一种1,3-β-D-葡聚糖多克隆抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫原和抗体及其制备方法，特别是用于针对1，3-β -D-葡聚糖免疫原和抗1，3- β -D-葡聚糖多克隆的抗体及其制备方法。
【背景技术】
[0002]侵袭性真菌疾病(Invasive fungal disease，IFD)又称深部真菌感染，指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖引致组织损害、器官功能障碍、炎症反应的病理改变及病理生理过程。
[0003]近年来，由于广谱抗菌药物、肾上腺皮质激素、肿瘤化疗、放疗和器官移植后免疫抑制剂的长期广泛应用以及艾滋病的流行，侵袭性真菌疾病的发病率逐年升高，该疾病早期症状无特异性，病程长，发现较晚，死亡率极高。因此，对侵袭性真菌疾病治疗成败关键在于早期诊断、早期给予抗真菌治疗。
[0004]目前侵袭性真菌疾病诊断的常规方法，阳性率低、很难确诊，而非常规方法检测成本高、实验条件苛刻很难在医院普遍推广。常用的鲎试剂检测l，3-f3_D-葡聚糖，假阳性因素较多，其它抗原、抗体和酶类检测产品一般只针对特定几种真菌，不适合侵袭性真菌疾病大量临床筛选工作。而酶联免疫吸附试验(ELISA)技术成熟，成本相对较低，诊断快速，便于临床实验室使用。因此，针对真菌1，3-β-D-葡聚糖的ELISA检测体系具有十分重要的临床应用价值，而制备抗1，3-β -D-葡聚糖抗体是建立该ELISA体系的关键技术。
[0005]非专利文献“(1，3)_β -D-葡聚糖ELISA检测方法建立及初步临床应用”(现代检验医学杂志，2003年，第5期)中公开了以半乳糖神经酰胺为包被物，鼠抗(l，3)-f3-D-葡聚糖单克隆抗体、生物素化抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记亲和素为检测系统建立ELISA法。
[0006]非专 利文 献 “Development of a two-site enzyme immunoassaybased on monoclonal antibodies to measure airborne expo sureto (I — 3) - β-d-glucan” (Journal of Immunological Methods，V.337，N0.1)以氧化昆布多糖免疫小鼠，得到1，3-β-D-葡聚糖单克隆抗体，在此基础上，建立了一种双抗体夹心ELISA法。但上述方法中使用的是抗(1，3)-β-D-葡聚糖单克隆抗体，制备方法较为复杂。
[0007]尽管现有技术中公开有葡聚糖多克隆抗体的制备方法，通常采用葡聚糖与BSA交联物为抗原，进行动物免疫后，获得葡聚糖多克隆抗体。但是上述葡聚糖多克隆抗体或者不具备特异性或者抗体的纯度和效价也不能满足疾病检测的需要，不适用于ELISA检测体系O
[0008]为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体及其制备方法。
【发明内容】
[0009]本发明的一个目的在于提供一种1，3- β -D-葡聚糖多克隆抗体及其制备方法，解决1，3-β -D-葡聚糖抗体制备工艺复杂，效价低，特异性差的缺陷。
[0010]本发明的另一个目的在于提供一种1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体在侵袭性真菌疾病检测中的应用，成本相对较低，诊断快速，降低了检测的假阳性，适合于侵袭性真菌疾病大量临床样本的筛选。
[0011]因此，本发明第一方面提供了一种1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体，所述抗体的制备方法包括:
[0012](I)制备1，3-β-D-葡聚糖免疫原；
[0013](2)用1，3-β -D-葡聚糖免疫原进行动物免疫；
[0014](3)从免疫后的动物体内取血；
[0015](4)依次用饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清纯化，得到多克隆抗体。
[0016]本发明所述的步骤(I)中，制备1，3-β-?-葡聚糖免疫原的方法包括:将I, 3- β -D-匍聚糖和偶联蛋白偶联制备得到1，3- β -D-匍聚糖免疫原；或者，将真菌抱子和/或菌体培养后破碎获得破碎液制备得到1，3-β-D-葡聚糖免疫原。多抗制备的关键是免疫抗原的合成，免疫抗原需要纯度好，而且能保持1，3-β-D-葡聚糖的化学结构，有利于后续动物体内抗体的产生。
[0017]所述的步骤⑴为1，3-β -D-匍聚糖和偶联蛋白偶联制备得到1，3- β -D-匍聚糖免疫原时，1，3-β -D-葡聚糖可以为本领域熟知的1，3-β -D-葡聚糖，例如海带多糖(Laminarin)、茯等多糖(Pachyman)、羧甲基化茯等多糖(Carboxymethyl pachyman)、凝胶多糖(Curdlan)、羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethyl curdlan)、褐藻多糖(Paramylon)、香葫多糖(Lentinan)、地衣多糖(Pustulan)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、大麦葡聚糖(Barley glucan)、燕麦葡聚糖(Oat glucan)、右旋糖酐(Dextran)等。优选的，所述的1，3-β-D-葡聚糖选自海带多糖、茯苓多糖、羧甲基化茯苓多糖、凝胶多糖、羧甲基化凝胶多糖。最优选，所述的1，3-β-D-葡聚糖为凝胶化多糖或羧甲基化凝胶多糖。所述的偶联蛋白可以为牛血清白蛋白(Bull serum albumin，BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpethemocyanin, KLH)、破伤风毒素(Tetanus toxin，TT)、鸡卵清白蛋白(Ovalbumin，0VA)，优选为牛血清白蛋白。1，3- β -D-葡聚糖和蛋白的偶联方法可以选用碘酸盐氧化法、DMTMM试剂法、碳二亚胺法、戊二醛法、活化脂法、混合酸酐法等。
