专利名称：利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学基因表达调控领域，更具体的涉及利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，它适用于山羊同一组织细胞在不同发育时期、不同生理条件下microRNA介导的靶基因的差异筛选，或者不同组织细胞在相同的发育时期microRNA介导的靶基因比较研究。
背景技术：
microRNA是大约18_24bp的小的非编码RNA，它在转录后调控基因的表达。是1993年首次发现的一类在动植物中发挥重要作用的基因表达调控因子。它们通过依赖于microRNA和靶基因互补性的降解或者抑制翻译的两种不同机制负调控靶基因的表达水平。在大多数哺乳动物中，microRNA通过5’末端第2 8bp的序列互补配对祀基因mRNA,在翻译水平负调控基因的表达，5’末端的这2 Sbp的序列称为种子序列，它在各个物种中都是高度保守的，并且通过与靶mRNA完全互补配对介导基因的表达调控。许多研究表明正是microRNA 2 8bp种子序列的突变或者与之完全互补配对靶mRNA —个或者几个碱基的突变导致mi croRNA功能缺失，进而弓I起生理状态的改变。mi croRNA与靶基因组成复杂的调控网络，一个microRNA可以与多个祀基因相互作用，多个microRNA也可能作用于同一个革巴基因，另外microRNA及其靶基因不同时期、不同生理条件、不同组织其表达量均存在差异。因此，如何准确定位、分析microRNA靶基因成为许多科学家关注的问题。靶基因挖掘方法主要有两大类计算机预测和基于杂交的基因芯片。其中，计算机预测虽然快速、简单，但这种主要基于microRNA种子序列与其靶基因之间碱基互补配对的最小自由能的计算机方法，由于短小序列的存在，容易出现假阳性，需要大量的实验验证，且以表达谱数据已知为背景；基因芯片是基于杂交策略的主流技术，自发明以来，它一直在基因表达谱技术中占据优势地位。该技术利用过表达microRNA的样本及其对照的mRNA池与固定在芯片上的数以万计根据已知基因序列设计的探针杂交，以高通量的方式确定mRNA的种类和丰度，从而推测microRNA的靶基因。虽然该技术获得了广泛的应用，但是价格昂贵、需要大量的RNA，且存在数据处理过程噪音难以确定、探针与相似转录本间交叉杂交等问题。此外，由于要设计探针，它和计算机预测一样需要参考基因组序列信息。因此，为了研究山羊组织或者器官的HiiCT0RNA靶基因的情况，也为其它物种提供一种研究与某个microRNA相关的靶基因的分子方法，我们在miRBase已有数据的基础上，搜寻获得microRNA种子序列互补配对的序列,利用真核生物mRNA带有polyA尾巴的特点，在反转录酶作用下，加入带有特殊接头的反转录引物，合成第一链cDNA，然后，通过特异设计的两步PCR反应，富集与microRNA相互作用的所有靶基因，将其特异性扩增获得可以用常规凝胶检测到的核苷酸序列，并辅以PAGE技术，定位、分析与某个特异microRNA序列相互作用的靶基因。、发明内容
本发明的目的是提供一种实验性的、简便快速的、高特异性的获取哺乳动物组织或器官miCToRNA靶基因的分子方法。包括以下步骤I)特异反转录引物的设计所述反转录引物包括锚定碱基VN (N代表A、T、C或者G ；V代表碱基A、G或C)、12个T、寡核苷酸CTGA(3’到5’端)以及特殊接头SEQ ID NO. 2。锚定碱基VN、12个T的寡聚核苷酸保证了 cDNA的从头合成，SEQ ID NO. 2的引入有利于特异两步PCR的设计。通过反转录引物将样本所有mRNA反转录成带有特殊接头SEQ ID NO. 2的cDNA。2)特异两步PCR反应所述特异两步PCR反应的引物由根据miRBasel6. 0数据库提供的与某个microRNA种子序列相互配对的核苷酸序列与特殊接头SEQ ID NO. I的上游引物，和待扩增cDNA上带有的特殊接头SEQ ID NO. 2的下游引物组成。为保证特异性，这两个特殊接头序列SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 2在动物基因组中或转录组中是不存在的。其中为了获得与某个microRNA相互作用的所有靶基因部份序列。第一步PCR过程中，我们利用哺乳动物microRNA 5’末端第2 8个碱基与其靶基因mRNA互补配对的特点，设计了特殊的上游引物，利用PCR反应过程中，低温条件下，引物3’末端几个碱基必然精确地与模板分子结合的原理，非特异性的富集了某个特异microRNA相互作用的靶基因，反应程序94°C预变性5分钟；94°C，40秒，37°C，30秒，72°C，I分30秒，5个循环；第二步PCR过程中，依据上下游退火温度的一致性，通过提高退火温度特异性的扩增某个microRNA相互作用的靶基因片段，反应程序94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，32个循环；72°C，10分钟。其中，山羊组织microRNA靶基因挖掘流程如附图I所示(I)microRNA是长度为18 24bp的非编码的小RNA，它参与包括细胞增殖、凋亡、分化等许多的生物学过程，在转录后调控靶基因的表达。哺乳动物中，其作用方式是5’端第2 8个碱基的种子序列通过与多个靶mRNA完全互补配对以抑制靶基因的翻译。