的样品上样；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体。优选的，所述的洗脱缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 4.2)、柠檬酸缓冲液(pH 4.5)等中的一种，所述的偶联缓冲液为0.lmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)等中的一种，所述的亲和色谱柱为用l，3-f3-D-葡聚糖抗原、葡萄球菌A蛋白或者链球菌G蛋白交联的固相载体作为柱填料。
[0026]本发明的另一方面提供了一种1，3- β -D-葡聚糖多克隆抗体制备方法，包括:
[0027](I)制备1，3-β-D-匍聚糖免疫原；
[0028](2)用1，3- β -D-葡聚糖免疫原进行动物免疫；
[0029](3)从免疫后的动物体内取血；
[0030](4)依次用饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清纯化，得到多克隆抗体。
[0031]优选的，所述的步骤(I)包括:
[0032]将1，3- β -D-葡聚糖和Na14溶液混合，室温避光反应0.5-3小时，优选反应I小时，用色谱柱脱盐，将得到的溶液中加入按质量比为抗原l，3-f3-D-葡聚糖1-10倍的BSA和NaBH3CN溶液，室温振荡反应，加入NaBH4溶液，室温振荡反应，用磷酸盐缓冲液透析，离心除去沉淀；
[0033]或者，将1，3-β-D-葡聚糖免疫原和DMTMM (4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐)溶液混合，振荡反应，超纯水透析过夜，加入按质量比为抗原l，3-e-D-葡聚糖1-10倍的BSA，室温避光振荡过夜，离心除去沉淀；
[0034]或者，将致病真菌经液体培养基发酵收集菌体，用含体积百分比1-10%甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，菌体倒入液氮研磨破碎，收集上清液；
[0035]或者，将致病真菌经平皿固体培养后，洗脱收集孢子，用含体积百分比1-10%甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，孢子用超声破碎，收集上清液。
[0036]所述的l，3-f3_D-葡聚糖优选为海带多糖、茯苓多糖、羧甲基化茯苓多糖或羟甲基化凝胶多糖中的一种或两种以上的组合。
[0037]优选的，所述的步骤(2)包括:将步骤⑴得到的l，3-f3_D-葡聚糖免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对动物进行皮下多点注射，免疫剂量为每只动物10-1000 μ g，初次免疫后每2-4周免疫I次，免疫次数多3次。
[0038]优选的，所述的步骤(3)包括:测定免疫后动物的血清效价后，用颈动脉放血的方法采血，待血液凝固，血清分离出后，离心，取上清。
[0039]优选的，所述的步骤(4)包括:所述的纯化方法为先用饱和硫酸铵盐析沉淀法进行初步纯化，再用亲和层析法进一步纯化。所述的饱和硫酸铵盐析沉淀法包括:取步骤(3)得到的血清，加等体积的生理盐水，再加入饱和硫酸铵溶液，0-10°C沉淀过夜，优选为4°C沉淀过夜；10000G离心5-20min，优选离心lOmin，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，0-10°C静置0.5-2h，优选4°C静置Ih ； 10000G离心5_20min，优选离心lOmin，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液0-10°C透析过夜，优选4°C透析过夜。所述的亲和层析法包括:用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体。优选的，所述的洗脱缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(ΡΗ4.2)、柠檬酸缓冲液(pH 4.5)等中的一种，所述的偶联缓冲液为0.lmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)等中的一种，所述的亲和色谱柱为用l，3-f3-D-葡聚糖抗原、葡萄球菌A蛋白或者链球菌G蛋白交联的固相载体作为柱填料。
[0040]本发明的另一方面提供了一种所述的1，3_β-D-葡聚糖多克隆抗体在制备用于侵袭性真菌疾病检测的试剂盒中的应用。所述的检测是指利用抗原抗体间的特异性结合反应，优选为酶联免疫吸附检测、免疫胶体检测、免疫荧光检测检测、化学发光免疫分析检测，更优选为酶联免疫吸附检测。侵袭性真菌疾病即侵袭性真菌感染引起的疾病，侵袭性真菌包括念珠菌、曲霉菌、隐球菌、毛霉菌、肺孢子菌、镰刀菌、暗色真菌、毛孢子菌、组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌、马尼菲青霉、孢子丝等，优选是烟曲霉菌、白色念珠菌和新型隐球菌。
