用于治疗癌症的单克隆抗体的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为200980136101.9的中国专利申请的分案申请，原申请是2009 年9月16日提交的PCT国际申请PCT/EP2009/006704于2011年3月15日进入中国国家 阶段的申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于治疗癌症的单克隆抗体。
【背景技术】
[0003] 基于抗体的癌症疗法已被成功地引入临床中，并已在过去十年中成为肿瘤学中最 具有前景的疗法。
[0004] 与传统药物相比，基于抗体的癌症疗法具有较高特异性和较低副作用等潜力。究 其原因是抗体能够精确地区分正常和肿瘤细胞，并且它们的作用模式依赖于毒性较低的免 疫抗肿瘤机制，例如补体活化和细胞毒性免疫细胞的招募。
[0005] 基于抗体之疗法的靶标需要具有特别的性质，所述性质形成了正确区分正常细胞 和肿瘤细胞的基础。显然，仅存在于肿瘤细胞中并在正常组织中完全检测不到的靶标对于 开发有效且安全的抗体疗法来说是理想的。另一方面，高水平过表达可作为治疗窗的基础 并且副作用低，例如人类2型表皮生长因子受体（HER-2)作为基因扩增的结果，其是抗体曲 妥珠单抗（trastuzumab)(赫赛汀（Herceptin))的良好革巴标。
[0006] 用于肿瘤治疗的已经批准或在临床开发中的抗体的其它靶标具有不同的性质，它 们并非基于肿瘤细胞上靶分子的大量过表达。在针对蛋白聚糖MUC-1的抗体的情形中，该 靶标之骨架的肽重复表位在肿瘤细胞中糖基化不足，并因此与其正常对应物不同。在针对 CD20(利妥昔单抗（rituximab))、CD52(坎帕斯-lH(Campath-lH))和 CD22(依帕珠单抗 (epratuzumab))的抗体的情形中，抗体祀标在肿瘤细胞和正常淋巴细胞上具有类似的表达 水平。此时，由于靶标阴性的干细胞恢复了正常淋巴细胞群，因此利用抗体剔除正常细胞 是可耐受的。抗体靶标可接近性具有差异的另一些实例包括癌胚抗原（CEA)和碳酸酐酶 IX(CA9)。这两种抗原均分别表达于结肠和肾的正常上皮细胞上。然而，放射性标记的成像 抗体能够很好地区分肿瘤组织与正常组织，并且细胞毒性抗体耐受良好。这极有可能是由 于CA9和CEA限制性表达在正常上皮组织的腔室一侧（IgG抗体没有机会接近此处）所致。 同样地，抗原上皮细胞粘附分子（Ep-CAM)属于这一类。作为上皮细胞的同型细胞粘附分 子，其定位于细胞间隙。令人感兴趣的是，由于高亲合力的抗Ep-CAM抗体毒性很强，因此中 等亲合力的抗体耐受良好。这提示可接近正常细胞上的Ep-CAM靶标，同时还表明抗体结合 动力学可拓展治疗的领域。
[0007] 已有八种抗体被批准用于治疗肿瘤疾病，其中大多数为淋巴瘤和白血病（Adams， G. P. &Weiner，L. M. (2005) Nat. Biotechnol. 23,1147-1157)。只有 3 种单克隆抗体（mAb)(即 赫赛汀，阿瓦斯汀（Avastin)和爱必妥（Erbitux))解决了占癌症诱发死亡率90%以上的实 体癌问题。医疗中的大批需要、已提供的经批准mAb的明显临床有益效果及其巨大的商业 成功均激发了开发针对更广患者群的基于抗体之治疗以及提高其疗效的创新方法的一轮 浪潮（Brekke，0? H. &Sandlie，I. (2003)Nat. Rev. Drug Discov. 2,52-62 ;Carter，P. (2001) Nat. Rev. Cancer 1,118-129)〇
[0008] 开发下一代升级的基于抗体之癌症疗法所面临的一个挑战是选择合适的靶标分 子，这是有利的毒性/功效模式的关键所在。
[0009] 对于目前可用于治疗实体癌的抗体（由于其靶标表达在正常组织上所致）来说， 尚未充分发掘出抗体分子作用模式的全部潜能。例如，赫赛汀的祀标Her2/neu表达于许 多正常的人体组织中，包括心肌（Crone, S.A.，Zhao, Y.Y.，Fan, L.，Gu，Y.，Minamisawa， S. , Liu, Y. , Peterson, K. L. , Chen, J. , Kahn, R. , Condorelli, G?等（2002)Nat. Med. 8， 459-465)。因此，所设计的赫赛汀具有减低的免疫效价，并且不能以最高有效剂量给药，否 则将出现不能承受的毒性。这种"使具有锋利潜力的刀变钝"限制了赫赛汀的疗效。