(2)真核生物的mRNA具有5’端帽子和3’端polyA尾巴的特点。利用这种特点，在反转录酶的作用下，加入特殊接头SEQ ID NO. 2的反转录引物组合，就能合成带有特殊接头 SEQ ID NO. 2 的 cDNA。(3)沿着箭头延伸的方向，以mRNA为模板、在反转录酶5’到3’聚合酶的活性作用下，从5’向3’合成mRNA与cDNA的杂合双链。(4)合成的杂合双链在反转录酶的RNaseH的作用下，降解杂合双链的mRNA，合成比较稳定的第一链cDNA。(5)加入包含特殊接头SEQ ID NO. I以及某个microRNA种子序列互补序列的引物组合，利用DNA聚合酶，退火温度为低温条件下，非特异性的合成与某个microRNA种子序列互补配对的全部的cDNA。(6)合成得到包含特殊接头SEQ ID NO. I以及某个microRNA种子序列互补序列、特殊接头SEQ ID NO. 2、12个碱基T以及锚定碱基NV，目的靶基因片段的特异DNA序列。(7)加入特殊接头SEQ ID NO. I以及某个microRNA种子序列互补序列的上游引物组合，以及特殊接头SEQ ID NO. 2的下游引物，利用DNA聚合酶的作用，在退火温度为高温的条件，特异的扩增目的靶基因片段。(8)通过多个PCR循环反应，合成得到可以通过常规手段检测到的多个目的靶基因片段，用于后面的分离、克隆、测序。(9) PCR产物通过PAGE检测和银染显色。3) PAGE凝胶及半定量分析PCR产物经过10% PAGE凝胶，120 140V电压，7 8小时电泳后，银(硝酸银)染显色，借助凝胶辅助分析工具(如genetool),半定量分析某个特异microRNA介导的革巴基因表达情况。每个泳道对应的条带可被切下并加以回收，利用原引物条件重扩增，克隆测序供进一步分析，反应程序94°C，5分钟；94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，32个循环；72°C，10分钟。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE分离扩增的靶基因，并利用凝胶辅助分析工具检测片段的大小和表达丰度，利用microRNA与靶基因相互作用的特点，辅以PAGE和凝胶分析工具，可视化不同时期、不同生理状态下基因水平表达差异，检测各个泳道片段的大小和表达丰度，作为区分不同样本的标志。山羊的基因组测序至今尚未完成，我们采用该方法对山羊组织样本的microRNA靶基因进行了检测，获得了与某个microRNA种子序列相互作用的靶基因核苷酸序列。本发明提供一种利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于包括以下步骤(I)合成反转录引物；(2)合成包含不同接头序列的上、下游PCR引物；(3)消化去除基因组污染，对样品总RNA的提取；(4)采用步骤(I)的反转录引物将样品RNA反转录获得cDNA ；(5)采用步骤⑵上下游PCR引物，两步PCR法获得某一 microRNA的靶基因序列；(6) PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其片段大小和表达丰度；(7)切取靶基因条带，重扩增、回收、克隆、测序。其中，两条接头序列在山羊基因组中或转录组中不存在，在其中一个具体的实施方式中，接头序列分别具有SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；在更加具体的实施方式中，接头序列就是SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。在一个具体的实施方式中，步骤(I)所设计的反转录引物为接头SEQ ID NO. 2,4个动态碱基、12个T以及锚定碱基N(N代表A、T、C或者G)V(V代表碱基A、G或C)的组合，具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。在一个具体的实施方式中，步骤(3)采用DNaseI消除基因组DNA污染。在一个具体的实施方式中，步骤(4)以纯化的组织总RNA为模板，以SEQ ID NO. 3所示序列为反转录引物，在反转录酶作用下合成带有SEQ ID NO. 3的cDNA ;反转录体系如下总 RNA 4iil，反转录酶 0. 5iil，反应缓冲液 2iil，SEQ ID NO. 30. 5 U I (50 u M),RNase-free ddH203 u I ;反应条件37°C, 15 分钟；85°C，5 秒。在一个具体的实施方式中，步骤(5)特异两步PCR上游引物的结构特征为接头 SEQ ID NO. I与microRNA种子序列互补序列的组合,具有SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列；下游引物具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。在更加具体的实施方式中，步骤(5)PCR 扩增分两步进行，第一步 PCR 反应体系cDNA I iil，SEQ ID NO. 43 u I(IOuM), masterMix(TaKaRa) 12. 5 u 1，ddH20 7. 