，3-β-D-葡聚糖免疫原的制备
[0053](I)海带多糖和BSA偶联制备免疫原
[0054]将1mL 20mg/mL海带多糖溶液和0.5mL 5mol/LNa104溶液混合，室温避光反应60min，用S印hadex-G25柱脱盐。上述溶液中加入抗原海带多糖质量1_10倍的BSA和NaBH3CN溶液，室温振荡反应。加入NaBH4溶液，室温振荡反应。用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析过夜。最后离心除去沉淀。
[0055](2)羧甲基化茯苓多糖或羟甲基化凝胶多糖和BSA偶联制备免疫原
[0056]将羧甲基化茯苓多糖或羟甲基化凝胶多糖溶液和DMTMM溶液混合，振荡反应，超纯水透析过夜，加入抗原羧甲基化茯苓多糖或羟甲基化凝胶多糖质量1-10倍的BSA，室温避光振荡过夜，最后离心除去沉淀。
[0057](3)采用真菌菌体和孢子制备免疫原
[0058]将常见的致病真菌经液体培养基发酵收集菌体，经平皿固体培养洗脱收集孢子，用含甲醛的生理盐水灭活，多次洗涤除去甲醛，菌体倒入液氮研磨破碎，收集上清液，孢子用血球板法计数后，超声破碎，得到免疫原。
[0059]实施例2 I, 3-β -D-葡聚糖免疫原的鉴定
[0060]使用高效凝胶排阻色谱法，取实施例1中按照(I)和(2)的方法制备得到的BSA修饰后的1，3-β -D-葡聚糖适当稀释，以5mg/mL的BSA溶液作为对照。色谱条件:色谱柱为TSK-GELG3000SWXL,进样体积为20 μ L，柱温为常温，流动相为0.3mol/L氯化钠-0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PH6.8)溶液，流速为lmL/min，检测波长为280nm。
[0061]其中BSA修饰后的海带多糖的鉴定结果见附图1。
[0062]实施例3抗1，3- β -D-葡聚糖多克隆抗体的制备
[0063](I)免疫动物
[0064]将实施例1⑴中得到的1，3-β -D-葡聚糖免疫原(经BSA修饰的海带多糖)与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.01-lmg。免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫I次，方法与第I次相同。
[0065](2)多克隆抗体纯化
[0066]I)效价测定:免疫过程中，免疫后每隔几天采血测效价I次，免疫次数不少于3次。
[0067]2)分离抗血清:血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，-20 0C保存。
[0068](3)用饱和硫酸钱盐析法进行初步纯化
[0069]I)取2mL抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，4°C沉淀过夜。
[0070]2) 10000G低温离心lOmin，弃上清，将沉淀用2mL磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加ImL饱和硫酸铵溶液，4°C静置Ih。
[0071]3) 10000G低温离心lOmin，弃上清，将沉淀用ImL磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液4°C透析过夜。
[0072](4)用亲和层析的方法进一步纯化
[0073]I)用10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
[0074]2)用10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0075]3)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
[0076]4)用10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0077]5)用5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测器检测，收集蛋白峰即为抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体；
[0078]6)用lmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)调至pH值中性，用磷酸盐缓冲液透析过夜。
[0079]其中，层析柱中用葡萄球菌A蛋白交联的固相载体作为柱填料，洗脱缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 4.2)，偶联缓冲液为0.lmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。
[0080]实施例4抗1，3- β -D-葡聚糖多克隆抗体的制备
[0081](I)免疫动物
[0082]将实施例1⑵中得到的1，3-β -D-葡聚糖免疫原(经BSA修饰的羟甲基化茯苓多糖)与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.0l-1mgo免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫I次，方法与第I次相同。
[0083](2)多克隆抗体纯化
[0084]I)效价测定:免疫过程中，免疫后每隔几天采血测效价I次，免疫次数不少于3次。
[0085]2)分离抗血清:血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，-20 0C保存。
[0086](3)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化
[0087]I)取2mL抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，4°C沉淀过夜。
