肝素钠的常温无盐提取工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肝素钠的常温无盐提取工艺，所述工艺包括以下步骤：首先将肠粘膜粉碎，然后采用由蛋白酶、脂肪酶和核酸酶组成的复合酶制剂在常温无盐条件进行酶解，酶解后离心收集清液，使用合适的离子交换树脂吸附离心液中的肝素钠，使用高浓度的盐对滤液进行洗脱，再用酒精将洗脱液中的肝素钠沉淀下来，最后烘干得到肝素钠粗品。通过上述方式，本发明不仅可以在酶解和吸附阶段节约大量热能，减少能耗，降低生产成本；而且可以在无盐条件下实现肝素钠的酶解和吸附过程，从而使排放的废水中盐浓度降低，减少废水处理成本，提高环境效益。
【专利说明】肝素钠的常温无盐提取工艺【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药制作【技术领域】，特别是涉及一种利用猪小肠在常温无盐条件下提取肝素钠的工艺。
【背景技术】
[0002]肝素钠是一种酸性粘多糖，由动物结缔组织的肥大细胞产生分泌。医用肝素钠主要应用于抗凝血作用。肝素钠的粗提品中由于含有的杂质较多、样品不纯，不能直接作为临床药品应用。由于肝素钠粗品的质量在一定程度上决定了肝素钠精品的质量，因此肝素钠粗品的制备至关重要。肝素钠粗品的传统提取方法有以下几种:
[0003]1、盐析法提取:最早从猪小肠中提取肝素钠主要是利用盐析提取技术。肝素钠是一种糖胺聚糖，在体内主要与蛋白质和其他多糖物质结合在一起。盐析法在国内曾是最常用的提取方法，原料多以猪小肠粘膜或猪大肠腌液为主。盐析法的主要提取路线是:用碱性盐法将肝素钠从肝素钠与其他物质形成的复合物中分离出来，然后用强碱性阴离子交换树脂将解离出来的肝素钠负离子吸附，再用高浓度的盐水将肝素钠从树脂上洗脱下来，再经过乙醇沉淀、丙酮干燥等步骤得到肝素钠的粗品。
[0004]2、酶解法提取:肝素钠在动物组织中的主要存在形式是肝素-蛋白质复合物，肝素主要是以共价键的形式结合在蛋白质上，所以要从肝素-蛋白质复合物中分离提取肝素钠主要是要将肝素与蛋白质之间的结合断开，这样既可以将肝素分离出来，又有利于肝素在溶剂中的溶解和下一步的提取和分离。虽然肠粘膜自身就含有一些蛋白水解酶，可以自溶，但是需要的时间较长。为了缩短酶解时间，减少微生物的污染，在提取肝素钠的时候往往会加入蛋白水解酶。目前工业上`常用的提取肝素钠的酶为2709碱性蛋白酶，该酶可以将肝素-蛋白质中的蛋白质水解成小肽，从而使肝素分离出来，然后再用一定的方法除去蛋白质得到肝素钠。
[0005]3、超声波法:超声波法的主要作用机理是超声波振荡破坏细胞壁，扩大可溶性物质通过多孔透析膜，使多糖易于提取。在利用超声波法提取肝素钠的时候主要是运用超声波的机械效应和空化作用。超声波的机械作用可促成液体的乳化、凝胶的液化和固体的分散，当超声波流体介质中形成驻波时，悬浮在流体中的微小颗粒因受机械力的作用而凝聚在波节处，在空间形成周期性的堆积。超声波的空化作用是指超声波作用于液体的时候可以产生大量小气泡。一个原因是由于液体内局部出现拉应力而形成负压，压强的降低使原来溶于液体的气体过饱和，而从液体逸出，成为小气泡。另一原因是由于强大的拉应力把液体“撕开”成一空洞，称为空化。空洞内为液体蒸气或溶于液体的另一种气体，甚至可能是真空。因为空化作用形成的小气泡会随周围介质的振动而不断运动、长大或突然破灭。破灭时周围液体突然冲入气泡而产生高温、高压，同时产生激波。这种作用力能破坏细胞膜的结构，使细胞在瞬间破裂，超声波的这些作用都有利于肝素钠的提取。
[0006]目前，工业上利用猪小肠粘膜提取肝素钠粗品的主要工艺过程为:首先用酶消化盐浸过的猪小肠粘膜，再用合适的树脂吸附解离出的肝素钠，然后高盐洗脱，最后再用合适浓度的酒精沉淀，继而得到的就是肝素钠的粗品，粗品再经过一些处理才能得到精品。但是，目前工业上的酶解和吸附过程都必须在接近55°C的高温下进行才可以实现，而且在酶解和吸附过程中还要加入一定量的盐，这样会造成两方面的缺点:首先，高温的工艺过程不容易实现，且耗能高；其次，盐的加入不仅增加了生产成本，而且排放的高盐废水难以进行无害化处理，高盐废水可损伤水体的使用价值，危害人类健康。
