SC-GE-3，chipscreen biosciences，深功I，中国）。义用 Generation III array scanner (Amersham Pharmacia)忍片扫描仪扫描。使用 Imagequant 5. CKArray Vision 6. 0)分析扫描数据。
[002引小窠碱触R)处理过的RPMI-8266细胞，与对照组相比巧片结果显示有49种 miRNA表达量增加，另有38种miRNA的表达量降低。对数据的进一步分析发现，经过小窠碱 处理的RPMI-8266细胞的miR-17~92族，miR-10化~25族和miR-12化族的表达水平明 显降低（图2A)，其中miR-12化族位于7号染色体上（图2B)。
[0029] 实施例4miRNA-125b的信号通路分析
[0030] miRFo州S 软件化ttp://mirfocus. org)，整合分析 miRNA_125b KEGG(The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路。
[0031] miR-12化几乎参与所有信号通路。因此，miR-12化族可能是重要的oncomiRNAs 之一。该些结果表明，小窠碱炬BR)抑制MM细胞可能是设及到microRNA所调节的基因表 达及其相关的信号通路主要有TP53、ErbB和MAPK (图3)。
[003引实施例5微小反义寡聚核巧酸t-antimiR-12化对RPMI-8266细胞集落形成的影 响
[0033] 本实验分BBR (终浓度为75 y M)组、t-antimiR-12化（终浓度为0. 5 y M)、 t-SCR(终浓度为0. 5 y M)和空白对照组。取对数生长期的RPMI-8266细胞（实施例2培养 得到）进行t-antimiR-12化和t-SCR转染，转染方法参照Invitrogen公司Lipofectamine? 2000说明书），空白对照组加入同体积的无血清的化tiMEM培养基，BBR组加入同体积的无 血清的化tiMEM培养基（含终浓度为75 y M的BBR)。转染或处理6小时后按1 X 103cells/ 讯611接种于含体积分数为2〇%胎牛血清、2臟〇1/1心谷氨酷胺、5^111〇1/10-疏基己醇和 质量分数为0.9%甲基纤维素的半固体培养基中，置37°C、5%C02和饱和湿度条件下培养 7d。倒置显微镜下计数集落数和观察集落形态，W大于40个细胞的细胞团为1个集落。实 验重复3次，计算相对集落形成率=(实验组/空白对照组）X 100 %。
[0034] colony形成实验与细胞的恶性程度有密切的关系。为了评价t-antimiR-12化 族对RPMI-8266细胞的恶性行为的影响，采用colony方法进行实验研究。转染 t-antimiR-12化的细胞经过7d的培养，结果显不BBR、转染t-antimiR-12化组的colony 的数量与SCR组相比有显著差异（P<0. 05)(图4)。t-antimiR-12化转染RPMI-8266细胞 后，细胞集落形成能力减弱，t-antimiR-12化能有效抑制RPMI-8266细胞集落形成。
[0035] 实施例6微小反义寡聚核巧酸t-antimiR-12化对细胞调亡的影响
[0036] 本实验分BBR (终浓度为75 y M)组、t-anti-miR-12化（终浓度为0. 5 y M)、 t-SCR(终浓度为0. 5 uM)和空白对照组。各组RPMI-8266细胞（实施例2培养得到） W 5X lOVmL的密度接种于24孔板，每孔400 y L转染（转染方法参照Invitrogen公司 Lipofectamine? 2000说明书）终体积500 1^以空白对照组加入同体积的无血清的化tiMEM 培养基，BBR组加入同体积的无血清的化tiMEM培养基（含终浓度为75 y M的BBR)。转染 或处理化后加入500 y L 20%血清的RPMI1640培养基置于培养箱中培养，4她后离屯、收集 细胞，预冷的PBS洗漆细胞2次，ImL结合缓冲液化inding buffer)洗1次，离屯、去上清，加 入200化结合缓冲液重悬细胞后，分别加入10化Annexin和5化PI，轻轻混匀，避光反 应30min，流式细胞仪检测细胞调亡情况。
[0037] 终浓度为75 y M的小窠碱、终浓度为0. 5 y M的t-SCR、终浓度为0. 5 y M的 t-antimiR-12化处理RPMI-8266细胞4她后，接着使用流式细胞仪进行功能研究，结 果显示：经Annexin V/PI二重染色，采用流式细胞仪检测，小窠碱诱导细胞早期调亡率 为18. 5%。t-antimiR-12化诱导调亡7. 58%，其调亡率与随机对照组相比明显增加。 t-antimiR-12化作用于RPMI-8266细胞后，细胞生长受到抑制，细胞调亡明显增加。
[003引 W上实施例显示miR-12化在多发性骨髓瘤中具有重要的类似癌基因的功能，针 对miR-12化种子序列设计的锁核酸修饰的t-antimiR-12化能够有效抑制多发性骨髓瘤细 胞，能抑制多发性骨髓瘤的进展，具有用于肿瘤实验治疗研究和药物开发的潜力。
[0039] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种针对miR-125b种子序列的微小反义寡聚核苷酸，其特征在于：所述的针对 miR-125b种子序列的微小反义寡聚核苷酸的核苷酸序列如下：5'-CTCAGGGA-3'。
2. 根据权利要求1所述的针对miR-125b种子序列的微小反义寡聚核苷酸，其特征在 于： 所述的针对miR-125b种子序列的微小反义寡聚核苷酸经过锁核酸修饰。
3. 权利要求1或2所述的针对miR-125b种子序列的微小反义寡聚核苷酸在制备抗肿 瘤药物中的应用。
4. 根据权利要求3所述的针对miR-125b种子序列的微小反义寡聚核苷酸在制备抗肿 瘤药物中的应用，其特征在于： 所述的抗肿瘤药物为抗多发性骨髓瘤药物。
【专利摘要】本发明属于药物制备领域，具体涉及一种针对miR-125b种子序列的微小反义寡聚核苷酸及应用。所述的针对miR-125b种子序列的微小反义寡聚核苷酸的核苷酸序列如下：5'-CTCAGGGA-3'；该微小反义寡聚核苷酸可以应用于制备抗肿瘤药物。相对于成熟miRNA而言，本发明提供的针对miR-125b种子序列的微小反义寡聚核苷酸t-antimiR-125b具有分子量小，毒性小，特异性强，转染效率高等优点，可用于肿瘤的实验治疗研究，有一定的药物开发前景。
【IPC分类】C12N15-113, A61K31-7088, A61P35-00, A61K48-00
【公开号】CN104630226
【申请号】CN201510051779
【发明人】费嘉, 骆小闯, 古春明, 丰茂晓, 阴钊, 朱容萱, 李天夫, 王瑞瑞, 赵于渔, 梁伟鹏
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月30日