5 u I ;反应条件94°C 预变性 5 分钟；94°C,40 秒，37°C，30秒，72°C，1分30秒，5个循环；第二步PCR反应体系在第一步PCR产物中加入SEQ IDNO. 21 u KlOu M);反应条件94°C 预变性 5 分钟；94°C，40 秒，60. 5°C，30 秒，72。。，I 分 30秒，32个循环。在一个具体的实施方式中，步骤(6)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE分离扩增的靶基因，并利用凝胶辅助分析工具检测片段的大小和表达丰度，利用microRNA与靶基因相互作用的特点，辅以PAGE和凝胶分析工具，可视化不同时期、不同生理状态下基因水平表达差异，检测各个泳道片段的大小和表达丰度，作为区分不同样本的标志。在一个具体的实施方式中，步骤(7)切取的靶基因条带重扩增的条件为94°C预变性5分钟-MV, 40秒，60. 5 °C, 30秒，72。。，I分30秒，共计32个循环。 本发明与现有技术相比具有以下优点和效果I、适用范围广。本发明适用于基因组序列已知和未知的所有哺乳动物，适用于microRNA介导的已知转录本的检测和未知转录本的发现；本方法发明适用于任何普通分子生物学实验室采用。2、性价比高。本发明利用常规仪器和试剂去探索microRNA介导的基因表达情况，成本低廉，实验结果理想。3、覆盖率高，冗余少。本发明利用poly(T/A)置换法将其置换成人工接头序列，确保了带polyA尾mRNA 100%的覆盖率。另一端(上游引物)种子序列互补序列加特殊接头的组合，既保证了 microRNA作用的所有靶基因的获取，又增加了特异性。以上概括的描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，需要指出的是，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步的说明。图I :山羊组织microRNA靶基因挖掘流程图。图2 :某生理状态山羊皮肤样品总RNA1. 0%琼脂糖检测结果图。3代表第3种生理状态，M 为 Marker DL2000。图3 :某生理状态山羊皮肤样品mir-203靶基因扩增结果(a) I. 0%琼脂糖检测结果，3代表第3种生理状态，M为marker DL2000 ； (b) 10% PAGE检测结果，3代表第3种生理状态，M 为 Marker DL1000。图4 :第3种生理状态山羊皮肤样品mir-203靶基因重扩增结果。1、2、3、4、5表示从图3(b)中切取大小为382bp、276bp、221bp、189bp、130bp片段重扩增结果，M为MarkerDLlOOO0图5 :10种不同生理状态总RNA1. 0%琼脂糖检测结果图，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表不同生理状态的总RNA，M为DL6000。.图6 :10种不同生理状态山羊皮肤样品mir-203靶基因的表达图谱(a)，I. 0%琼脂糖检测结果；(b)，10% PAGE检测结果。Ml为DL2000 ；M2为DL1000。图7 :切取的不同生理状态10% PAGE胶mir-203靶基因条带重扩增I. 0%琼脂糖检测结果。(a)，标注的A-B代表不同生理状态的第几条带，例如1-1代表第I种生理状态切取的第一条带重扩增结果，M代表Marker ; (b), 345bp特异条带重扩增1.0%琼脂糖检测结果。6、7、8、9、10分别代表不同生理状态，N表示阴性对照，M为Marker DLlOOO0
具体实施例方式实施例I.山羊皮肤组织mir-203靶基因挖掘模式的建立I.试验样品试验样品来自内蒙古农业大学动物遗传育种与繁殖自治区重点实验室，采集了山羊肩胛部位第3种生理状态的皮肤样品。2.总RNA的提取、处理和检测按Trizol法提取总RNA的方法提取总RNA。用无RNase的DNase-I处理总RNA，以去除其中痕量基因组DNA污染，通过普通琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性(图2)，用核酸测定仪测定浓度。我们研究针对mir-203这一具体microRNA所针对的祀基因的情况,设计并合成了包括锚定碱基VN (N代表A、T、C或者G ；V代表碱基A、G或C)、12个T、寡核苷酸CTGA (3’到5’端)以及特殊接头(SEQ ID NO. 2)的反转录引物(SEQ ID NO. 3)，并按照《分子克隆实验指南》提供的反转录方案，在特异反转录引物(SEQ ID NO. 3)存在的条件下制备cDNA，-80°C保存备用。3. PCR 扩增3. I 第一步 PCR以步骤2第3种生理状态制备的cDNA为模板，加入由特殊接头SEQ ID NO. I以及与mir-203种子序列互补序列组成的上游引物SEQ ID NO. 4，富集所有与mir-203相互作用的靶基因。PCR 反应体系为 25 ill，包括 master Mix (TaKaRa) 12. 5 ，上游引物 SEQ IDNO. 43 u KlOu M)，模板 I u 1，ddH20 7. 5 u I0反应程序94V预变性5分钟-MV, 40秒，37°C，30秒，72°C，I分30秒，5个循环；3. 2 第二步 PCR在第一步PCR产物中加入包含特殊接头的下游引物SEQ ID NO. 21 U l(10u M)，特异性的扩增mir-203的靶基因。反应条件94V预变性5分钟-MV, 40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，32个循环。72°C，10分钟。I %琼脂糖凝胶、10 % PAGE检测表明，mRNA为模板获得了完全不同于DNA模板的结果，DNA模板几乎得不到扩增结果，mRNA模板得到了清晰的多条结果(图3)，这在验证了 microRNA与其靶基因存在一对多的作用方式的同时，也说明了特殊的两步PCR设计的合理性。4. PAGE胶回收、重扩增、克隆测序切取步骤3PAGE胶中各清晰的条带，100°C煮沸10分钟，取5iU上清按如下PCR