[0018]在本发明的一个【具体实施方式】中，所述的偶联步骤包括:将海带多糖溶液和Na14溶液混合，室温避光反应0.5-3小时，优选反应I小时，用色谱柱脱盐，将得到的溶液中加入牛血清白蛋白和NaBH3CN溶液，室温振荡反应，加入NaBH4溶液，室温振荡反应，用磷酸盐缓冲液透析，离心除去沉淀。在本发明的另一个【具体实施方式】中，所述的偶联步骤包括:将羧甲基化茯苓多糖和/或羧甲基化凝胶多糖溶液和DMTMM(4-(4，6- 二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐)溶液混合，振荡反应，超纯水透析过夜，加入BSA，室温避光振荡过夜，离心除去沉淀。
[0019]所述的步骤⑴为真菌孢子和/或菌体培养后破碎获得破碎液制备得到1，3-β-D-葡聚糖免疫原时，所述的真菌为本领域适用的致病真菌，包括曲霉菌(Aspergillus)、念珠菌(Candida albaican)、隐球菌(Crytococcus)、毛霉菌(Mucor)、马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)、谦刀菌(Fusarium)、卡氏肺抱子菌(Penumocystiscarinii bacteria)。所述的真菌菌体可以采用经液体培养基发酵收集菌体；所述的真菌孢子可以经平皿固体培养洗脱收集孢子。所述的破碎步骤可以采用研磨破碎和/或超声破碎。在本发明一个【具体实施方式】中，所述步骤(I)可以包括:将致病真菌经液体培养基发酵收集菌体，用含体积百分比1-10%甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，菌体倒入液氮研磨破碎，收集上清液；或者，将致病真菌经平皿固体培养洗脱收集孢子，用含体积百分比1-10%甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，孢子用超声破碎，收集上清液。
[0020]优选的，所述的步骤⑴中，l，3-f3-D-葡聚糖和偶联蛋白偶联制备得到1，3- β -D-葡聚糖免疫原后，任选的包括对蛋白修饰后1，3- β -D-葡聚糖的鉴定步骤，所述的鉴定方法方法包括高效凝胶排阻色谱法、紫外/红外吸收光谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。
[0021]本发明所述的步骤(2)中，所述的动物可以为本领域使用的制备多克隆抗体的动物，选自:小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或两种以上，优选为小鼠、大鼠、兔。所述免疫的方法选自皮下注射法、脾内注射法、静脉注射法、腹腔注射法等。步骤(2)免疫步骤中的免疫剂量可视具体动物种类而定，优选的免疫剂量为10-1000 μ g/只/次。在本发明一个优选的是实施方式中，所述的步骤⑵包括:将步骤⑴得到的1，3-β -D-葡聚糖免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对动物进行皮下多点注射，免疫剂量为每只动物10-1000 μ g，初次免疫后每2-4周免疫I次，免疫次数多3次。优选的，所述的初次免疫后每2周免疫I次，免疫次数为3-5次，更优选的免疫次数为3次。
[0022]本发明所述的步骤(3)中，优选的，从免疫后的动物体内取血前，还包括测定免疫后动物的血清效价的步骤，更优选的，所述的测定免疫后动物的血清效价步骤在免疫后每隔1-7天进行一次。所述的步骤(3)中从免疫后的动物体内取血为处死后采血，也可以不处死。更优选的，所述的从免疫后的动物体内取血步骤包括:用颈动脉放血的方法采血，待血液凝固，血清分离出后，离心，取上清。
[0023]本发明所述的步骤(4)中，所述的纯化方法为先用饱和硫酸铵盐析沉淀法进行初步纯化，再用亲和层析法进一步纯化。现有的抗体纯化方法存在多种，例如硫酸铵沉淀法、辛酸沉淀法、DEAE离子交换层析法、轻基磷灰石层析法、凝胶层析法、亲和层析法。不同性质的抗体适用的纯化方法不同，需要筛选出工艺简单、能够得到高效价抗体。
[0024]本发明所述的饱和硫酸铵盐析沉淀法包括:取步骤(3)得到的血清，加等体积的生理盐水，再加入饱和硫酸铵溶液，0-10°C沉淀过夜，优选为4°C沉淀过夜；10000G离心5-20min，优选离心lOmin，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，0-10°C静置0.5-2h，优选4°C静置Ih ; 10000G离心5_20min，优选离心lOmin，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液0-10°C透析过夜，优选4°C透析过夜。
[0025]本发明所述的亲和层析法包括:用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过