重组二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白及其哺乳动物细胞高效表达系统的制作方法
【专利说明】重组二聚化抗凝血酶丨M-Fc融合蛋白及其晡乳动物细胞 高效表达系统
[0001] 本发明为分案申请，其原申请的申请号为2012101468630,申请日为2012年5月 14日，发明名称为"重组二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白及其哺乳动物细胞高效表达系 统"。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种重组二聚化抗凝血酶III的Fc融合蛋白及其制备方法和它在医 疗上的应用，特别是在治疗多种凝血相关的疾病，抗血管新生，抗炎症和抗病毒方面的用 途。
【背景技术】
[0003] 人体内与凝血系统功能相拮抗的是抗凝血系统，在正常情况下，两者保持动态平 衡。抗凝血酶III (AT)是人体血浆中的一种重要的抗凝血因子，它在血浆中承担着70%的 生理性抗凝血酶活性（Johnson DJ等，2006，25: 2029-37)，在维持血液生理性 凝血与抗凝血平衡中起非常重要的作用。AT是肝细胞和血管内皮细胞分泌的丝氨酸蛋白 酶抑制剂超家族（Serine Protease Inhibitor, SEPIN)的重要成员之一。AT通过与凝血 酶Flla结合成凝血酶-抗凝血酶（TAT)复合物，从而灭活凝血酶。此外，它还可以较强地 抑制凝血因子Xa、IXa的活性，对凝血因子XIa、Xlla、纤溶酶、激肽释放酶的活性也有一定 的抑制作用。 体内AT升高一般不会引起病理性后果，但是AT量减少常见于以下病例：a)遗传性AT缺乏：遗传性抗凝血酶缺陷症是一种较常见的人类遗传性疾病，它与家族性静脉血栓形成 倾向有关（AbildgaardU 等，2007，98: 97_104);b)获得性AT缺乏： 见于各种肝病，如肝硬化、重症呷、肝癌晚期等；c)AT丢失增多：如肾脏疾病；d)AT消耗增 多：如各种原因所造成的血液凝固性增高，AT中和活化的凝血因子，以致消耗增加；e)最重 要的是：AT的先天性或后天获得性缺乏症可导致血栓的形成，而引起脑血栓或心肌梗塞等 非常严重的疾病。因此，AT在临床上有预防和治疗慢性血栓或血塞形成的作用，对治疗抗 凝血酶缺失症也有显著效果。
[0004] 除了抗凝作用，AT还具有抗炎作用。其抗炎作用首先由Taylor在猴子模型上研 究弥散性血管内凝血（DIC)时提出，他发现输注AT能大大降低接受致死量大肠杆菌猴子 的死亡率（Taylor FB Jr等，Ckre 2000，28: S12-9)。越来越多的证据表 明体内凝血与炎症反应之间存在网络效应关系（Esmon CT，财oot/，2000，95: 1113-16; Cirino G 等，Tferefltfe 5bi, 2000，21: 170-2)。Johnson 等（Johnson K 等， /J遞《//?〇人1998，160: 5130-35)进一步研究发现，身体内局部血栓的形成可刺激单核细 胞及血管内皮细胞合成大量的促炎因子，包括IL-8、IL-6。凝血酶在其中也起重要作用。 凝血酶能裂解白细胞、内皮细胞源性的IL-8 (含77个氨基酸，第77位残基为丙氨酸残基） 生成含72个氨基酸的IL-8 (第72位的残基为丝氨酸），增强了其中性粒细胞激活活性， 故当凝血酶及IL-8在血管炎症反应部位共存时可放大IL-8的效应。相应的，严重炎症反 应还可通过白细胞-内皮细胞的相互作用损伤微血管细胞、微血管组织，进而刺激凝血酶 的大量生成。迄今AT抗炎作用机制尚未完全阐明，可能存在多种作用机制。Okajima等 (Okajima K 等，1998，24: 27-32)认为 AT 可促使内皮细胞释 放PGI2, PGI2能抑制白细胞-内皮细胞相互反应；同时，AT还通过与内皮细胞表面的葡胺 聚糖相互作用，干扰了细菌毒素与葡胺聚糖的结合，减轻了细菌毒素的细胞反应，所以AT 的抗炎作用与其与内皮细胞上的葡萄糖胺聚糖结合能力紧密相关（Johnson DJ等， /，2006，25: 2029-37XMinnema 等（MinnemaMC 等，财oot/，2000，95: 1117-23)认 为AT通过抑制凝血酶/FXa介导的促炎因子如IL-6、IL-8、IL-10等的释放来削弱炎症反 应。另外AT灭活了丝氨酸蛋白酶活性中心，从而抑制丝氨酸蛋白酶本身引起的细胞炎症反 应。大量的研究表明AT在多种组织中发挥其抗炎功能。在肺组织中，AT可抑制嗜中性粒 细胞的渗透作用，且减少微血管渗漏（Duru S等，XcteylaaeWAesio/ 2005，49: 1142-8)。在肝组织中，AT通过调节局部前列环素水平来抑制肝损伤（Aytekin F0等，办？J Surg,2005,VH VHb {Xsvhoi W等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2007，292: G678-83)。