离心30min，弃去沉淀。变性蛋白1:100稀释，复性液用Tris(PH8.0)缓 冲体系，加入0. 3M精氨酸，4°C搅拌复性24小时。复性液用pH= 8. 0的20mM磷酸缓冲液， 0. 5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH = 8. 0的20mM磷酸缓冲液，0. 5M氯化钠， 0. 5M咪唑洗脱；即得重组法氏囊蛋白工程疫苗半成品原液。
[0035] 乳化将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至100iig/ml。取法国赛比克公司的 Montanide ISA 50V2佐剂，经过121°C，灭菌15分钟，备用。按油相：水相=50 : 50的比 例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水 相，加完后再搅拌2min，然后以5500r/min高速循环乳化9min，制成油包水单相疫苗。
[0036] 实施例四重组法氏囊蛋白工程疫苗安全性试验
[0037] 1试验动物30日龄SPF鸡20羽。
[0038] 2疫苗由公司研发中心提供，批号为131024、131027、131031。
[0039] 试验采用单因子完全随机化的试验设计，随机将20只30日龄试验动物随机分为4 组，3个批号组和对照组，每组10只，组间无体重差异。免疫组于每只鸡腿部肌肉注射疫苗 0. 3ml/头，观察至10日，对照组使用生理盐水乳化液0. 3ml。免疫后，观察各实验动物的采 饲、饮水、精神是否正常、是否有中毒症状、是否产生过敏反应、是否死亡或出现其他异常情 况。免疫前及试验结束后，全部动物称重。对称重结果进行统计学分析。
[0040] 3 结果
[0041] 3. 1临床观察
[0042] 3个免疫组动物免疫后均未观察到任何过敏反应或中毒症状，SPF鸡的精神、采 饲、饮水、活动、粪便等一切正常，未出现明显局部炎症等损伤性临床副反应，且无死亡发 生。
[0043] 3. 2体重变化
[0044] 结果见表1，与对照相比，三个免疫组动物体重增长与对照组差异不显著（P > 0.05)，表明免疫重组法氏囊蛋白工程疫苗对动物的体重无不良影响。
[0045] 表1重组法氏囊蛋白工程疫苗对SPF鸡体重变化的影响
【主权项】
1. 一种法氏囊蛋白工程疫苗融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No. 2。
2. -种核酸分子，其编码权利要求1项所述融合蛋白。
3. -种载体，其含有权利要求2所述的核酸分子。
4. 一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的载体。
5. 权利要求2所述的核酸分子，其具体序列如下： ctg ggg atg gca cag cca aca caa aac tct gcc gga gca egg aga agg ccg gag agt cag aaa aca cat gtgaaa agt att tgt etc cag tac caa ctg tat eta ett ttg aac age tat ttc ttt tgc ett tta aag aat aag act gga ctaacc ate ttc ttc eta tgt get tat gta cca aag aca gaa gca aat cac tgt aag tgg tea gac gtt ctg aaa gat ttggag ctg ate aag aca tct gaa gac att gac gtc agt tta tat act gca aac aca tac gag gat ata gaa tgc caggaa cct gta atg aga tgt ttt ttt tta gag atg aaa gtg att ett cac gaa tgt gat ate aaa aaa tgt agt agg aageat gat gta egg aac ata tgg aaa aat gga aat gca aga ttt gca act tac cag ttg aat tee aca aca gca aaaaaa tgc aaa gaa tgt gaa gag tat gaa gaa aaa aat ttt aca gaa ttt ata cag agt ttt gta aag gtt ata cag agggaa tgc aga aaa tac get aac ggt gat ate cca ggt tgc aag aca aac ctg caa gat caa acc caa ggt ggt acaacc gga ccg geg tee att ccg gac gac acc eta gag aag cac act etc agg tea gag acc teg acc ggt tct ggtctg cag age aat ggg aac tac aag ttc ggt ggt gta gca aca tgt gac age agt gac agg ccc aga ate tac accata get gca gcc aat gat tac caa ttc tea tea cag tac caa gca gat gga ggt tct ggt cca aat cct gaa etagea aag aac ctg ate aca gaa tac ggc ega ttt gac cca gga gcc atg aac tac aca aaa ttg ata ctg agt gagagg gac cgt ett ggt ate aag acc gta tgg cca aca agg gag tac act gac ttt ege gag taette atg gag ggtggt cca tct tgt gac ccc aac gcc cat egg atg cgt aat ttt etc gca aac gca cca cag gca ggc age aag tcgcaa aga gcc aag tac ggg aca gca ggc tac gga gtg gag gcc ega ggc ccc aca cca gag gag gca cagagg gaa aaa gac aca egg ate tea aag aag atg gag ggt tct ggt aat ggg cac agg ggg cct age ccc ggccag eta aag tac tgg cag aac aca ega gaa ata cct gat cca aac gag gac tac eta gac tac gtg cat gca gagaag age egg ttg gca tea gaa gaa caa ate ggt tct ggt aac cat ggg cgt ggc ccc aac caa gaa cag atg aaagat ctg etc ttg act geg atg gag atg aag cat ege aat ccc agg egg get cca cca aag ccc aag cca aaa cccaat get cca aca cag aga ccc cct ggt egg ctg ggc ege 〇
6. -种用于预防禽法氏囊病的疫苗，其包含权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可 接受的载体。
7. 权利要求1所述的融合蛋白在制备重组法氏囊蛋白工程疫苗中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种重组法氏囊(Infeetious Bursal Disease，IBD)蛋白工程疫苗的制备与应用。所述疫苗以IBDV主要结构蛋白VP2、VP3的B细胞中和表位和T细胞免疫表位作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接后再与细胞因子禽白介素15(chIL-15)串联，克隆入pRSETB载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的法氏囊蛋白工程疫苗。本发明还涉及该疫苗的使用方法。动物实验表明，重组法氏囊蛋白工程疫苗在体液免疫与细胞免疫水平上效果与活毒苗相当，可以在细胞水平上刺激产生T淋巴细胞增殖免疫反应，体液水平上产生具有病毒中和活性的抗体免疫反应，攻毒保护试验表明重组法氏囊蛋白工程疫苗组效果明显好于活疫苗组。
【IPC分类】C12N15-62, C12N15-70, A61K38-20, A61K39-12, C07K19-00, C12N1-21, A61P31-14
【公开号】CN104628871
【申请号】CN201510072005
【发明人】李殿明, 蒲勤, 张毓金, 齐春梅, 田春辉, 刘甜甜, 任百亮, 张导春, 党将将, 吴启凡
【申请人】广州谱泰生物技术有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月9日