[0010] 除了不在毒性相关的正常组织中表达以外，在肿瘤细胞表面上稳健且大量表 达以及表现出促进肿瘤的功能是理想的抗体祀标的期望特征（Houshmand，P. &Zlotnik， A. (2003)Curr. Opin. Cell Biol. 15,640-644)〇
[0011] 为了发现用于抗体治疗癌症的新靶标，我们使用综合数据挖掘和实验验证方法鉴 定出GT468。GT468是胎盘特异性基因，其在多种肿瘤特别是乳腺癌中往往异常活化并高度 表达。在MCF-7和BT-549乳腺癌细胞中，RNAi介导的GT468沉默显著破坏了运动、迁移和 侵入，并诱导G1/S细胞周期阻滞使增殖几乎完全受阻。GT468的敲低与细胞周期蛋白D1的 表达减少相关，并降低了 AKT激酶的磷酸化。此外，GT468位于癌细胞的表面上，其对于拮 抗该分子之生物功能的抗体来说是可接近的。
[0012] GT468具有使其成为极具吸引力的治疗性抗体之靶标的若干特性。作为仅在如怀 孕这样的特别时期才在人体中出现的细胞谱系分化抗原，它在健康的毒性相关组织中不存 在，如同自身抗原可能的情形一样。它在多种肿瘤实体中的高普遍性使众多患者可以采用 GT468靶向疗法来治疗。例如在乳腺癌的情形中，82%的患者携带该靶标。相反地，赫赛汀 的靶标Her2/neu(唯一可用于治疗这种癌症类型的mAb)仅在20-25%的乳腺癌患者中过表 (Slamon, D. J. , Godolphin, ff. , Jones, L. A. , Holt, J. A. , Wong, S. G. , Keith, D. E. , Levin, W.J.，Stuart, S.G.，Udove，J.，Ullrich, A?等（1989) Science 244,707-712)。对于 GT468 分别在42%和58%的病例中表达的肺癌和胃癌来说，由于这些癌症类型缺少合适的靶标， 到目前为止尚无经批准的mAb疗法。
[0013] 可将针对活细胞上GT468之抗体用于开发成药物，这种抗体可表现出抗肿瘤效果 例如增殖抑制。GT468不仅参与增殖，而且还参与细胞的运动、迁移和侵入。最令人感兴趣 的是，所有这些属性不仅充分造就了肿瘤表型，而且还是人滋养层细胞的固有特性，所述滋 养层细胞的生理特征是生长快速并且有效侵入子宫组织。预期可对GT468的mAb进行改造， 使其以最大潜力地迅速介入所有这些作用来介导免疫效应功能（例如ADCC和⑶C)。
【发明内容】
[0014] 本发明一般地提供可用作治疗和/或预防与表达GT468和/或特征在于其细胞 表面与GT468缔合之疾病的抗体，所述疾病包括肿瘤相关疾病例如癌症，尤其是乳腺癌、肺 癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、结肠癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、肾癌（尤其是肾细胞癌）、前 列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌和甲状腺癌，及 其转移形式。在一个实施方案中，所述癌症疾病是肺中的转移癌。
[0015] 一方面，本发明涉及能够与GT468结合的抗体。本文所述的抗体优选地是分离的 单克隆抗体，所述抗体特异性地与GT468上存在的表位结合，优选地与GT468的细胞外结构 域中的表位结合，更优选地与SEQ ID N0 :3-10和35-82结合。优选地，所述抗体能够与位 于细胞表面的GT468结合，优选地与位于GT468细胞外结构域的一个或多个表位（优选地 在GT468的23-212位氨基酸残基中）结合，最优选地与位于SEQ ID N0 :3-10和35-82氨 基酸序列之一中的表位结合。在一个优选的实施方案中，所述抗体对SEQ ID N0 :3-10和 35-82氨基酸序列之一个或多个具有特异性。在多个实施方案中，所述抗体能够结合包含 SEQ ID N0 :2的29至119位氨基酸的肽，优选29至212位氨基酸，更优选23至212位氨 基酸。
[0016] 本发明所包括的单克隆抗体包括IgA、IgGl-4、IgE、IgM和IgD抗体。在一个实施 方案中，抗体是IgGl抗体，更尤其是IgGl、K同种型或IgGl、X同种型。在另一个实施方 案中，抗体是IgG3抗体，更尤其是IgG3、K同种型或IgG3、X同种型。在又一个实施方案 中，抗体是IgG4抗体，更尤其是IgG4、K同种型或IgG4、X同种型。还在另一个实施方案 中，抗体是IgAl或IgA2抗体。还在另一个实施方案中，抗体是IgM抗体。