【发明内容】
[0007]本发明主要解决的技术问题是提供一种肝素钠的常温无盐提取工艺，不仅可以在
酶解和吸附阶段节约大量热能，减少能耗，降低生产成本；而且可以在无盐条件下实现肝 素钠的酶解和吸附过程，从而使排放的废水中盐浓度降低，减少废水处理成本，提高环境效. Mo
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种肝素钠的常温无盐提取工艺，所述工艺包括以下步骤:
[0009]I)匀浆:将新鲜的小肠粘膜液按每付小肠加水5~6kg稀释后匀浆或搅碎得到小肠粘膜的匀浆液。
[0010]2)酶解:将所述匀浆液的pH调至8~9后加入复合酶制剂，在室温下，搅拌酶解2~4小时；
[0011]3)除杂:采用连续离心或压滤的方法弃去固态杂质，得到离心液；
[0012]4)吸附:将所述离心液的pH调至8.5左右，加入树脂，在28°C~30°C下，搅拌吸附6小时后收集树脂；
[0013]5)清洗及洗脱:将所述树脂用清水洗净，再用5%的盐水清洗掉部分杂质，清洗完后用23%~25%的盐水第一次洗脱树脂4小时，收集洗脱液；再用23%~25%的盐水第二次洗脱3小时，收集洗脱液并与第一次的洗脱液合并；最后再用21%的盐水对树脂进行第三次洗脱2小时，收集洗脱液留待下次使用；
[0014]6)醇沉及干燥:在第一次与第二次合并的洗脱液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小时后除去上清液，将得到的沉淀物烘干即得到肝素钠粗品。
[0015]其中，所述步骤2)中的每升匀浆液中加入0.5~2克复合酶制剂。
[0016]其中，所述复合酶制剂是蛋白酶:脂肪酶:核酸酶以10: 1.5~2.5: 0.4~
0.8的质量份比例混合而成的混合物。
[0017]其中，所述步骤4)中每升离心液中加入6克树脂。
[0018]其中，所述树脂为FPA98型树脂。
[0019]本发明的有益效果是:区别于现有肝素钠粗品提取方法中的酶解和吸附步骤需高温加盐条件，导致耗能高、生产成本高及高盐废水的污染情况，本发明采用由蛋白酶、脂肪酶和核酸酶组成的复合酶制剂对肠粘膜进行酶解，不仅可以在酶解和吸附阶段节约大量热能，减少能耗，降低生产成本；而且可以在无盐条件下实现肝素钠的酶解和吸附过程，从而使排放的废水中盐浓度降低，减少废水处理成本，提高环境效益。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施例对本发明进行详细说明。[0021]实施例1
[0022]I)匀浆:将新鲜的小肠粘膜液按每付小肠加水5~6kg稀释后匀浆或搅碎得到小肠粘膜的匀浆液；
[0023]2)酶解:取200升匀浆液，将匀浆液的pH调至8~9，然后加入100克复合酶制剂，在室温下，搅拌酶解4小时；复合酶制剂是蛋白酶:脂肪酶:核酸酶以10: 1.5: 0.4的质量份比例混合而成的混合物；
[0024]3)除杂:采用连续离心或压滤的方法弃去固态杂质，得到离心液；
[0025]4)吸附:将所述离心液的pH调至8.5左右，加入FPA98型树脂6g/L (基于离心液的体积，w/v)，在28°C~30°C下，搅拌吸附6小时后收集树脂；
[0026]5)清洗及洗脱:将树脂用清水洗净，再用5%的盐水清洗掉部分杂质，清洗完后用23%~25%的盐水第一次洗脱树脂4小时，收集洗脱液；再用23%~25%的盐水第二次洗脱3小时，收集洗脱液并与第一次的洗脱液合并；最后再用21%的盐水对树脂进行第三次洗脱2小时，收集洗脱液留待下次使用；
[0027]6)醇沉及干燥:在第一次与第二次合并的洗脱液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小时后除去上清液，将得到的沉淀物烘干即得到肝素钠粗品。
