[0025] 在又一实施方案中，如上述方面中所述提供人源化抗体，其用于抑制受试者中之T 细胞介导的反应。
[0026] 例如，T细胞介导的反应可参与选自以下之状况：组织移植（tissue transplantation)(包括实体器官移植及复合性组织移植）、组织移植（tissue grafting)、多发性硬化及1型糖尿病。
[0027] 此外，另一实施方案提供用于治疗罹患涉及异常T细胞介导的反应之病况之受试 者的方法，其包括向有需要之受试者施用治疗有效剂量之根据所述实施方案之抗体。
[0028] 因此，已产生不诱导细胞因子释放之人源化非活化抗a0TCR抗体，其能选择性 调节a0TCR并诱导经活化a0TCR阳性T细胞之细胞凋亡。已经产生这些抗体以供在T 细胞介导疾病中用作免疫抑制剂。已通过小鼠抗a0TCR抗体BMA031之人源化及藉由对人 源化抗体之Fc工程改造以防止接合Fey受体来产生这些抗体。与本领域中可用的BMA031 之人源化形式不同，根据所述实施方案之抗体保持BMA031之结合亲和力。此外，如体外驯 化（education)测定法中所示，根据所述实施方案的抗体之免疫抑制性质优于BMA031。而 且，与现有技术之人源化BMA031抗体不同，根据所述实施方案的抗体不在正常PBMC中诱导 细胞因子释放。
[0029] 根据第五方面，提供包含经修饰Fc之抗体，其中该经修饰Fc包含减少FcyR受体 结合之经修饰的糖基化模式，该抗体包含突变S298N、T299A及Y300S中之一或多者。
[0030] 在一个实施方案中，抗体包含突变N297Q、S298N、T299A及Y300S中之两者或更多 者。
[0031] 在实施方案中，抗体包含多重突变N297Q/S298N/Y300S、S298N/T299A/Y300S或 S298N/Y300S。
[0032] 例如，抗体可为如本发明前述方面中所述之抗体。
[0033] 根据第六方面，提供多特异性抗体，其至少包含如本发明前述方面中所述第一结 合域之重链及对肿瘤特异性抗原具有特异性之第二结合域。
[0034] 在一个实施方案中，第一结合域包含根据本发明第二方面之重链。
[0035] 多特异性抗体可包含许多不同构型；在一个实施方案中，其包含抗TCR/⑶3scFv 及抗肿瘤scFv。
[0036] 在一个实施方案中，多特异性抗体具有双特异性。
[0037] 附图简述
[0038] 图L BMA031与EuCIV3相比更强地结合a 0 TCR。
[0039] BMA031MoIgG2b、BMA031HuIgGl及EuCIV3HuIgGl抗体与经PE标记之BMA031抗体 竞争结合。EuCIV3与BMA031相比效能有所降低。
[0040] 图2?在体外驯化（IVE)测定法中，EuCIV3之效能低于BMA031。
[0041] 该曲线显示在生物学测定法中当与亲代BMA031抗体比较时EuCIV3人源化抗体 之性能损失。用不同浓度（x轴）之抗a0TCR抗体处理⑶8+T细胞且将其与用CMV肽 495-503 (pp65)脉冲处理之自体树突细胞共培养7天。
[0042] 图3?在竞争测定法中，HEBE1与BMA031相当地结合a0TCR。
[0043]BMA031HuIgGl、HEBElHuIgGl及EuCIV3HuIgGl抗体与经PE标记之BMA031抗体竞 争结合。EuCIV3与BMA031及HEBE1相比效能有所降低。
[0044] 图4.在体外驯化（IVE)测定法中，HEBEI与EuCIV3之效能相似。
[0045] 如图2中所述实施IVE测定法。
[0046] 图5.示意性显示抗a0TCR可变域之多轮诱变。
[0047] 阴影框中之框架绘示具有某些小鼠残基之FR区。第一列突变中之阴影残基是可 用于维持解离速率之小鼠氨基酸。第二列突变中之阴影残基是在CDR区周围在最终种系形 成（germlining)过程期间保持之小鼠残基。
[0048] 图6.最优化人源化抗体与BMA031相比具有改良的解离速率。
[0049] 藉由流式细胞术测量抗体自T细胞上之a0TCR解离之动力学。BMA031与EuCIV3 及HEBE1相比具有更优的解离速率。与BMA031相比，藉由最优化HEBE1之结合域能改良 HEBE1.H10之解离速率。
[0050] 图7.最优化人源化抗体与BMA031相比具有改良的解离速率。
[0051] 藉由流式细胞术测量抗体自T细胞上之a0TCR解离之动力学。与BMA031相比， 藉由最优化ffiBEl之结合域能改良HEBEI.H66之解离速率。
[0052] 图8.在Aab及非糖基化模式二者方面，最优化人源化抗体与BMA031相比具有改 良的解离速率。
[0053] 藉由流式细胞术测量抗体自T细胞上之a0TCR解离之动力学。
[0054] 图9.HEBE1之最优化使得功能与BMA031等效。
[0055] IVE测定法如图4中所述。BMA031抑制⑶8+T细胞之驯化，因为其不能以剂量依 赖性方式溶解特定靶物。亲代人源化抗体HEBE1之效能不如BMA031且仅能以最高剂量抑 制驯化（以第二未经改良人源化AbHEBE1H13观察到相似结果）。在此测定法中，对人源化 抗体HEBE1H10作出其它改良，该抗体之效能与BMA031等效。
[0056] 图10?抗a0TCR抗体之IVE数据。
[0057] HEBE1及GL1BM系列抗体二者与BMA031相比皆显示IVE结果之改良。