[0088]2) 10000G低温离心lOmin，弃上清，将沉淀用2mL磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加ImL饱和硫酸铵溶液，4°C静置Ih。
[0089]3) 10000G低温离心lOmin，弃上清，将沉淀用ImL磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液4°C透析过夜。
[0090](4)用亲和层析的方法进一步纯化
[0091]I)用7.5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
[0092]2)用7.5倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0093]3)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
[0094]4)用7.5倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0095]5)用4倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测器检测，收集蛋白峰即为抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体；
[0096]6)用lmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)调至pH值中性，用磷酸盐缓冲液透析过夜。
[0097]其中，层析柱中用1，3_β-D-葡聚糖抗原交联的固相载体作为柱填料，洗脱缓冲液为柠檬酸缓冲液(pH 4.5)，偶联缓冲液为0.lmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)。
[0098]实施例5抗1，3- β -D-葡聚糖多克隆抗体的制备
[0099](I)免疫动物
[0100]将实施例1(2)中得到的1，3-β-D-葡聚糖免疫原(经BSA修饰的羟甲基化凝胶多糖)与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.0l-1mgo免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫I次，方法与第I次相同。
[0101](2)多克隆抗体纯化
[0102]I)效价测定:免疫过程中，免疫后每隔几天采血测效价I次，免疫次数不少于3次。
[0103]2)分离抗血清:血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，-20 0C保存。
[0104](3)用饱和硫酸钱盐析法进行初步纯化
[0105]I)取2mL抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，4°C沉淀过夜。
[0106]2) 10000G低温离心lOmin，弃上清，将沉淀用2mL磷酸盐缓冲液溶解，缓慢滴加ImL饱和硫酸铵溶液，4°C静置Ih。
[0107]3) 10000G低温离心lOmin，弃上清，将沉淀用ImL磷酸盐缓冲液溶解，用磷酸盐缓冲液4°C透析过夜。
[0108](4)用亲和层析的方法进一步纯化
[0109]I)用5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
[0110]2)用5倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0111]3)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
[0112]4)用5倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0113]5)用2倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测器检测，收集蛋白峰即为抗1，3-β-D-葡聚糖多克隆抗体；
[0114]6)用lmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)调至pH值中性，用磷酸盐缓冲液透析过夜。
[0115]其中，层析柱中用葡萄球菌A蛋白交联的固相载体作为柱填料，洗脱缓冲液为柠檬酸缓冲液(pH 4.5)，偶联缓冲液为0.lmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。
[0116]实施例6抗1，3-β -D-葡聚糖多克隆抗体的验证
[0117](I) SDS-PAGE 电泳检测
[0118]对实施例5制得的抗体Ab-3B进行SDS-PAGE电泳，得到的凝胶进行考马斯亮蓝染色。
[0119]实验结果见附图2，由图中可看出，在25kD和50kD分子量区有清晰明显的条带，证明抗体纯度高。
[0120](2)抗体效价测定
[0121]用间接ELISA法对实施例5制得的抗体Ab_3B抗体效价进行测定。所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，阴性对照为磷酸盐缓冲液。检测结果见附图3，从结果可看出，该抗体效价大于1:1.28X 105，表明抗体效价高。
[0122]实施例7 ELISA竞争法体系的建立和验证
[0123]以羧甲基化凝胶多糖作为包被抗原，抗体Ab_3B和HRP标记羊抗兔IgG抗体作为检测抗体，建立了间接ELISA竞争法检测体系。检测方法如下:使用抗原包被的酶标板，分别依次加入50 μ L抗原标准品(或者处理后的血清)和50 μ L抗体Ab-3B，混匀后37°C孵育2h，PBST洗板3次，加入100 μ L HRP标记的羊抗兔IgG抗体，37°C孵育30min，PBST洗板3次，最后加TMB底物溶液显色后终止，酶标仪读取0D45Qnm。
[0124](I) ELISA竞争法体系的特异性验证
[0125]含菌血清样本的制备:分别称量1mg灭活处理的菌体干粉(菌体包括烟曲霉菌、白色念珠菌、新型隐球菌、结核分枝杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌)，用健康人