一种重组法氏囊病蛋白工程疫苗的制备
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种重组法氏囊病蛋白工程疫苗 制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将主要结构蛋白VP2、VP3的表位与细胞因子禽 IL-15串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到重组法氏囊蛋 白工程疫苗以及该疫苗在预防禽传染性疾病法氏囊病毒病中的应用。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性法氏囊病（Infeetious Bursal Disease, IBD)是由传染性法氏囊病毒 IBDV所引起的一种急性、高度接触性传染病，是目前危害养鸡业最为严重的传染病之一 (Ikuta et al. ,2001 ;van den Berg, 2000)。本病毒无囊膜，呈二十面体立体对称。有单层 衣壳，核衣壳由32个直径为12nm的壳粒组成，直径约60nm。除完整病毒粒子外，还常见有 空衣壳，在感染细胞内，病毒常呈晶格状排列。
[0003] IBDV基因组由两个双股RNA节段组成，分别为A节段（大节段）和B节段（小节 段）（Lombardo et al.，2000)，两个节段均包括 5'端非编码区（5' non-coding region， 5' -NCR)、编码区和3'端非编码区（3' -NCR)。IBDV基因组A、B节段共编码5种蛋 白。B节段编码VP1蛋白（95kDa)，在病毒粒子作为基因组连接蛋白称为VPg(Delmas et al.，2011，Muller et al.，2003)。六节段包括两个部分重叠的0RF，小0RF编码VP5蛋 白（17kDa)，大0RF编码一个分子量为108kDa的多聚蛋白，该蛋白通过自剪切产生VP2前 体蛋白pVP2(48kDa)、VP3(32kDa)、VP4(28kDa)，pVP2通过羧基端进一步处理成为成熟的 VP2(40kDa)。VP2和VP3是结构蛋白，构成病毒粒子衣壳的内外层，均含有中和表位（Azad et al.,1991 ;Heine and Boyle, 1993 ;Villegas et al., 2008 ;Yip et al.,2007)。
[0004] VP2由IBDV的A节段VP2基因编码，是IBDV的主要结构蛋白，约占病毒总蛋白的 51 %，构成病毒的外衣壳。VP2与另一主要结构蛋白VP3-起构成IBDV核衣壳的骨架。VP2 带有IBDV依赖于蛋白质三维立体构象的保护性中和抗原位点，可以诱导产生保护性中和 抗体，并具有血清特异性其诱导的中和抗体被动地保护宿主不受IBDV的感染（Lukert and Saif，2003)。VP2含有血清型特异性的能诱导产生中和抗体的构象依赖性（不连续）抗原 决定簇，其诱导的中和抗体可保护宿主不受IBDV的感染，因此VP2是IBDV的宿主保护性抗 原（Azadetal.，1991。因此，一般认为VP2是IBDV的宿主保护性抗原，不同毒株间VP2氨基 酸序列的差异主要集中存在于第206~350位共145位氨基酸残基，称为VP2高变区，该区 域恰好位于两个酶切位点AccI和Spel的间（Rautenschlein et al. ,2005)。含两个亲水 的peak A(第210~225位）和peak B (第312~324位）及之间的区域，紧接在第二亲 水区后的七个氨基酸组成的七肽区，通常称这一区域为VP2高变区，属中和表位，能识别弱 毒和强毒。第一个亲水区有助于多肽构象的稳定，第二个亲水区对病毒中和性单克隆抗体 的识别有关。中和单克隆抗体所识别的抗原决定位点是个三维的立体构象（Coulibaly et al.，2005)。能够引起抗原决定位点三维构象发生微小变化的氨基酸变异都会使IBDV的 抗原性发生变化（Letzel et al.，2007，Martinez_Torrecuadrada et al.，2003)。不同毒 株在高变区内的变异较大，分子结构的改变会导致病毒毒力的改变以及宿主对疫苗应答的 改变，使得传统的疫苗株不能控制其流行（Pitcovski et al.，2003 ;Rong et al.，2007)。 另外，VP2是细胞感染IBDV后引起细胞凋亡主要因素之一（Ikuta et al.，2001;van den Berg,2000)〇
