专利名称:用fq-pcr检测嗜水气单胞菌的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法，属化学中包含酶或微生物的测定或检验方法。
背景技术：
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)在自然界中分布广泛,普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，可致各类动物感染，而人在感染嗜水气单胞菌时会发生食物中毒、腹泻等症状，并且是免疫抑制患者和肝功能疾病患者的机会致病菌，是一种典型的人、兽、鱼共患病病原菌。嗜水气单胞菌除了对水产养殖业带来巨大经济损失外，其对公共卫生，尤其是在临床疾病和食品安全方面的影响也非常严重。
传统的嗜水气单胞菌的检测方法是生理生化鉴定和免疫学诊断，但由于该菌的许多生化特征不稳定，血清型也较复杂，故易产生误判。因此已有多项嗜水气单胞菌的PCR检测方法方面的报道，如中国发明专利申请“水产动物及人类病原菌——嗜水气单胞菌基因诊断试剂盒及检测方法(公开号CN1560275) ”、中国发明专利申请“水生实验动物剑尾鱼病原菌嗜水气单胞菌PCR检测试剂盒及检测方法(公开号CN1978665) ”、中国发明专利申请“嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒及其检测方法(公开号CN1506468) ”、中国发明专利申请“一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测试剂盒和检测方法(公开号CN101736073A) ”和中国发明专利申请“致病性嗜水气单胞菌检测用试剂及其检测方法(公开号CN101418335) ”等，但上述所有关于嗜水气单胞菌的PCR检测方法都是普通的PCR检测，而且都为定性测定而不能定量测定。
又有采用PQ-PCR检测嗜水气单胞菌方法的相关报道，如“嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测方法的建立” (王海波等，《中华预防医学杂志》，43(7)，611-614)所公开的。针对细菌的种特异性基因采用PCR技术进行快速检测是近年来病原菌检测的热点，与常规PCR相比，实时荧光定量PCR检测技术具有特异性更强、敏感度更高、操作简便快捷、可定性定量、且可有效解决常规PCR污染问题等优点。但该公开技术中的引物设计的对象为嗜水气单胞菌的气溶素基因(aerolysin)和粘附素基因(adhesins)。
大量研究表明，嗜水气单胞菌有致病菌株和非致病菌株之分，尽管嗜水气单胞菌及其胞外产物具有多种毒力因子，包括:粘附素(adhesins)、侵袭素(invasions)、肠毒素(enterotoxins)、溶血素(hlyA)、气溶素(aerolysin)、外膜蛋白(outermembraneproteins)、丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)等，这些毒力因子在细菌的致病过程中起重要作用，不过这些毒力因子在对机体致病作用的发挥上是相互协同的，有些毒力因子的存在并不一定会致病而需要多种毒力因子的协同才会致病，而有些毒力因子只要存在便肯定是致病的。其中溶血素基因(hlyA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)就是只有致病的嗜水气单胞菌菌株所具备的，即嗜水气单胞菌无毒力菌株一般没有溶血素基因(hlyA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)，因此测定溶血素基因(hlyA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)对辨别有毒力的嗜水气单胞菌从而在应急预警和突发疾病处理方面具有更大的应用价值。
发明内容
针对上述不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种针对仅存于有毒力菌株的DNA的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法。