[0058] 图11.来自IVE测定法之抗原阳性细胞，如藉由抗原特异性四聚物结合所测定。
[0059] 抗原阳性细胞（即，已在IVE测定法内驯化）能结合MHC-四聚物分子。当在已 能防止T细胞针对抗原进行驯化之抗体存在下实施IVE测定法时，在测定法结束时能结合 MHC-四聚物之细胞较少。
[0060] 图12.在抗a0TCR抗体OKT3及刺激珠粒存在下PBMC之增殖。
[0061] 在此比较中在抗a0TCR抗体中未见到OKT3之刺激活性。
[0062] 图13.在抗a0TCR抗体存在下自PBMC之细胞因子释放。
[0063] 抗a0TCR抗体之细胞因子释放概貌与藉由BMA031所示之概貌相似。
[0064] 图14?在IVE测定法中自T细胞之IFN-y释放。
[0065] 在体外驯化（IVE)测定法中用不同浓度（参见图2，x轴）之抗a0TCR抗体处理 ⑶8+T细胞且将其与用CMV肽495-503 (pp65)实施脉冲处理之自体树突细胞共培养7天。 在此测定法中测量IFN-y释放。
[0066] 图15.藉由抗a0TCR抗体之活化诱导的细胞凋亡。
[0067] 藉由抗a0TCR抗体BMA031及HEBE1H66之结合诱导抗原刺激之⑶8+T细胞凋亡。 HEBE1H66诱导细胞凋亡之能力与BMA031相比增加。
[0068] 图16.糖基化突变体及非糖基化抗体之分离
[0069] 考马斯蓝（Coomassie-blue)染色凝胶显示糖基化突变体之表达及纯化
[0070] 图17.a0TCR抗体突变体与人类FcyRllla之结合，其使用Biacore.
[0071] 使用Biacore来评估与重组人类FeyRIIIa(V158及F158)之结合。
[0072] 图18.a0TCR抗体突变体与人类FcyRI之结合，其使用Biacore。
[0073] 使用Biacore来评估与重组人类及FcyRI之结合。
[0074] 图19.在糖基化突变体抗a0TCR抗体存在下自PBMC之细胞因子释放（第2天）。
[0075] 抗a0TCR抗体之TNFa、GM_CSF、IFNy及IL10之细胞因子释放概貌与藉由BMA031 及H66SAB所示之概貌相似。
[0076] 图20.在糖基化突变体抗a0TCR抗体存在下自PBMC之细胞因子释放（第2天）。
[0077] 抗a0TCR抗体之IL6、IL4及IL2之细胞因子释放概貌与藉由BMA031及H66SAB 所示之概貌相似。
[0078] 图21.在糖基化突变体抗a0TCR抗体存在下自PBMC之细胞因子释放（第4天）。
[0079] 抗a0TCR抗体之TNFa、GM_CSF、IFNy及IL10之细胞因子释放概貌与藉由BMA031 及H66SAB所示之概貌相似。
[0080] 图22.在糖基化突变体抗a0TCR抗体存在下自PBMC之细胞因子释放（第4天）。
[0081] 抗a0TCR抗体之IL6、IL4及IL2之细胞因子释放概貌与藉由BMA031及H66SAB 所示之概貌相似。
[0082] 图23 :TRACER之结合概貌。
[0083] 双特异性抗体与肿瘤靶细胞及人类T细胞二者之结合概貌，藉由流式细胞术评 估。
[0084] 图24 :不同T细胞募集臂（recruitmentarm)之细胞毒性活性。
[0085] 已产生一组人源化BMA031抗体，且已自此组选择展示针对肿瘤抗原表达细胞系 之细胞毒性活性之诸多抗体。
[0086] 图25 :不同T细胞募集臂之细胞因子释放概貌。
[0087] 具有不同T细胞募集臂之一组TRACER显示相似的细胞因子释放概貌。在靶细胞 存在下在T细胞活化后检测到大量细胞因子，而在仅未受刺激之人类PBMC存在下，所观察 到之细胞因子水平显著较低。
[0088] 图26 :CD52抗体突变体与人类FcyRllla之结合，其使用Biacore。
[0089] 使用Biacore来评估修饰的抗-CD52与重组人类FcyRIIIa(V158)之结合。使用 在Fc域包含S298N/Y300S突变的抗-⑶52来评估修饰的分子的效应子功能。A:结合⑶52 肽。B:结合FcyRIIIa(V158)。C:结合小鼠FcRn的对照。
[0090] 发明详述
[0091] 除非另有说明，否则本文所用所有技术及科学术语皆具有与本领域的普通技术人 员通常所理解之含义相同的含义。可在本发明方法及技术中使用任何与彼等本文所描述方 法及材料相似或等效者。本文引用之所有出版物皆通过提述以其整体并入本文中，以达成 描述及揭示可结合本发明使用之出版物中所报导的方法、试剂及工具之目的。
[0092] 除非另有说明，否则本申请案之方法及技术通常系根据本领域熟知且如本 说明书通篇引用及讨论之各种一般和较具体的参考文献中所述之常规方法实施。例 如，参见Gennaro，A.R?编（1990)Remington'sPharmaceuticalSciences，第 18 版， MackPublishing公司；Hardman,J.G.、Limbird,L.E.及Gilman,A.G.编（2001)The PharmacologicalBasisofTherapeutics，第 10 版，McGraw-Hill公司；Colowick,S.等 编，MethodsInEnzymology,AcademicPress公司；Weir,D.M?及Blackwell,C.C?编 (1986)