[0017] 在一个实施方案中，本发明的抗体结合一种或多种根据SEQ ID N0 :75-79的肽。 在一个实施方案中，抗体结合根据SEQ ID N0:75的肽和/或根据SEQ ID N0:76的肽，更优 选地结合根据SEQ ID N0 :75的肽和根据SEQ ID N0 :76的肽。在另一个实施方案中，抗体 结合根据SEQ ID N0 :77的肽和/或根据SEQ ID N0 :78的肽和/或根据SEQ ID N0 :79的 肽，更优选地结合根据SEQ ID N0:78的肽和根据SEQ ID N0:79的肽，或结合根据SEQ ID NO : 77的肽、根据SEQ ID NO :78的肽和根据SEQ ID NO : 79的肽。
[0018] 在一个实施方案中，使用根据SEQ ID NO :4的肽或根据SEQ ID NO :80的肽进行免 疫，获得本发明的抗体。在另一个实施方案中，使用根据SEQ ID N0 :6的肽或根据SEQ ID NO :81的肽进行免疫，获得本发明的抗体。优选地，本发明的抗体结合一种或多种所述肽。 [0019] 在又一个实施方案中，使用根据SEQ ID N0 :4的肽或根据SEQ ID N0 :80的肽进行 免疫，获得下述抗体，所述抗体结合根据SEQ ID N0:75的肽和/或根据SEQ ID N0:76的 肽，更优选地结合根据SEQ ID NO :75的肽和根据SEQ ID NO :76的肽。在另一个实施方案 中，使用根据SEQ ID N0 :6的肽或根据SEQ ID N0 :81的肽进行免疫，获得下述抗体，所述抗 体结合根据SEQ ID N0 :77的肽和/或根据SEQ ID N0 :78的肽和/或根据SEQ ID N0 :79 的肽，更优选地结合根据SEQ ID NO :78的肽和根据SEQ ID NO :79的肽或结合根据SEQ ID NO : 77的肽、根据SEQ ID NO :78的肽和根据SEQ ID NO : 79的肽。
[0020] 在一个实施方案中，本发明的抗体结合一种或多种根据SEQ ID NO :61-66的肽。 在一个实施方案中，抗体结合根据SEQ ID NO :61的肽和/或根据SEQ ID NO :62的肽，更 优选地结合根据SEQ ID N0 :61的肽和根据SEQ ID N0 :62的肽。在另一个实施方案中，抗 体结合根据SEQ ID N0 :64的肽和/或根据SEQ ID N0 :65的肽，更优选地结合根据SEQ ID NO :64的肽和根据SEQ ID NO :65的肽。在另一实施方案中，抗体结合根据SEQ ID NO :65 的肽和/或根据SEQ ID NO :66的肽，更优选地结合根据SEQ ID NO :65的肽和根据SEQ ID NO :66的肽。
[0021] 在一个实施方案中，使用根据SEQ ID NO :82的肽进行免疫，获得本发明的抗体。 优选地，本发明的抗体结合所述肽。根据SEQ ID N0 :82的肽具有C-端GS-连接子，所述连 接子被添加以帮助肽的1和16位氨基酸之间二硫键的形成。推测所述肽与GT468的天然 构象相似。由使用SEQ ID N0 :82的肽进行免疫获得的杂交瘤51-1A-1所生产的抗体对表 达GT468的癌细胞的增殖和集落形成显示强抑制活性。
[0022] 在又一个实施方案中，使用根据SEQ ID N0 :82的肽进行免疫，获得下述抗体，所述 抗体结合根据SEQ ID N0 :64的肽和/或根据SEQ ID N0 :65的肽，更优选地结合根据SEQ ID N0 :64的肽和根据SEQ ID N0 :65的肽，或者所述抗体结合根据SEQ ID N0 :65的肽和/ 或根据SEQ ID N0:66的肽，更优选地结合根据SEQ ID N0:65的肽和根据SEQ ID N0:66的 肽。
[0023] 在一个实施方案中，本发明的抗体结合一种或多种根据SEQ ID N0 :57_60的肽。在 一个实施方案中，抗体结合根据SEQ ID N0 :57的肽和/或根据SEQ ID N0 :58的肽和/或 根据SEQ ID N0 :59的肽，更优选地结合根据SEQ ID N0 :57的肽和根据SEQ ID N0 :58的 肽和根据SEQ ID N0:59的肽。在另一个实施方案中，抗体结合根据SEQ ID N0:59的肽和 /或根据SEQ ID NO :60的肽，更优选地结合根据SEQ ID NO :59的肽和根据SEQ ID NO :60 的肽。
