一种抗蛇毒血清的制取工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种抗蛇毒血清的制取工艺。
【背景技术】
[0002]抗蛇毒血清含有特异性抗体，具有中和相应蛇毒的作用，用于蛇咬伤者的治疗，世界上每年有500万人被毒蛇咬伤，有5万人因为没有及时注射蛇毒血清死于非命。提取微量蛇毒，少量液体蛇毒(不足以致命的量)注入某动物体内(如马，牛等)，一段时期之后，动物体内将会产生大量的抗蛇毒血清，然后将抗蛇毒血清从动物血液中提取出来，经过加工以后就是抗蛇毒血清了，但这种方法获得的抗蛇毒血清数量有限，而且纯度较低，而采用细胞培养的方法，专门培养能够产生抗蛇毒血清的B细胞，不但能够获得大量抗蛇毒血清，而且血清的纯度高，治疗效果明显，被毒蛇咬伤后，及时注射抗蛇毒血清，能够特异性进行解毒，从而达到治疗效果，申请号为CN202020279274.0公开了一种中国陆生常见蝰科蛇毒多价抗血清的制备方法及用法，涉及多价抗血清的制备及用法。本发明选择达到一定效价水平的几种蝰科毒蛇的特异性单价抗蛇毒血清F(ab) ’ 2，装量成20ml/瓶注射剂，经小鼠中和法检测该血清能有效中和我国常见五种蝰科毒蛇的平均一次排毒量，包括尖吻蝮蛇毒80-220mg、或蝰蛇毒30-55mg或烙铁头蛇毒55_75mg或竹叶青蛇毒20_35mg或蝮蛇毒
20-35mg，可直接应用于蛇伤重危患者，不需鉴定咬伤蛇种类，降低蝰科毒蛇伤致残率和死亡率，但是蛇毒本身较为稀有，直接采用蛇毒制得的抗蛇毒血清，血清量少，成本高，不能批量化生产，而且该抗蛇毒血清没有明显的标记基因一一荧光蛋白基因，不便于医学诊断的进行。
【发明内容】
[0003]为克服现有技术上的不足，本发明目的是提供一种抗蛇毒血清的制取工艺。
[0004]为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下:
[0005]一种抗蛇毒血清的制取工艺，其工艺步骤如下:
[0006](I)动物的选择与免疫:选用BALA/C纯种小白鼠，初次免疫蛇毒2?50 μ g加佐剂脾内注射0.8?2ml ；3周后，第二次免疫剂量同上，加佐剂腹腔内注射，其剂量不宜超过0.5ml ；3周后，第三次免疫剂量同一，不加佐剂腹腔内注射，5?7天后采血测其效价；2?3周，加强免疫，蛇毒量50?500 μ g为宜，静脉内注射；3天后，取细胞融合；
[0007](2)制备免疫细胞:最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，脾脏研碎，过细胞筛，离心，细胞用培养液洗3次，制得脾淋巴细胞悬液，备用；
[0008](3)基因重组:运用DNA重组技术，将荧光蛋白基因重组到免疫细胞分泌抗蛇毒血清的基因序列中，得到重组细胞，纯化培养，取20-8重组细胞悬液备用；
[0009](4)制备骨髓细胞:从BALA/C纯种小白鼠体内提取骨髓细胞，体外培养，取对数生长骨髓细胞离心，用无血清培养液洗3次，计数，取得20-7细胞备用；
[0010](5)细胞融合:将骨髓细胞与重组细胞按2:20的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗2次，离心之后弃上清液，使细胞沉淀略松动，90s内加入37°C预温的2ml 45%乙二醇溶液，边加边轻微摇动，37°C水浴作用90s，而后加37°C预温的不完全培养液以终止PEG作用，离心之后弃上清液，得到杂交细胞；
[0011](6)选择培养:将制取的杂交细胞用含20%小牛血清HAT选择培养液培养，杂交细胞布满孔底2/20面积时，开始检测特异性抗体，筛选出所需要的目标细胞；
[0012](7)后期培养:将上述目标细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加200 μ I，将培养板置37°C、5% C02培养箱中培养；
[0013]在一个优选实例中，所述步骤(I)中，所述佐剂为福氏完全佐剂。
