Cp4-epsps特异性纳米抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种针对于CP4-EPSPS蛋白的纳 米抗体及其编码序列以及其在该领域中的应用。
【背景技术】
[0002] 5_ 稀醇式丙酮莽草酸 _3_ 磷酸合酶（5-enolpyruvyl-shikimate_3-phosp hate synthase，EPSPS:EC 2. 5. 1. 19)是除草剂草甘膦的革E标酶，而来自根癌农杆菌 (Agrobacterium sp.) CP4菌株的EPSPS对高浓度的草甘膦表现出极高的抗性，因此 cp4-印sps基因被广泛应用于多种作物的转基因研宄中，其编码的CP4-EPSPS是莽草酸途 径中的关键酶，能够催化磷酸稀醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP)与莽草酸-3-磷 酸（shikimate-3_phosphate，SP3)生成5-稀醇式丙酮莽草酸-3-磷酸（EPSP)。向农作物 体内转入这种基因可使其获得除草剂草甘膦的抗性，然而，转基因食品的安全问题越来越 受到消费者的关注，因此，建立一套快速、特异的转基因检测体系显得尤为重要。1993年， 比利时科学家C. Hamers-Casterman等首次在《Nature》上报道：在骆蛇血液中的抗体，有 一半没有轻链，而且，这些缺失轻链的"重链抗体"（heavy-chain antibodies, HCAbs)能像 正常抗体一样与抗原等靶标紧密结合，并且不像单链抗体scFv那样互相沾粘，甚至聚集成 块。这种抗体只包含一个重链可变区（variable domain of heavy chain of HCAb，VHH) 和两个常规的CH2与CH3区，更重要的是单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳 定性与抗原结合活性。VHH是目前已知的可结合目标抗原的最小单位，所以VHH也称纳米 抗体（Nanobody，Nb)。纳米抗体具有独特的性质如相对分子质量小、水溶性好、稳定性强、 抗原识别能力强、易于生产等。因此在生物技术和医学应用方面，比其他抗体具有优越性。 所以，应用纳米抗体技术研发CP4-EPSPS检测试剂具有广阔的前景。
【发明内容】
[0003] 发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种针对CP4-EPSPS蛋 白的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测试剂中的应用。
[0004] 技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] 一种CP4-EPSPS特异性纳米抗体，它的VHH链包括框架区和互补决定区，所述框架 区FR包括以下氨基酸序列：SEQIDN0:1所示的FR1，SEQIDN0:2所示的FR2，SEQIDNO: 3所示的FR3，SEQIDN0:4所示的FR4;所述互补决定区CDR包括以下氨基酸序列：SEQID NO:5 所示的CDR1，SEQIDNO:6 所示的CDR2,SEQIDNO:7 所示的CDR3。
[0006] 进一步的，在本发明中，包括具有SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的VHH链。
[0007] 一种DNA分子，它编码CP4-EPSPS特异性纳米抗体的VHH链，或CP4-EPSPS特异性 纳米抗体。
[0008] 进一步的，在本发明中，所述DNA分子包括核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。
[0009] 进一步的，在本发明中，所述的CP4-EPSPS特异性纳米抗体在CP4-EPSPS蛋白检测 方面的应用。
[0010] 有益效果：本发明提供的针对CP4-EPSPS蛋白的纳米抗体，首先将CP4-EPSPS蛋白 偶联在酶标板上，展示该蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选 免疫纳米抗体基因库，从而获得了 CP4-EPSPS特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠 杆菌中，从而建立能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。通过本发明所公布的CP4-EPSPS 特异性纳米抗体，研发针对CP4-EPSPS蛋白特异性的检测试剂，可用于检测转基因食品，以 解决现有的转基因食品检测方法成本高、操作复杂、特异性差的问题。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明CP4-EPSPS特异性纳米抗体的DNA的电泳图；其中泳道M表示蛋白 分子量标准，泳道1为聚合酶链式反应PCR的产物；
[0012] 图2为本发明CP4-EPSPS特异性纳米抗体的电泳图；其中泳道M表示蛋白分子量 标准，泳道1为CP4-EPSPS特异性纳米抗体。
【具体实施方式】
[0013] 本发明将CP4-EPSPS蛋白偶联在酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，以此形 式的抗原筛选免疫纳米抗体基因库，优选骆驼重链抗体噬菌体展示基因库，而获得了能在 大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
[0014] 下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
[0015] 实施例1 :针对于CP4-EPSPS特异性纳米抗体文库的构建：
[0016] (1-1)首先将lmg CP4-EPSPS与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼，每周 一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；
[0017] (1-2) 7次免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA ;
[0018] (1-3)合成互补脱氧核糖核酸cDNA并利用巢式聚合酶链式反应PCR扩增VHH链；
[0019] (1-4)利用限制性内切酶Pst I及Not I酶切20ug pComb3噬菌体展示载体及 10 y gVHH链，并连接两个片段；
[0020] (1-5)将连接产物转化至感受态细胞TG1中，构建CP4-EPSPS纳米抗体文库并测定 库容，库容大小为3.6X10 9。
[0021] 如图1所示，PCR产物电泳条带大小约为500bp。
[0022] 实施例2 :针对CP4-EPSPS的纳米抗体筛选过程：
[0023] (2-1)将溶解在pH 8. 2的lOOmM似110)3溶液中的20 y g CP4-EPSPS蛋白偶联在 NUNC酶标板上，4 °C放置过夜；