[0005] VP3蛋白是IBDV主要的结构蛋白之一，分子质量约为32kD，占病毒总量的40%，位 于病毒粒子的内表面，在IBDV核衣壳骨架形成的过程中起重要作用。VP3含有群特异性抗 原决定簇，可诱导中和抗体的产生，但反应能力极弱，免疫保护性不强。VP3对于病毒样颗 粒的形成是必要的，VP3对于病毒衣壳的形成和形态的完整是必需的（Lee et al.，2003)。 VP3至少存在两个独立非重叠的非中和性抗原表位，其中一个是两个血清型所共有的，另一 个是血清型特异的（Martinez-Torrecuadrada et al.，2003)。不同血清亚型IBDV的VP3 基因相对保守，VP3的存在是病毒样颗粒（VLPs)能够正确形成的前提，它是IBDV衣壳的形 成以及形态的完整是必需的，它的作用是稳定病毒RNA。此外，因VP3多个区段具有亲水性， 使其在病毒与抗体反应时发挥促进作用（Lee et al.，2003)。
[0006] 白介素15 (interleukin 15, IL. 15)是新近发现的一种细胞因子，IL-15的许多性 质和功能被认为是同IL-2相似的，如诱导T细胞增殖、提高自然杀伤细胞（NK)的细胞毒 性、促进活化的B细胞增殖和分化等（Grabstein K H，1994)。Lillehoj等人于细胞cDNA 文库中克隆到了一个新基因，其5'端非编码区含有两个框外ATG起始密码子，编码蛋白含 有较长的信号肽（由66个氨基酸组成），成熟蛋白含有四个高度保守的半胱氨酸残基。该 蛋白在体外能维持ConA活化的鸡T淋巴细胞的生长和增强NK细胞的杀伤活性，这与已报 道的哺乳动物IL-15的基因与蛋白特征相似，由此确定该基因编码ChIL-15 (Lillehoj H S etal，2001)。IL-15是一种多功能的细胞因子，包括（1)维持T细胞株CTL-2的生长，诱 导细胞毒性T细胞活性，诱导预致敏T细胞的活化、分化，促进肠粘膜淋巴细胞特别是TCR 细胞分化生长，而且与IL-2协同在较低浓度即能导致T细胞的迅速增殖（Chu C L etal， 1999;Schluns K S etal，2002)(2)对正常B细胞，在用PMA和抗IgM抗体预活化后，IL-15 可诱导其增殖反应，当将IL-15与⑶40L联合应用时，可使B细胞分泌IgG(Armitage R T， 1995) ; (3)可以诱导NK细胞的分化成熟，增强其杀伤活性，也可显著增进NK细胞表达IF y 和TNFa (Wei X Q，2001 ;Waldmann T A，2001) ;(4)能够刺激正常外周血单核细胞PBMC增 殖；（5)高浓度的IL-15能增加LPS活化的单核巨噬细胞产生促炎症因子如IL-1，IL-6和 TNFa，低浓度的IL-15能选择性的抑制促炎症因子的产生，对抗炎性因子无影响。（6)抑制 淋巴细胞发生凋亡，且可抑制IL-2介导的细胞死亡（Waldmann T A，2001)。
[0007] 传统的灭活和活毒苗接种都曾作为防控IBDV主要手段。然而，灭活苗缺乏诱导机 体产生坚实的免疫力的能力，尤其是在细胞介导的免疫效力方面。面对vvlBDV威胁，灭活 苗并不能使鸡在整个生长期内得到保护。由于致弱毒株疫苗往往未完全减毒，免疫后可能 对法氏囊的淋巴滤泡造成一定的病理损伤，甚至有的还可以引起免疫抑制（Rautenschlein et al.，2005)，亦会导致高毒力或变异株的出现（Snyder，1990)。而且，有些IBDV变异株活 疫苗导致免疫抑制和亚临床继发感染（Fussell，1998;Donnelly et al.，2000)。因此，开 发一种安全有效适合大规模免疫的新型IBDV疫苗势在必行。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明以主要结构蛋白VP3B细胞表位以及VP2B细胞中和抗原表位和T细胞表位 作为疫苗框架结构，与禽细胞因子白介素15(chIL-15)基因串联，在大肠杆菌中表达后，经 过蛋白纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的重组疫苗。本疫苗免疫靶动物后可诱导 有效的体液免疫和细胞免疫反应。
[0010] 本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防禽法氏囊病的重组蛋白工程 疫苗多肽及其疫苗组合物；本发明的目的之二在于提供了所述法氏囊蛋白工程疫苗的构建 及获得方法；本发明的目的之三在于提供了能够表达所述法氏囊蛋白工程疫苗的基因工程 菌株；本发明的目的之四在于提供了所述蛋白工程疫苗的制备方法；本发明的目的之五在 于提供了所述法氏囊蛋白工程疫苗在预防法氏囊病中的用途。
[0011] 在第一方面，本发明提供了一种用于预防