血清溶解并稀释，使血清样本中含100000、10000、1000、100、10和Ing/mL的菌粉，放入37°C恒温箱中孵育2d。
[0126]血清样本处理:将血清样本和样本处理液混合，加热孵育，高速离心收集上清液。样本处理液为EDTA处理液、甘氨酸处理液和蛋白酶处理液等中的一种。
[0127]最后用间接ELISA竞争法体系检测不同浓度的处理后的含菌血清样本。
[0128]实验结果见附图4，由图看出，该抗体能有效的从血清样本中的检出3种常见的真菌性病原菌(包括烟曲霉菌、白色念珠菌和新型隐球菌)，并且对5种常见的细菌性病原菌(包括结核分枝杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌)抗干扰能力强。证明抗体用于侵袭性真菌疾病检测具有高特异性。
[0129](2) ELISA竞争法体系的灵敏度验证
[0130]1，3_β-D-葡聚糖标准品的制备:用样本稀释液将海带多糖、茯苓多糖和凝胶多糖稀释到 10000、1000、100、10、1、0.I 和 0.01ng/mL，样本稀释液为 0.lmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 8.5)、0.lmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、0.lmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)等中的一种。
[0131]最后用间接ELISA竞争法体系检测上述不同浓度的1，3_β-D-匍聚糖抗原标准品O
[0132]实验结果见附图5，由图看出，该间接ELISA竞争法体系对海带多糖、茯苓多糖和凝胶多糖的检测下限至少能达到1、0.1和0.01ng/mL。
[0133]本说明书上文中结合【具体实施方式】对本发明进行了阐释，但应理解，这些描述和阐释只是为了更好地理解本发明，而不构成对本发明的任何限定。本领域技术人员在阅读了本申请说明书之后可对本发明的【具体实施方式】进行必要的改动而不脱离本发明的精神和范围。本发明的保护范围由所附的权利要求书限定，并且涵盖了权利要求的等同变换。
【主权项】
1.一种抗1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体，其特征在于，其制备方法包括: (1)制备1，3-β-D-葡聚糖免疫原； (2)用1，3-β-D-葡聚糖免疫原进行动物免疫； (3)从免疫后的动物体内取血； (4)依次用饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清纯化，得到多克隆抗体。
2.权利要求1所述的一种抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体，其特征在于，所述的步骤(1)包括:将1，3-β -D-匍聚糖和偶联蛋白偶联制备得到1，3- β -D-匍聚糖免疫原；所述的1，3-β-D-葡聚糖选自海带多糖、茯苓多糖、羧甲基化茯苓多糖、凝胶多糖、羧甲基化凝胶多糖、褐藻多糖、香菇多糖、地衣多糖、酵母葡聚糖、大麦葡聚糖、燕麦葡聚糖、右旋糖酐；所述的偶联蛋白选自牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、破伤风毒素、鸡卵清白蛋白； 或者，所述的步骤(I)包括:将真菌孢子和/或菌体培养后破碎获得破碎液制备得到1，3-β-D-葡聚糖免疫原；所述的真菌选自曲霉菌(Aspergillus)、念珠菌(Candidaalbaican)、隐球菌(Crytococcus)、毛霉菌(Mucor)、马尔尼菲青霉(Penicilliummarneffei)、谦刀菌(Fusarium)、卡氏月市抱子菌(Penumocystis carinii bacteria)。
3.权利要求1所述的一种抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体，其特征在于，所述的步骤(2)中动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或两种以上；所述的免疫采用皮下注射法、脾内注射法、静脉注射法、腹腔注射法中的一种；所述的免疫的免疫剂量为1-1OOOyg/ 只 / 次。
4.权利要求1所述的一种抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体，其特征在于，所述的步骤(3)中，从免疫后的动物体内取血前，还包括测定免疫后动物的血清效价的步骤。
5.权利要求1所述的一种抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体，其特征在于，所述的步骤(4)中，所述的饱和硫酸铵盐析沉淀法包括:取步骤(3)得到的血清，加等体积的生理盐水，再加入饱和硫酸铵溶液，0-10°C沉淀过夜；10000G离心5-20min，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，0-10°C静置0.5-2h ； 10000G离心5_20min，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液0-10°C透析过夜； 和/或，所述的步骤(4)中，所述亲和层析法包括:用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗I, 3- β -D-葡聚糖多克隆抗体。
6.权利要求1-5任一项所述的一种抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体，其特征在于，用I,3- β -D-葡聚糖包被，间接法ELISA检测显示其效价不低于1: 1.28 X 105。
7.一种抗1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括: (1)制备1，3-β-D-葡聚糖免疫原； (2)用1，3-β-D-葡聚糖免疫原进行动物免疫； (3)从免疫后的动物体内取血； (4)依次用饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清纯化，得到多克隆抗体。