[0014]在一个优选实例中，所述步骤(5)中，所述融合过程加入饲养细胞。
[0015]在一个优选实例中，所述步骤(7)中，所述96孔板数量为4块。
[0016]有益效果:本发明通过动物的选择与免疫、制备免疫细胞、基因重组、制备骨髓细胞、细胞融合、选择培养和后期培养七大步骤完成抗蛇毒血清的制取工艺，具有的荧光蛋白基因，医学用于诊断时，过程中有荧光出现，则反应为阳性，便于诊断的进行，本发明的细胞生长繁殖快，制取周期短，杂交融合率高，适于推广应用，选用BALA/C纯种小白鼠，易于饲养，同种细胞具有很高的杂交融合率，抗体细胞产生过程中，加入的佐剂，使抗蛇毒血清产生容易，缩短了制取时间，同时在细胞融合过程中加入的饲养细胞使细胞生产繁殖更快，大大缩短了抗蛇毒血清的制取周期，荧光蛋白基因提取技术成熟，DNA重组技术完善，因此本发明的抗蛇毒血清生产适于推广应用。
【具体实施方式】
[0017]为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。
[0018]本实施例的一种抗蛇毒血清的制取工艺，其工艺步骤如下:
[0019](I)动物的选择与免疫:选用BALA/C纯种小白鼠，初次免疫蛇毒35 μ g加佐剂脾内注射1.4ml ;3周后，第二次免疫剂量同上，加佐剂腹腔内注射，其剂量不宜超过0.5ml ；3周后，第三次免疫剂量同一，不加佐剂腹腔内注射，5天后采血测其效价；2周，加强免疫，蛇毒量350 y g为宜，静脉内注射；3天后，取细胞融合；
[0020](2)制备免疫细胞:最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，脾脏研碎，过细胞筛，离心，细胞用培养液洗3次，制得脾淋巴细胞悬液，备用；
[0021](3)基因重组:运用DNA重组技术，将荧光蛋白基因重组到免疫细胞分泌抗体的基因序列中，得到重组细胞，纯化培养，取14重组细胞悬液备用；
[0022](4)制备骨髓细胞:从BALA/C纯种小白鼠体内提取骨髓细胞，体外培养，取对数生长骨髓细胞离心，用无血清培养液洗3次，计数，取得14细胞备用；
[0023](5)细胞融合:将骨髓细胞与重组细胞按2:20的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗2次，离心之后弃上清液，使细胞沉淀略松动，90s内加入37°C预温的2ml 45%乙二醇溶液，边加边轻微摇动，37°C水浴作用90s，而后加37°C预温的不完全培养液以终止PEG作用，离心之后弃上清液，得到杂交细胞；
[0024](6)选择培养:将制取的杂交细胞用含20%小牛血清HAT选择培养液培养，杂交细胞布满孔底2/20面积时，开始检测特异性抗体，筛选出所需要的目标细胞；
[0025](7)后期培养:将上述目标细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加200 μ I，将培养板置37°C、5% C02培养箱中培养；
[0026]在一个优选实例中，所述步骤(I)中，所述佐剂为福氏完全佐剂。
[0027]在一个优选实例中，所述步骤(5)中，所述融合过程加入饲养细胞。
[0028]在一个优选实例中，所述步骤(7)中，所述96孔板数量为4块。
[0029]实施例2:其余与所述实施例1相同，不同之处在于，步骤(2)中添加的佐剂为福氏不完全佐剂，本实施例中，成本较低，但是作用效果相对较低。
[0030]实施例3:其余与所述实施例1相同，不同之处在于，步骤(5)将骨髓细胞与重组细胞数量比例该为2: 5，本实施例中，重组细胞用量少，制取成本降低，且时间缩短，但融合效率变低。