[0024] (2-2)第二天加入lOOyL 0? 1%酪蛋白，室温封闭2h ;
[0025] (2_3)2h后，加入lOOyL噬菌体，即5X10ntfu免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基 因库，室温作用lh ;
[0026] (2-4)用0? 05% PBS+Tween-20 (PBST)洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体；
[0027] (2_5)用 lOOmM 三乙醇胺（triethylamine，TEA)将与 CP4-EPSPS 特异性结合的噬 菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，37°C培养lh，产生并纯化噬菌体用于 下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，逐步得到富集。
[0028] 实施例3 :用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：
[0029] (3-1)从上述3轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单菌落并接种于 含有100 U g/mL的氨苄青霉素的诱导蛋白液体培养基即TB培养基（1L的TB培养基中含有 2. 3g磷酸二氢钾，12. 52g磷酸氢二钾，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油）中，生长至对 数期后，加入终浓度为ImM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)作为诱导剂，28°C培养过夜；
[0030] (3-2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的酶联免疫吸附测 定（ELISA)板中，在室温下放置lh ;
[0031] (3-3)用PBST洗去未结合的抗体，加入抗鼠抗HA抗体（mouse anti-HA tag antibody，北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下作用lh ;
[0032] (3-4)用PBST洗去未结合的抗体，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体 (anti-mouse alkaline phosphatase conjugate，艾美捷科技有限公司），在室温下作用 lh ；
[0033] (3-5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在 405nm波长，读取吸收值；
[0034] (3-6)当样品孔0D值大于对照孔0D值2倍以上时，判为阳性克隆孔；
[0035] (3-7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100 y g/mL的氨苄青霉素的LB培养基中以便 提取质粒并进行测序。
[0036] 根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把⑶R1，⑶R2,⑶R3 序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，其抗体的VHH链的氨 基酸序列如SEQ ID NO :8所示。
[0037] 实施例4 :CP4_EPSPS特异性纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：
[0038] (3-1)将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将 其涂布在LA+glucose (即含有氨苄青霉素和葡萄糖）的培养平板上，37°C培养过夜；
[0039] (3-2)挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C摇床培养过 夜；
[0040] (3-3)接种lmL的过夜菌种至330mL TB培养液中，37°C摇床培养，培养到0D值达 到0? 6~1. 0时，加入IPTG，28°C摇床培养过夜；
[0041] (3-4)离心，收菌；
[0042] (3-5)利用渗透法，获得抗体粗提液；
[0043] (3-6)经镍柱离子亲和层析可得到纯度较高的CP4-EPSPS特异性纳米抗体。如图 2所示，CP4-EPSPS Nb的分子量为14. 7kDa，等电点pi为8. 40,在大肠杆菌WK6中表达的产 量约为7. 8mg/L。
[0044] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种CP4-EPSPS特异性纳米抗体，其特征在于，它的VHH链包括框架区和互补决定 区，所述框架区FR包括以下氨基酸序列：SEQ ID N0:1所示的FR1，SEQ ID N0:2所示的FR2， SEQ ID N0:3所示的FR3, SEQ ID N0:4所示的FR4;所述互补决定区CDR包括以下氨基酸 序列：SEQ ID NO :5 所示的 CDR1，SEQ ID NO :6 所示的 CDR2, SEQ ID NO :7 所示的 CDR3。
2. 根据权利要求1所述的CP4-EPSPS特异性纳米抗体，其特征在于，包括具有SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的VHH链。
3. -种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1或2所述的CP4-EPSPS特异性纳米抗 体的VHH链，或权利要求2所述的CP4-EPSPS特异性纳米抗体。
4. 根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO :9所 不〇
5. 根据权利要求1或2所述的CP4-EPSPS特异性纳米抗体在CP4-EPSPS蛋白检测方面 的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种CP4-EPSPS特异性纳米抗体及其应用，并公开了其氨基酸序列以及编码该纳米抗体的基因序列。通过本发明所公布的CP4-EPSPS特异性纳米抗体，研发针对CP4-EPSPS蛋白特异性的检测试剂，可用于检测转基因食品，以解决现有的转基因食品检测方法成本高、操作复杂、特异性差的问题。
【IPC分类】C12N15-13, C07K16-40, G01N33-573
【公开号】CN104628860
【申请号】CN201510048148
【发明人】万亚坤, 钱付平, 李敏
【申请人】东南大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月29日