本发明提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法之一，先制备嗜水气单胞菌模板DNA，再进行扩增反应，即将准备好的扩增反应液加入模板DNA中，然后在PCR仪上进行扩增反应并获得数据供计算机进行计算，最后判断结果，所说扩增反应液中包括针对仅存于有毒力的嗜水气单胞菌菌株中的因子的上、下游引物，其中上游引物的DNA序列为5’ -ACCGCA AGA TCA ACG ATA CCG AGT-3’，下游引物的 DNA 序列为 5’-ATC CAG CGA GAT CCG CACTAT CTT-3’。
所说扩增反应液中还包括TaqMan探针，该TaqMan探针的DNA序列为5’本发明提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法之二，先制备嗜水气单胞菌模板DNA，再进行扩增反应，即 将准备好的扩增反应液加入模板DNA中，然后在PCR仪上进行扩增反应并获得数据供计算机进行计算，最后判断结果，所说扩增反应液中包括针对仅存于有毒力的嗜水气单胞菌菌株中的因子的上、下游引物，其中上游引物的DNA序列为5’ -ACCCAG GAC GGT GCG ATA TAA GAT-3’，下游引物的 DNA 序列为 5’_TCT CAC TTG CCT GAA CTGAAG CGA-3，。
所说扩增反应液中还包括TaqMan探针，该TaqMan探针的DNA序列为5’本发明提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法之三，先制备嗜水气单胞菌模板DNA，再进行扩增反应，即将准备好的扩增反应液加入模板DNA中，然后在PCR仪上进行扩增反应并获得数据供计算机进行计算，最后判断结果，整个步骤以平行的两组实验同时进行，其中之一所说扩增反应液中包括DNA序列为5’-ACC GCA AGA TCA ACG ATA CCG AGT-3’的上游引物，DNA序列为5’ -ATC CAG CGA GAT CCG CAC TAT CTT-3’的下游引物，DNA序列为 5’ -(FAM) -AAC ATC TCG CTG GTT TAC CGG GTC AA-(TAMRA)-3’ 的 TaqMan 探针；其中之二所说扩增反应液中包括DNA序列为5’ -ACC CAG GAC GGT GCG ATA TAA GAT-3’的上游引物，DNA序列为5’ -TCT CAC TTG CCT GAA CTG AAG CGA-3’的下游引物，DNA序列为5’本发明提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法，应用FQ-PCR方法和针对仅存于有毒力的嗜水气单胞菌中的因子的上下游引物对模板中是否存在有毒力的嗜水气单胞菌进行检测，与现有技术相比，由于所针对的因子是有毒力的嗜水气单胞菌株所特有的，因此可准确地检定试样中是否存在有毒力的嗜水气单胞菌株，从而提高疾病预警的准确性。同时，通过所说方法一或方法二检测出模板中含有溶血素基因(hlyA)或丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)，则表明其含有一定致病性，而通过方法三检测出模板中含有溶血素基因(hlyA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)，则表明其含有较高致病性。方法之三实质上是用方法一和方法二对同一个样品进行检测，当目标菌株同时具有2种毒力基因时可以判定其为强毒株嗜水气单胞菌；仅具有2种毒力基因之一时可以判定其为弱毒株嗜水气单胞菌；2种毒力基因均未检出时可以判定其为非致病性株嗜水气单胞菌。[0013]本发明提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法，应用了以下试剂盒:该试剂盒，试剂盒所装试剂中有:
①2x Premix EX Taq 反应液:由 Taq 酶、buffer、dNTP Mixture、Mg2+混合而成；
②上游引物；
③下游引物；
④TaqMan 探针。
所说试剂盒中下述试剂的包装量为其一次实验量的相同倍数:
2x Premix EX Taq 反应液一次实验量为 10 μ I ;
上、下游引物的浓度为5 μ Μ，一次实验量为0.4μ I ；
TaqMan探针的浓度为2.5 μ Μ，一次实验量为0.4 μ I。