反应重扩增。PCR 反应体系为 25 iil，包括 master Mix(TaKaRa) 12. 5 yl，上下游引物各 I yl，PAGE胶回收产物上清液5 iil，ddH205. 5 ill。反应程序94V预变性5分钟-MV, 40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分钟30秒，32个循环。72 °C，10分钟。1%琼脂糖检测结果如图4所示，获得了 120 750bp大小不同的6条带，胶回收、克隆测序，所测序列见序列表SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 12，分别对应图3 (a)中大小为75化？、382& 、276& 、22化？、18% 、13(^ 的条带。每条序列都包含我们设计的上下游引物，进一步说明了我们方法设计的合理性。 实施例2.山羊皮肤样品中不同时期mir-203靶基因的检测分析利用实施例I建立的方法，借助genetool PAGE胶条带判型工具，我们比较分析了山羊10种不同生理状态山羊皮肤样品(图5)mir-203靶基因的表达图谱(图6)。结果表明，对于PAGE凝胶，在700bp-50bp范围内，不同生理状态mir-203靶基因表达数目存在差异，10种不同生理状态条带数目分别为12、14、11、12、11、12、12、13、13、14。不同生理状态之间既有共同表达的条带，也有差异表达的条带；以每种生理状态下共表达的200bp左右的量为参考标准，利用genetool半定量了各个条带相对于参考标准的相对表达量(表I)，不同生理状态同一条带表达量也存在差异。表110种不同生理状态皮肤样品mir-203靶基因的相对表达量
不同生理状态相对表达量 条带范围____
(bp)1 2 3 4 5 6 7 8910
698o. 250.21 0.24 0.20 0. 190.05
6870.29
6300.08 0. 130.10
6060.28
5800.08 0.110.08 0.050.130.14
4950.07 0.060.05
453o. 20 0.220.36 0.46 0.39 0.37 0.270.050. 16
4230.03 0.070.14 0.120. 100.063850.26 0.350.24 0.23 0.24 0. 17 0.26 0.320.280.41 3490.060.090. 130. 12 293o. 190.22
2840. 14 0. 180.23 0.35 0.19 0.34 0.28 0.230.240.41
2630. 14 0.110. 14 0.22 0.31 0.13 0. 11 0.160.190.14
2250.21 0.140.26 0.27 0.27 0.30 0.21 0.250.240.25
20000 1.00I. 00 1.00 L 00 I. 00 1.00 I. 00I. 00L 00
1650.04 0. 13
1240. 15 0.360.19 0.23 0. 19 0.36 0.31 0.390.400.38
1160. 11 0.170. 16 0.17 0.22 0.27 0.10 0.230.330.24
1000.06 0. 110.08 0.04 0.14 0. 16 0.05 0. 170.160.19切取不同生理状态下mir-203靶基因条带，按实施实例I步骤4所述重扩增、克隆测序。重扩增部份结果I %琼脂糖检测如图7所示，其片段大小主要集中在120 400bp左右；测序结果显示序列与序列表中SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 12—致。大小分别为382bp (表I 为 385bp)、345bp (表 I 为 349bp)、276bp (表 I 为 284bp)、269bp (表 I 为 263bp)、221bp (表I 为 225bp)、189bp (表 I 为 200bp)、130bp (表 I 为 124bp)。其中 382bp、276bp、269bp、221bp、189bp、130bp为各种生理状态共有的条带，分别对应图7 (a)的A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A_6，八表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种生理状态；345bp为6、8、9、10种生理状态皮肤样品特有的条带(图7(b))，这与表I结果一致。说明了本方法的稳定性和特异性
权利要求