8.权利要求7所述的一种抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括:⑴制备1，3-β -D-葡聚糖免疫原:将I, 3-β -D-葡聚糖和Na14溶液混合，室温避光反应0.5-3小时，用色谱柱脱盐，将得到的溶液中加入牛血清白蛋白和NaBH3CN溶液，室温振荡反应，加入NaBH4溶液，室温振荡反应，用磷酸盐缓冲液透析，离心除去沉淀； 或者，将1，3- β -D-葡聚糖免疫原和4- (4，6- 二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐溶液混合，振荡反应，超纯水透析过夜，加入BSA,室温避光振荡过夜，离心除去沉淀； 或者，将致病真菌经液体培养基发酵收集菌体，用含体积百分比1-10%甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，菌体倒入液氮研磨破碎，收集上清液； 或者，将致病真菌经平皿固体培养后，洗脱收集孢子，用含体积百分比1-10%甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，孢子用超声破碎，收集上清液； (2)用1，3-β-D-葡聚糖免疫原进行动物免疫:将步骤(I)得到的1，3-β-D-葡聚糖免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对动物进行皮下多点注射，免疫剂量为每只动物10-1000 μ g，初次免疫后每2-4周免疫I次，免疫次数多3次； (3)从免疫后的动物体内取血:测定免疫后动物的血清效价后，用颈动脉放血的方法采血，待血液凝固，血清分离出后，离心，取上清； (4)依次用饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清纯化，得到多克隆抗体: 所述的饱和硫酸铵盐析沉淀法包括:取步骤(3)得到的血清，加等体积的生理盐水，再加入饱和硫酸铵溶液，0-10°C沉淀过夜；10000G离心5-20min，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，0-10°C静置0.5-2h ； 10000G离心5_20min，弃上清，将沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液0-10°C透析过夜； 所述的亲和层析法包括:用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗1，3- β -D-葡聚糖多克隆抗体。
9.权利要求1所述的一种抗1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体在制备用于侵袭性真菌疾病检测的试剂盒中的应用。
10.权利要求9所述的抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体在制备用于侵袭性真菌疾病检测的试剂盒中的应用，其特征在于，所述的侵袭性真菌选自念珠菌、曲霉菌、隐球菌、毛霉菌、肺孢子菌、镰刀菌、暗色真菌、毛孢子菌、组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌、马尼菲青霉、孢子丝中的一种或两种以上。
11.一种用于侵袭性真菌疾病检测的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括包被抗原、权利要求1所述的1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体和酶标二抗；所述的包被抗原为I,3- β -D-葡聚糖；所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG抗体。
12.权利要求11所述的一种用于侵袭性真菌疾病检测的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括:洗涤液、底物显色液、抗原标准品、终止液中的一种或两种以上。
13.一种利用权利要求11-12所述的ELISA检测试剂盒检测侵袭性真菌疾病的方法，其特征在于，包括:(I)以1，3-β-D-葡聚糖为包被抗原制备抗原包被的酶标板；(2)使用(I)制备得到的抗原包被的酶标板，加入抗原标准品或者待检测样品，再加入1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体，混匀后37°C孵育；(3)用洗涤液洗板1-5次，加入酶标抗体，37°C孵育l_3h，洗涤液洗板1-5次，加底物显色液显色，加入终止液终止；(4)测定OD45Qnm。
14.权利要求13所述的ELISA检测试剂盒检测侵袭性真菌疾病的方法，其特征在于，所述的检测侵袭性真菌疾病的方法是非治疗目的的。
【专利摘要】本发明涉及针对1,3-β-D-葡聚糖抗原的一种多克隆抗体、制备方法以及该多克隆抗体在制备的ELISA检测试剂盒中的应用。该抗体制备方法包括：(1)制备1,3-β-D-葡聚糖免疫原；(2)用1,3-β-D-葡聚糖免疫原进行动物免疫；(3)从免疫后的动物体内取血；(4)依次用饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清纯化，得到多克隆抗体。用本发明方法制备抗体具有高效价、高特异性和高纯度的特点，在侵袭性真菌疾病临床诊断领域中应用前景广阔。
【IPC分类】C07K16-44, G01N33-569
【公开号】CN104628861
【申请号】CN201510054177
【发明人】周泽奇, 严俊, 刘春龙, 李宁, 粟艳
【申请人】丹娜（天津）生物科技有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月3日