所说试剂盒中所包装的试剂中，上、下游引物及TaqMan探针有甲乙两组中的一组或两组，其中甲组是:DNA序列为5’-ACC GCA AGA TCA ACG ATA CCG AGT-3’的上游引物，DNA序列为 5，-ATC CAG CGA GAT CCG CAC TAT CTT-3，的下游引物，DNA 序列为 5，- (FAM) -AACATC TCG CTG GTT TAC CGG GTC AA-(TAMRA)-3’ 的 TaqMan探针；乙组是:DNA序列为 5’_ACCCAG GAC GGT GCG ATA TAA GAT -3’ 的上游引物，DNA 序列为 5’ -TCT CAC TTG CCT GAACTGAAG CGA-3，的下游引物，DNA 序列为 5’-(FAM)-AAC ATC GTT AGC GTT GGC AAT CTCGG-(TAMRA)-3’的TaqMan探针；有两组时2x Premix EX Taq反应液的包装量是其他试剂反应量的两倍。即试剂盒内2x Premix EX Taq反应液可满足两组上、下游引物及TaqMan探针反应所需要的量。
具体实施方式
本发明方法的检测具体步骤为:
一、样品中DNA提取(模板制备):
①取样品悬浮液上清Iml加入到1.5ml无菌eppendorf离心管中，在转速为15000r/min下离心2min后，吸弃上清,保留沉淀；
②沉淀中加入DNA提取剂50 μ 1，将沉淀与DNA提取剂混匀后升温到100°C加热处理2min。所说DNA提取剂由重量体积百分比为0.9%的NaCl、重量体积百分比为0.01%的SDS、体积百分比为0.1%的β -巯基乙醇、其余为水构成；
③继以在转速为15000r/min下离心2min，所得上清即为PCR需用模板。
二、PCR
1、扩增反应液准备:
①从冰箱中取出试剂盒；
试剂盒有分别用试剂瓶密封包装的试剂，包装清单为:
5 μ M上游引物甲4 μ I，上游引物甲的DNA序列为5 ’ -ACC GCA AGA TCA ACG ATACCG AGT-3，；
5μΜ下游引物甲4μ I，下游引物甲的DNA序列为5’ -ATC CAG CGA GAT CCG CACTAT CTT-3，；
2.5 μ M TaqMan 探针甲 4 μ I，TaqMan 探针甲的 DNA 序列为 5 ’5μ M下游引物乙4 μ 1，下游引物乙的DNA序列为5’-TCT CAC TTG CCT GAA CTGAAG CGA-3，；
2.5 μ M TaqMan 探针乙 4 μ I，TaqMan 探针乙的 DNA 序列为 5 ’2x Premix EX Taq 反应液 200 μ I ；
无菌双蒸水136μ1;
DNA提取剂100 μ I也包装在试剂盒内，用于模板制备。
②根据每个PCR反应管内所需的2x Premix EX Taq反应液10 μ I (内含Taq酶、buffer、dNTP Mixture, Mg2+ 等)、5 μ M 上游引物、5 μ M 下游引物、2.5 μ M TaqMan 探针各
0.4 μ 1、无菌双蒸水6.8 μ I,按实验所需的反应管数,计算出所需的试剂量依次加入,涡旋混匀，按每管18 μ I分装到PCR反应用玻璃毛细管中。
2.加样:
①向每个分装好扩增反应液的PCR反应用玻璃毛细管中加入2 μ I模板；
②盖好PCR玻璃 毛细管盖，然后在转速为2000r/min下离心30s。
3、上机:
①开机，并进行仪器性能自检；
②将准备好的PCR反应用玻璃毛细管放置在仪器样本孔相应位置；
③在PCR仪器上设置好以下参数:
预变性:95°C 30秒一个循环；
扩增:变性95 °C 5秒、退火延伸63 °C 20秒共40个循环；
收集荧光信号:63°C，收集方式设为“单点收集(SINGLE) ” ；
仪器检测通道:F1 ；
温度变化速率:20°C /秒。
④选定后确定运行，开始进行PCR扩增。
4、阈值设定与检测结果判定:
①阈值设定原则为超过阴性对照扩增线(无规则噪音线)的最高点。
②ct值< 35时提示样本中含有嗜水气单胞菌hlyA基因，ct值在35 40之间提示为不确定样本需重新增菌后再次测定。
③无ct值显示则提示样本中不含有嗜水气单胞菌hlyA基因或数量极少低于检测限。
④若需定量检测时，要加入4飞个不同浓度的标准品与样本同时检测，荧光定量PCR仪会根据各个标准品测得的ct值绘制成标准曲线后仪器自动计算阳性标本的定量数据，并在电脑界面上显示浓度。
阴性与阳性对照不能正确显示Ct值则判定检测失败。
上述检测步骤为本发明的单个检测步骤，即本发明所说方法一和方法二以本检测步骤进行，而方法三分别以本检测步骤进行平行试验。
本发明方法用于嗜水气单胞菌模板DNA制备与扩增反应所需时间分别为5分钟与17分钟，从样本接收到结果报告仅需30分钟左右。而现有技术中用于嗜水气单胞菌检测的经典的实时荧光定量PCR检测全程通常仍需3小时左右。
