11，氧化30h后，调pH至6. 5，然后加入与此时的溶液等体积的95wt%乙醇，搅拌均勻后静置沉淀10h，然后除去上清液，向沉淀中加入与其等体积的无水乙醇进行脱水，然后过滤掉乙醇得沉淀，沉淀经晾晒蒸发去残留乙醇，再真空干燥得肝素钠精品。
专利摘要
本发明公开了一种肝素钠的提取方法，该方法采用健康猪的小肠粘膜为主要原料，经过酶解、灭酶、过滤、酶解蛋白、除蛋白、沉淀、精制、干燥后即获肝素钠。本发明方法生产周期短、成本低、收率高，不产生任何有毒有害物质，而且所得产品安全性高，可用于药品领域。
文档编号C08B37/10GKCN102070727 B发布类型授权 专利申请号CN 201010609844
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月28日
发明者叶传发, 叶思, 张小东 申请人:湖北远成药业有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3),