1.利用种子序列检测山羊组织或器官中micix)RNA靶基因的分子方法，其特征在于包括以下步骤 (1)合成反转录引物； (2)合成包含不同接头序列的上、下游PCR引物； (3)消化去除基因组污染，对样品总RNA的提取； (4)采用步骤(I)的反转录引物将样品RNA反转录获得cDNA； (5)采用步骤(2)上下游PCR引物，两步PCR法获得某一microRNA的靶基因序列； (6)PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其片段大小和表达丰度； (7)切取靶基因条带，重扩增、回收、克隆、测序。
2.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于涉及到的两条接头序列在山羊基因组中或转录组中不存在，分别具有SEQIDN0. I和SEQID NO. 2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(I)所设计的反转录引物具有SEQID NO. 3所示的核苷酸序列，为接头SEQ ID NO. 2下游紧接4个动态碱基下游紧链接12个T以及锚定碱基NV的组合，其中，N代表A、T、C或者G ；V代表碱基A、G或C。
4.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(3)中采用DNaseI消除基因组DNA污染。
5.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(4)以纯化的组织总RNA为模板，以SEQID NO. 3所示序列为反转录引物，在反转录酶作用合成带有SEQ ID NO. 3的cDNA。
6.根据权利要求5所述反转录反应,其特征在于反转录体系如下总RNA4 u I,反转录SI 0. 5 u 1，反应缓冲液 2u I, SEQID NO. 30. 5 U I (50 u M)，RNase-free ddH20 3 u I ;反应条件37°C，15 分钟，85°C，5 秒。
7.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(5)特异两步PCR上游引物具有SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，结构特征为接头SEQID NO. I与microRNA种子序列互补序列的组合；下游引物具有SEQ IDNO. 2所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于特殊两步PCR法上游引物为SEQ ID NO. 4 ;下游引物为SEQID NO. 2。
9.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(5) PCR扩增分两步进行，第一步PCR反应体系cDNA lul, SEQ IDNO. 43 u I (IOuM), master Mix(TaKaRa) 12. 5u I, ddH20 7. 5 u I ;反应条件:94°C 预变性 5分钟；94°C，40秒，37°C，30秒，72°C，I分30秒，5个循环；第二步PCR反应体系在第一步PCR产物中加入SEQ ID NO. 21 u I(IOuM);反应条件94°C预变性5分钟；94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72。。，I分30秒S，32个循环。
10.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(6)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE分离扩增的靶基因，并利用凝胶辅助分析工具检测片段的大小和表达丰度，利用microRNA与靶基因相互作用的特点，辅以PAGE和凝胶分析工具，可视化不同时期、不同生理状态下基因水平表达差异，检测各个泳道片段的大小和表达丰度，作为区分不同样本的标志。
11.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(7)切取的靶基因条带重扩增的条件为94°C预变性5分钟；94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，共计32个循环。然后通过克隆、测序获得靶基因核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法。具体而言，提供了种子序列介导的可控遗传操作，用于在基因表达检测中筛选与特定microRNA相关的靶基因。在设定上游种子序列的互补序列和下游锚定序列的基础上添加特殊接头，通过反转录和特殊二步PCR将microRNA的靶基因扩增；扩增后的microRNA靶基因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测其片段大小和表达丰度，用于筛选在不同生理状态或实验条件下特异表达的基因；特定的靶基因序列通过DNA回收和测序方法得到。此法可用于评估microRNA调节的基因或遗传途径，也可用表达谱来评估基因表达特征，在系统生物学研究中具有重要价值。
文档编号C12Q1/68GK102643898SQ20121003835
公开日2012年8月22日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者付绍印, 张文广, 李金泉, 赵德超 申请人:内蒙古农业大学