本发明方法的灵敏度和批内重复性都很强，在特异度方面，本发明方法，除了嗜水气单胞菌外，在40个循环内对副溶血弧菌(ATCC33847，ATCC17802)、金黄色葡萄球菌(ATCC25723、ATCC29213)，大肠埃希菌(ATCC25922)、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、麦氏弧菌、0139群霍乱弧菌、01群霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、不凝集弧菌(NAG)、铜绿色假单胞菌、甲型副伤寒杆菌、鸭沙门氏菌、福氏志贺菌、宋氏志贺菌、肠出血型大肠埃希菌0157 (933)、单增李斯特菌的纯菌DNA提取液(模板)均无扩增现象。
本发明中一种用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的方法，针对hlyA基因。所用试剂盒中有 2x Premix EX Taq 反应液(内含 Taq 酶、buffer> dNTP Mixture、Mg2+ 等)100 μ 1、5μΜ DNA 序列为 5’-ACC GCA AGA TCA ACG ATA CCG AGT-3’的上游引物、5 μ M DNA 序列为5’-ATC CAG CGA GAT CCG CAC TAT CTT-3’的下游引物、2.5 μ M DNA 序列为 5’-(FAM)-AACATC TCG CTG GTT TAC CGG GTC AA-(TAMRA)-3’的 TaqMan 探针各 4 μ 1，分别密封在不同的试剂瓶中。操作方法按上述具体步骤进行。
本方法快速荧光定量PCR检测灵敏度:检出限为5.4 X IO1CfVml,在5.4 X IO3Cfu/ml —5.4X 108cfu/ml的范围内标准曲线呈良好的线性关系。
其批内重复性:4份不同浓度的嗜水气单胞菌DNA样本，每个浓度分成5份进行测试，通过用测定值的均值X计算ct值的标准差(S)和变异系数(cv)来验证批内重复性列于下表:
权利要求
1.一种用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的试剂盒，其特征是试剂盒所装试剂中有: ①2x Premix EX Taq 反应液:由 Taq 酶、buffer、dNTP Mixture、Mg2+混合而成； ②上游引物； ③下游引物； ④TaqMan探针； 所说上游引物、下游引物及TaqMan探针有甲乙两组中的一组或两组，其中: 甲组上游引物的DNA序列为5，-ACC GCA AGA TCA ACG ATA CCG AGT-3’，甲组下游引物的 DNA 序列为 5’-ATC CAG CGA GAT CCG CAC TAT CTT-3’，甲组 TaqMan 探针的 DNA 序列为 5’2.如权利要求
1所述的 试剂盒，其特征是所说试剂盒中下述试剂的包装量为其一次实验量的相同倍数: 2x Premix EX Taq反应液一次实验量为10 μ I ; 上、下游引物的浓度为5 μ Μ，一次实验量为0.4μ I ; TaqMan探针的浓度为2.5 μ M，一次实验量为0.4 μ I ; 有两组时2x Premix EX Taq反应液的包装量是其他试剂反应量的两倍。
专利摘要
本发明提供的用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌的试剂盒，所说试剂盒中所包装的试剂中，上、下游引物及TaqMan探针有甲乙两组中的一组或两组。与现有技术相比，由于所针对的因子是有毒力的嗜水气单胞菌株所特有的，因此可准确地检定试样中是否存在有毒力的嗜水气单胞菌株，从而提高疾病预警的准确性。同时，应用所说甲级或乙组试剂检测出模板中含有溶血素基因(hlyA)或丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)，则表明其含有一定致病性，而应用两组试剂检测出模板中含有溶血素基因(hlyA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)，则表明其含有较高致病性。
文档编号C12Q1/68GKCN102134598 B发布类型授权 专利申请号CN 201010608712
公开日2013年7月24日 申请日期2010年12月28日
发明者王志铮, 顾松叶, 杨阳, 王忠发, 赵蓓蓓 申请人:浙江海洋学院, 舟山市疾病预防控制中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (1),