[0028]实施例2
[0029]I)匀浆:将新鲜的小肠粘膜液按每付小肠加水5~6kg稀释后匀浆或搅碎得到小肠粘膜的匀浆液；
[0030]2)酶解:取400升匀浆液，将匀浆液的pH调至8~9，然后加入280克复合酶制剂，在室温下，搅拌酶解3小时；复合酶制剂是蛋白酶:脂肪酶:核酸酶以10: 1.7: 0.5的质量份比例混合而成的混合物；
[0031]3)除杂:采用连续离心或压滤的方法弃去固态杂质，得到离心液；
[0032]4)吸附:将所述离心液的pH调至8.5左右，加入FPA98型树脂6g/L (基于离心液的体积，w/v)，在28°C~30°C下，搅拌吸附6小时后收集树脂；
[0033]5)清洗及洗脱:将树脂用清水洗净，再用5%的盐水清洗掉部分杂质，清洗完后用23%~25%的盐水第一次洗脱树脂4小时，收集洗脱液；再用23%~25%的盐水第二次洗脱3小时，收集洗脱液并与第一次的洗脱液合并；最后再用21%的盐水对树脂进行第三次洗脱2小时，收集洗脱液留待下次使用；
[0034]6)醇沉及干燥:在第一次与第二次合并的洗脱液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小时后除去上清液，将得到的沉淀物烘干即得到肝素钠粗品。
[0035]实施例3
[0036]I)匀浆:将新鲜的小肠粘膜液按每付小肠加水5~6kg稀释后匀浆或搅碎得到小肠粘膜的匀浆液；
[0037]2)酶解:取600升匀浆液，将匀浆液的pH调至8~9，然后加入600克复合酶制剂，在室温下，搅拌酶解2小时；复合酶制剂是蛋白酶:核酸酶:脂肪酶以10: 2: 0.6的质量份比例混合而成的混合物；
[0038]3)除杂:采用连续离心或压滤的方法弃去固态杂质，得到离心液；
[0039]4)吸附:将所述离心液的pH调至8.5左右，加入FPA98型树脂6g/L (基于离心液的体积，w/v)，在28°C~30°C下，搅拌吸附6小时后收集树脂；[0040]5)清洗及洗脱:将树脂用清水洗净，再用5%的盐水清洗掉部分杂质，清洗完后用23%~25%的盐水第一次洗脱树脂4小时，收集洗脱液；再用23%~25%的盐水第二次洗脱3小时，收集洗脱液并与第一次的洗脱液合并；最后再用21%的盐水对树脂进行第三次洗脱2小时，收集洗脱液留待下次使用；
[0041]6)醇沉及干燥:在第一次与第二次合并的洗脱液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小时后除去上清液，将得到的沉淀物烘干即得到肝素钠粗品。
[0042]实施例4
[0043]I)匀浆:将新鲜的小肠粘膜液按每付小肠加水5~6kg稀释后匀浆或搅碎得到小肠粘膜的匀浆液； [0044]2)酶解:取800升匀浆液，将匀浆液的pH调至8~9，然后加入1200克复合酶制剂，在室温下，搅拌酶解2小时；复合酶制剂是蛋白酶:核酸酶:脂肪酶以10: 2.2: 0.7的质量份比例混合而成的混合物；
[0045]3)除杂:采用连续离心或压滤的方法弃去固态杂质，得到离心液；
[0046]4)吸附:将所述离心液的pH调至8.5左右，加入FPA98型树脂6g/L (基于离心液的体积，w/v)，在28°C~30°C下，搅拌吸附6小时后收集树脂；
[0047]5)清洗及洗脱:将树脂用清水洗净，再用5%的盐水清洗掉部分杂质，清洗完后用23%~25%的盐水第一次洗脱树脂4小时，收集洗脱液；再用23%~25%的盐水第二次洗脱3小时，收集洗脱液并与第一次的洗脱液合并；最后再用21%的盐水对树脂进行第三次洗脱2小时，收集洗脱液留待下次使用；
[0048]6)醇沉及干燥:在第一次与第二次合并的洗脱液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小时后除去上清液，将得到的沉淀物烘干即得到肝素钠粗品。
[0049]实施例5
[0050]I)匀浆:将新鲜的小肠粘膜液按每付小肠加水5~6kg稀释后匀浆或搅碎得到小肠粘膜的匀浆液；