在胃肠道，AT可减少白细胞在血管内的粘附和集聚（Ostrovsky L 等，CYrcWaUo/?，1997，96: 2302-10)。在皮肤组织中，AT可降低脂多糖（LPS)诱导的白 细胞-内皮细胞间相互作用（Hoffmann JN 等，办? 2000，279: C98-107)。此外，AT还被发现对非典型性分枝杆菌感染（Chan ED等，iT/s， 2007，39: 690-6)、糖尿病（HashemiM等，仍'a知2007，75: 246-8) 和脂膜炎的病理过程有影响作用（O'RiordanK等，1997，63: 480-2)。 进一步的实验发现AT的抗炎特性与其使用剂量有关。小剂量的AT(50U/kg及100U/kg) 虽能明显抑制内毒素诱导的大鼠发生凝血障碍，但不能阻止白细胞在肺内的聚集及对肺血 管造成的损伤。而大剂量的AT(250U/kg)能显著改善由内毒素诱导的肺内皮细胞的损伤 (UchibaM等，?1998，89: 233-41)。这一研究结果也已在AT对重症感染疾 病治疗作用研究的多中心KyberSept III期临床试验中得到证实。
[0005] 近年研究发现，通过有限的水解或热变性后，AT具有抗血管新生的作用（Richard B等，/沿〇/泛￡?，2008，283: 14417-29)，能阻止细胞从G1向S期转变，抑制细胞增殖； 同时还能抑制内皮细胞表面促血管新生硫酸乙酰肝素蛋白多糖（proangiogenic heparan sulfate proteoglycan, HSPG)和基底膜蛋白多糖（perlecan)的表达。通过抑制HSPG介导 的FGF家族信号通路以及VEGF家族信号通路（Zhang W等，财oot/，2004，103: 1185-91)、 阻断HSPG介导的血管生长因子与血管内皮细胞的黏附（Zhang W等，/沒2006， 281: 37302-10)从而抑制血管新生。Zhang 等（Zhang W 等，Gflcer Tfes, 2006，66: 5047-55)通过研究表明AT可以改变人脐静脉内皮细胞基因表达，有35种基因表达水平 显著增高，其中大多数基因具有抗血管生成作用，例如半胱天冬酶-3(ca SpaSe-3)、p21、 基质金属蛋白酶组织抑制剂CHMPs)-l、2、3等；而有93种基因表达水平明显下降，其中 超过50%的基因具有血管形成作用，例如基底膜蛋白多糖（perlecan)、丝裂原蛋白活化激 酶-3(MAPK3)、早期生长反应因子-l(EGRl)等。但目前尚缺乏动物或临床前试验证明AT在 体内有抗血管新生作用，如果该作用得到证实，那么联合应用标准化疗及这种抗凝药应能 更好地抑制肿瘤的生长和转移,并能减少肿瘤患者的血栓并发症。
[0006] 丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin)，包括AT对慢性病毒性疾病的进程具有双向调节 作用。HIV-1型及HCV感染者，其a-1抗胰蛋白酶(AAT)水平异常偏低（Potthoff AV等， JJiAS； 2007，21: 2115-6 ;Shapiro L等，2001，15: 115-22)，且被证实它与 进行性疾病和进行性肝纤维化有关（Cheung KJ等，/KirW故狹2009，16: 418-29)。 相反，大量的临床数据揭示serpin表达水平升高与HIV感染的发生率的下降，或延缓疾病 进程相关（McNeely TB 等，财〇〇￡/，1997，90: 1141_9;Burgener A 等，Tfes， 2008，7: 4446-54 ;Geiben-LynnR等，/ 沿?o/ae?, 2002，277: 42352-7)。肝素活化的 AT显示出极强的抗病毒作用，它不仅对HIV-l(Elmaleh DR等，/#〇/ 2005，16: 191-200)具有抑制作用，且同样可抑制HCV、HSV-1和HSV-2 (Whitney JB等， 2011，6: el8589)。
[0007] AT在抗凝血、抗炎症、抗血管新生和抗病毒方面显现的生物学特性，使其在临床上 具有重大应用价值。AT在国外临床上已经广泛使用，用于多种疾病的治疗，包括：弥散性血 管内凝血（DIC)、先天及后天获得性AT缺乏症、多器官功能障碍综合征（MODS)、败血症、重 症感染介导的全身炎症反应和感染中毒性休克等（PuskdsA等，2007，26: 53-63; Topaloglu S 等，2007，58: 85-91)。尤其是针对 DIC 的治疗，效果 极为显著。DIC在欧美每年的发病率约为50万例，死亡率超过50%，仅美国即有20-30亿 美元市场。美国GTC公司用转基因山羊生产的人抗凝血酶"ATryn"分别于2006年8月和 2008年10月获得了欧洲药监局和美国FDA的批准。另外，最新研究结果表明，AT可以缓解 抗凝血常用药肝素形成的耐药性（Spiess BD，J/7/7 2008，85: 2153-60)，这 也预示着其更加广阔的市场前景。随着对AT作用机理的进一步深入研究、适应症的进一步 拓宽，有望被开发成为抗炎症、抗病毒、抗肿瘤等的药物，运用到各类严重危害人类健康的