[0024] 优选地，本发明的抗体与癌细胞结合，尤其是本文所述之癌症类型的细胞，优选不 与非癌细胞显著结合，更优选地不与除胎盘细胞和睾丸细胞之外的非癌细胞显著结合。优 选地，所述抗体与表达GT468和/或特征在于其细胞表面与GT468缔合之细胞（例如癌细 胞）的结合介导杀死所述细胞和/或抑制该细胞的一种或多种活性（例如运动、迁移、侵 入、增殖和集落形成）。优选地，抗体抑制所述细胞的增殖和/或集落形成。
[0025] 本发明的抗体杀死细胞和/或抑制细胞的一种或多种活性（尤其是细胞增殖和/ 或集落形成）优选地通过该抗体与所述细胞表达的GT468结合和/或与所述细胞的细胞表 面相互作用来诱导。这样杀死细胞和/或抑制细胞的一种或多种活性可用于本文所述的治 疗中。具体而言，杀死细胞和/或抑制细胞增殖和/或抑制细胞集落形成可用于治疗或预 防癌症，包括癌症转移。抑制细胞的运动、迁移、侵入、增殖和/或集落形成可尤其用于治疗 或预防癌症转移和癌细胞转移性传播。
[0026] 优选地，所述表达GT468和/或特征在于其细胞表面与GT468缔合的细胞是癌细 胞，尤其选自以下癌症疾病的致瘤性癌细胞：乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝细胞癌、结肠 癌、胰腺癌、食管癌、头颈癌、肾癌（尤其是肾细胞癌）、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓 瘤、神经母细胞瘤、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌和甲状腺癌，及其转移形式。在一个实施方案中， 所述癌症疾病是肺中的转移癌。
[0027] 本发明的抗体可附着至一种或多种治疗效应物部分（therapeutic effector moieties)，例如放射性标签、细胞毒素、治疗性酶、诱导凋亡的试剂等等，从而提供定向的 细胞毒性，即杀死肿瘤细胞。
[0028] 优选地，本发明的抗体通过诱导补体依赖性细胞毒作用（CDC)介导的裂解、抗体 依赖性细胞毒作用（ADCC)介导的裂解、细胞凋亡、同质性粘附（homotypic adhesion)和/ 或吞噬作用（优选地通过诱导CDC介导的裂解和/或ADCC介导的裂解）来杀死细胞。然 而，本发明还包括下述实施方案，其中抗体发挥其如本文所述的活性，如杀死细胞和/或抑 制细胞的一种或多种活性，例如细胞增殖和/或集落形成，而不诱导补体依赖性细胞毒性 (CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒作用（ADCC)介导的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬 作用。例如，本发明的抗体也可简单地通过与细胞表面上的GT468结合而发挥作用，从而例 如阻断细胞的增殖。在一个实施方案中，本发明的抗体不诱导CDC介导的细胞裂解。
[0029] 优选地，ADCC介导的细胞裂解在效应细胞（在一些具体实施方案中选自单核细胞 (monocyte)、单个核细胞（mononuclear cell)、NK细胞和PMN)存在时发生，而吞噬作用由 巨噬细胞实现。
[0030] 在一个尤其优选的实施方案中，本发明的抗体具有抑制或降低表达GT468和/或 特征在于其细胞表面与GT468缔合之细胞（优选癌细胞如乳腺癌细胞）增殖的活性。可以 在使用溴脱氧尿苷（5-溴-2-脱氧尿苷，BrdU)的实验中，通过测定表达GT468的癌细胞的 增殖来体外测量这一活性。BrdU是合成的核苷，其为胸苷的类似物并且可以在DNA复制期 间代替胸苷，掺入正在复制的细胞（细胞周期的S期）新合成的DNA中。使用例如对BrdU 具有特异性的抗体检测所掺入的化学品，这指示了活跃地复制其DNA的细胞。可以使用细 胞系 BT-549、Caov-3、EF0-21、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-468 和 MDA-MB-231 作为表达 GT468 的癌细胞。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体抑制或降低细胞系SK-BR-3、MCF-7和 MDA-MB-468中一种或多种的增殖，优选地抑制或降低细胞系SK-BR-3和MCF-7二者的增 殖，最优选地抑制或降低SK-BR-3、MCF-7和MDA-MB-468全部细胞系的增殖。在这一方面中 优选的本发明抗体选自：（i)由杂交瘤 35-48B-l、35-50A-2a、38-10B-l、38-lA-l、45-2A-l、 45-8A-2、48-3B-l、48-4A-l、49-3A-l、51-lA-l、53-13A-2、53-29Al、56-4A-2、62-