[0041]本发明的另一方面提供一种用于侵袭性真菌疾病检测的ELISA检测试剂盒，包括包被抗原、1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体和酶标二抗。所述的包被抗原为1，3-β-D-葡聚糖，例如海带多糖(Laminarin)、茯苳多糖(Pachyman)、羧甲基化茯苳多糖(Carboxymethylpachyman)、凝胶多糖(Curdlan)、羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethyl curdlan)、褐藻多糖(Paramylon)、香葫多糖(Lentinan)、地衣多糖(Pustulan)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、大麦葡聚糖(Barley glucan)、燕麦葡聚糖(Oat glucan)、右旋糖酐(Dextran)等，优选的，所述的1，3-β -D-葡聚糖选自海带多糖(Laminarin)、茯苳多糖(Pachyman)、羧甲基化茯苳多糖(Carboxymethyl pachyman)、凝胶多糖(Curdlan)、羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethylcurdlan)，最优选，所述的1，3- β -D-葡聚糖为羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethylcurdlan)。所述的1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体优选为本发明所述的1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体。所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG抗体，优选的为，HRP标记羊抗兔IgG抗体。
[0042]在本发明的一个实施方式中，所述的用于侵袭性真菌疾病检测的ELISA检测试剂盒中还包括:洗涤液、底物显色液、抗原标准品、终止液中的一种或几种。所述的洗涤液优选为PBST洗涤液，所述的底物显色液为TMB显色液。所述的抗原标准品为1，3- β -D-葡聚糖抗原。所述的终止液优选为H2SO4，更优选为2mol/L H2S04。
[0043]本发明的还一方面提供了一种侵袭性真菌疾病的检测方法，包括:(1)以1，3-β-D-葡聚糖为包被抗原制备抗原包被的酶标板；(2)使用(I)制备得到的抗原包被的酶标板，加入抗原标准品或者待检测样品，再加入1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体，混匀后37°C孵育；(3)用洗涤液洗板1-5次，加入酶标二抗，37°C孵育l_3h，洗涤液洗板1_5次，加底物显色液显色，加入终止液终止；⑷测定0D45(lnm。所述的包被抗原为1，3- β -D-葡聚糖，例如海带多糖(Laminarin)、茯苳多糖(Pachyman)、羧甲基化茯苳多糖(Carboxymethylpachyman)、凝胶多糖(Curdlan)、羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethyl curdlan)、褐藻多糖(Paramylon)、香葫多糖(Lentinan)、地衣多糖(Pustulan)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、大麦葡聚糖(Barley glucan)、燕麦葡聚糖(Oat glucan)、右旋糖酐(Dextran)等，优选的，所述的1，3-β -D-葡聚糖选自海带多糖(Laminarin)、茯苳多糖(Pachyman)、羧甲基化茯苳多糖(Carboxymethyl pachyman)、凝胶多糖(Curdlan)、羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethylcurdlan)，最优选，所述的1，3- β -D-葡聚糖为羧甲基化凝胶多糖(Carboxymethylcurdlan)。所述的1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体优选为本发明所述的1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体。所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG抗体，优选的为，HRP标记羊抗兔IgG抗体。所述的待检测样品为待检测血清。
[0044]在本发明的一个实施方式中，所述的使用侵袭性真菌疾病的检测方法，包括:(I)以1，3-β -D-葡聚糖为包被抗原制备抗原包被的酶标板；(2)使用(I)制备得到的抗原包被的酶标板，加入50 μ L抗原标准品或者待检测样品，再加入50 μ LI, 3-β -D-葡聚糖多克隆抗体，混匀后37°C孵育2h ； (3)用PBST洗涤液洗板3次，加入100 μ L HRP标记的羊抗兔IgG抗体，37°C孵育30min，PBST洗涤液洗板3次，加入TMB底物显色液显色，加入终止液终止；(4)酶标仪读取OD
450nm°
[0045]本发明所述的一种侵袭性真菌疾病的检测方法可以是治疗目的的，可以是非治疗目的的。因而，本发明还提供了一种用于非治疗目的的检测侵袭性真菌疾病的方法。
[0046]本发明提供了 1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体及其制备方法，免疫原为化学修饰和真菌提取获得，纯度好，而且能保持1，3-β-D-葡聚糖的化学结构，制备的多克隆抗体具有高效价，高特异性的特点，用SDS-PAGE显示为均一抗体产物，间接法ELISA检测显示其效价不低于1:1.28X 105，该抗体在侵袭性真菌疾病临床诊断领域中，应用前景广阔。
【附图说明】
[0047]附图1显示了 BSA修饰后的海带多糖的高效凝胶排阻色谱法检测结果。
[0048]附图2显示了 BSA修饰后的羧甲基化凝胶多糖免疫获得的兔IgG型多克隆抗体Ab-3B的SDS-PAGE检测结果。
[0049]附图3显示了 BSA修饰后的羧甲基化凝胶多糖免疫获得的兔IgG型多克隆抗体Ab-3B的效价测定结果。
[0050]附图4显示了 ELISA竞争法体系对各种菌体的特异性检测结果。
[0051]附图5显示了 ELISA竞争法体系的灵敏度检测结果。
【具体实施方式】
[0052]实施例1 1