[0051]2)酶解:取1000升匀浆液，将匀浆液的pH调至8~9，然后加入2000克复合酶制剂，在室温下，搅拌酶解2小时；复合酶制剂是蛋白酶:核酸酶:脂肪酶以10: 2.5: 0.8的质量份比例混合而成的混合物；
[0052]3)除杂:采用连续离心或压滤的方法弃去固态杂质，得到离心液；
[0053]4)吸附:将所述离心液的pH调至8.5左右，加入FPA98型树脂6g/L (基于离心液的体积，w/v)，在28°C~30°C下，搅拌吸附6小时后收集树脂；
[0054]5)清洗及洗脱:将树脂用清水洗净，再用5%的盐水清洗掉部分杂质，清洗完后用23%~25%的盐水第一次洗脱树脂4小时，收集洗脱液；再用23%~25%的盐水第二次洗脱3小时，收集洗脱液并与第一次的洗脱液合并；最后再用21%的盐水对树脂进行第三次洗脱2小时，收集洗脱液留待下次使用；
[0055]6)醇沉及干燥:在第一次与第二次合并的洗脱液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小时后除去上清液，将得到的沉淀物烘干即得到肝素钠粗品。
[0056]由以上各实施例可知，本发明采用由蛋白酶、脂肪酶和核酸酶组成的复合酶制剂对肠粘膜进行酶解，不仅可以在酶解和吸附阶段节约大量热能，减少能耗，降低生产成本；而且可以在无盐条件下实现肝素钠的酶解和吸附过程，从而使排放的废水中盐浓度降低，减少废水处理成本，提高环境效益。
[0057]本领域技术人员不脱离本发明的实质和精神，可以有多种变形方案实现本发明，以上所述仅为本发明较佳可行的实施例而已，并非因此局限本发明的权利范围。此外，应当理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附`权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种肝素钠的常温无盐提取工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤: 1)匀浆:将新鲜的小肠粘膜液按每付小肠加水5~6kg稀释后匀浆或搅碎得到小肠粘膜的匀浆液。 2)酶解:将所述匀浆液的pH调至8~9后加入复合酶制剂，在室温下，搅拌酶解2~4小时； 3)除杂:采用连续离心或压滤的方法弃去固态杂质，得到离心液； 4)吸附:将所述离心液的pH调至8.5左右，加入树脂，在28°C~30°C下，搅拌吸附6小时后收集树脂； 5)清洗及洗脱:将所述树脂用清水洗净，再用5%的盐水清洗掉部分杂质，清洗完后用23%~25%的盐水第一次洗脱树脂4小时，收集洗脱液；再用23%~25%的盐水第二次洗脱3小时，收集洗脱液并与第一次的洗脱液合并；最后再用21%的盐水对树脂进行第三次洗脱2小时，收集洗脱液留待下次使用； 6)醇沉及干燥:在第一次与第二次合并的洗脱液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小时后除去上清液，将得到的沉淀物烘干即得到肝素钠粗品。
2.根据权利要求1所述的肝素钠的常温无盐提取工艺，其特征在于，所述步骤2)中的每升匀浆液中加入0.5~2克复合酶制剂。
3.根据 权利要求1或2所述的肝素钠的常温无盐提取工艺，其特征在于，所述复合酶制剂是蛋白酶:脂肪酶:核酸酶以10: 1.5~2.5: 0.4~0.8的质量份比例混合而成的混合物。
4.根据权利要求1所述的肝素钠的常温无盐提取工艺，其特征在于，所述步骤4)中每升离心液中加入6克树脂。
5.根据权利要求4所述的肝素钠的常温无盐提取工艺，其特征在于，所述树脂为FPA98型树脂。
【文档编号】C08B37/10GK103724456SQ201210385711
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月12日 优先权日:2012年10月12日
【发明者】王云山, 胡欢欢, 王剑英, 张万忠 申请人:深圳市绿微康生物工程有限公司