[0031]经实际应用中可知，通过动物的选择与免疫、制备免疫细胞、基因重组、制备骨髓细胞、细胞融合、选择培养和后期培养七大步骤完成抗蛇毒血清的制取工艺，具有的荧光蛋白基因，医学用于诊断时，过程中有荧光出现，则反应为阳性，便于诊断的进行，本发明的细胞生长繁殖快，制取周期短，杂交融合率高，适于推广应用，选用BALA/C纯种小白鼠，易于饲养，同种细胞具有很高的杂交融合率，抗体细胞产生过程中，加入的佐剂，使抗蛇毒血清产生容易，缩短了制取时间，同时在细胞融合过程中加入的饲养细胞使细胞生产繁殖更快，大大缩短了抗蛇毒血清的制取周期，荧光蛋白基因提取技术成熟，DNA重组技术完善，因此本发明的抗蛇毒血清生产适于推广应用。
[0032]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1.一种抗蛇毒血清的制取工艺，其特征在于，其工艺步骤如下: (1)动物的选择与免疫:选用BALA/C纯种小白鼠，初次免疫蛇毒2?50μ g加佐剂脾内注射0.8?2ml ;3周后，第二次免疫剂量同上，加佐剂腹腔内注射，其剂量不宜超过0.5ml ；3周后，第三次免疫剂量同一，不加佐剂腹腔内注射，5?7天后采血测其效价；2?3周，加强免疫，蛇毒量50?500 μ g为宜，静脉内注射；3天后，取细胞融合； (2)制备免疫细胞:最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，脾脏研碎，过细胞筛，离心，细胞用培养液洗3次，制得脾淋巴细胞悬液，备用； (3)基因重组:运用DNA重组技术，将荧光蛋白基因重组到免疫细胞分泌抗蛇毒血清的基因序列中，得到重组细胞，纯化培养，取20-8重组细胞悬液备用； (4)制备骨髓细胞:从BALA/C纯种小白鼠体内提取骨髓细胞，体外培养，取对数生长骨髓细胞离心，用无血清培养液洗3次，计数，取得20-7细胞备用； (5)细胞融合:将骨髓细胞与重组细胞按2:20的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗2次，离心之后弃上清液，使细胞沉淀略松动，90s内加入37°C预温的2ml 45%乙二醇溶液，边加边轻微摇动，37°C水浴作用90s，而后加37°C预温的不完全培养液以终止PEG作用，离心之后弃上清液，得到杂交细胞； (6)选择培养:将制取的杂交细胞用含20%小牛血清HAT选择培养液培养，杂交细胞布满孔底2/20面积时，开始检测抗蛇毒血清，筛选出所需要的目标细胞； (7)后期培养:将上述目标细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加200μ 1，将培养板置37°C、5% C02培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工艺，其特征在于，所述步骤(I)中，所述佐剂为福氏完全佐剂。
3.根据权利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工艺，其特征在于，所述步骤(5)中，所述融合过程加入饲养细胞。
4.根据权利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工艺，其特征在于，所述步骤(7)中，所述96孔板数量为4块。
【专利摘要】本发明公开了一种抗蛇毒血清的制取工艺，其工艺步骤为：(1)动物的选择与免疫；(2)制备免疫细胞；(3)基因重组：运用DNA重组技术，将荧光蛋白基因重组到免疫细胞分泌抗体的基因序列中，得到重组细胞，纯化培养，取20-8重组细胞悬液备用；(4)制备骨髓细胞；(5)细胞融合；(6)选择培养；(7)后期培养，本发明的抗蛇毒血清中具有明显的标记基因——荧光蛋白基因，医学用于诊断时，过程中有荧光出现，则反应为阳性，便于诊断的进行，本发明的细胞生长繁殖快，制取周期短，杂交融合率高，适于推广应用。
【IPC分类】C07K16-18, C12N15-06
【公开号】CN104558170
【申请号】CN201410808069
【发明人】崔强军, 张政, 刘新亮, 余炼
【申请人】广西大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月22日