-204,Ma.J.K-C. (1998)Nat.Med. 4: 601-606,Baez,J?等 (2000) BioPharm. 13:50-54,Stoger，E?等（2000)PlantMol.Biol. 42:583-590)中。抗体亦 可藉由化学合成或藉由在宿主细胞中表达编码抗体之基因来产生。
[0119] 分离编码抗体之多核苷酸并将其插入可复制的构建体或载体（例如质粒）中以供 在宿主细胞中进一步繁殖或表达。本领域可用适于表达根据所述实施方案之人源化免疫球 蛋白之构建体或载体（例如，表达载体）。可用多种载体，包括以单拷贝或多拷贝维持于宿 主细胞中或变为整合至宿主细胞之染色体中之载体。可将构建体或载体引入合适的宿主细 胞中，且可产生表达人源化免疫球蛋白之细胞并维持于培养中。可使用单一载体或多个载 体来表达人源化免疫球蛋白。
[0120] 使用常规程序（例如，寡核苷酸探针）容易分离并测序编码抗体之多核苷酸。可 使用之载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微型染色体，其中质粒系典型的实施方案。通 常，此等载体进一步包括信号序列、复制起点、一或多个标记物基因、增强子元件、启动子及 转录终止序列，其可操作地连接至轻链和/或重链多核苷酸以促进表达。可将编码轻链及 重链之多核苷酸插入不同的载体中且同时或依序引入（例如，藉由转化、转染、电穿孔或转 导）相同的宿主细胞中，或者若需要，可在此引入之前将重链及轻链二者插入相同载体中。
[0121] 可提供用于在适宜宿主细胞中表达之启动子。启动子可为组成型或诱导型。例如， 启动子能够可操作地连接至编码人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白链之核酸，以使其引导编 码多肽的表达。可用原核及真核宿主的多种适宜的启动子。原核启动子包括用于大肠杆菌 (E.coli)之lac、tac、T3、17启动子；3-磷酸甘油酸激酶或其它糖分解酶（例如，烯醇酶、 甘油醛3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸异构酶、3-磷 酸甘油酸变位酶及葡糖激酶）之启动子。真核启动子包括诱导型酵母启动子，例如醇脱氢 酶2启动子、异细胞色素C启动子、酸性磷酸酶启动子、金属硫蛋白启动子及负责氮代谢或 麦芽糖/半乳糖利用之酶启动子；RNA聚合酶II启动子，包括病毒启动子，例如多瘤病毒启 动子、禽痘病毒及腺病毒（例如，腺病毒2)启动子、牛乳头瘤病毒启动子、鸟类肉瘤病毒启 动子、巨细胞病毒启动子（特定而言，立即早期基因启动子）、逆转录病毒启动子、肝炎B病 毒启动子、肌动蛋白启动子、劳斯肉瘤病毒（roussarcomavirus) (RSV)启动子及早期或晚 期猿猴病毒40 ;及非病毒启动子，例如EF-la启动子（Mizushima及Nagata(1990)Nucleic AcidsRes. 18(17) : 5322)。那些本领域的技术人员将能选择表达人源化抗体或其部分之适 当启动子。
[0122] 若适当，例如，对于在高等真核生物细胞中之表达而言，可包括其它增强子元件以 代替彼等发现位于上述启动子中者或包括其它增强子元件以及彼等发现位于上述启动子 中者。适宜哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、金属硫蛋 白及胰岛素之增强子元件。或者，可使用来自真核细胞病毒之增强子元件，例如SV40增强 子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子、杆状病毒增强子或鼠类lgG2a基因座（参 见W004/009823)。尽管此等增强子通常位于载体上启动子上游之位点处，但其亦可位于别 处，例如，在未翻译区内或聚腺苷酸化信号下游。可基于与用于表达之宿主细胞之相容性来 选择及定位增强子。
[0123] 另外，载体（例如，表达载体）可包含用于选择带有载体之宿主细胞之可选标记物 及（在可复制载体之情况下）复制起点。编码赋予抗生素抗性或抗药性之产物之基因系常 见可选标记物且可用于原核细胞（例如，f3-内酰胺酶基因（氨苄青霉素抗性（ampicillin resistance))、Tet基因（四环素抗性）及真核细胞（例如，新霉素（neomycin) (G418或遗 传霉素）、gpt(霉酷酸）、氨节青霉素或潮霉素抗性（hygromycinresistance)基因）。二 氢叶酸还原酶标记物基因允许用甲胺蝶呤在多种宿主中进行选择。编码宿主之营养缺陷型 标记物之基因产物之基因（例如，LEU2、URA3、HIS3)通常在酵母中用作可选标记物。亦涵 盖使用病毒（例如，杆状病毒）或噬菌体载体及能整合至宿主细胞基因组中之载体（例如 逆转录病毒载体）。
[0124] 在真核系统中，聚腺苷酸化及终止信号系可操作地连接至编码本发明抗体之多核 苷酸。此等信号通常位于开放阅读框之3'处。在哺乳动物系统中，聚腺苷酸化/终止信号 之非限制性实例包括源自生长激素、延长因子la及病毒（例如，SV40)基因或逆转录病毒 长末端重复的那些。在酵母系统中，聚腺苷酸化/终止信号之非限制性实施例包括源自磷 酸甘油酸酯激酶（PGK)及醇脱氢酶l(ADH)基因的那些。在原核系统中，通常无需聚腺苷酸 化信号，而是通常采用较短且界定较充分之终止子序列。可基于与用于表达之宿主细胞之 相容性来选择聚腺苷酸化/终止序列。除上述特征外，可用于提高产率之其它特征亦包括 染色质重塑（chromatinremodeling)元件、内含子及宿主细胞特异性密码子修饰。本发明 抗体之密码子选择可经修改以适应宿主细胞之密码子偏好，从而增加转录物和/或产物产 率（例如，Hoekema，A.等（1987)Mol.CellBiol. 7 (8): 2914-24)。可基于与用于表达之宿 主细胞之相容性来选择密码子。
[0125] 因此，本发明涉及编码人源化免疫球蛋白或其重链或轻链之分离的核酸分子。本 发明亦涉及编码免疫球蛋白及其链之抗原结合部分之分离的核酸分子。
[0126]抗体可藉由（例如）在适宜宿主细胞中表达一或多种编码抗体之重组核酸产 生。宿主细胞可使用任何适宜方法产生。例如，可将本文所述表达构建体（例如，一或多 种载体，例如，哺乳动物细胞表达载体）引入适宜的宿主细胞中，且所得细胞在适于表达 构建体或载体之条件下可维持（例如，在培养中、在动物中、在植物中）。宿主细胞可为原 核细胞，包括细菌细胞，例如大肠杆菌（例如，菌株DH5a?) (Invitrogen，Carlsbad，CA)、 PerC6 (Crucell,Leiden,NL)、枯草芽孢杆菌（B.subtilis)和/或其它适宜细菌；真 核细胞，例如真菌或酵母细胞（例如，巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)、曲霉属 菌种（Aspergillussp.)、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、栗酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、粗糖脉抱菌（Neurosporacrassa))或其它低等真核细 胞及高等真核细胞，例如来自昆虫的那些（例如，果蝇SchniederS2细胞、Sf9昆虫细 胞）（冊94/126087(0'<：〇1111〇1'))、81'1-了^581-4(出§11卩1 ￥6111)昆虫细胞（1鮮1钍(^611)、哺 乳动物细胞（例如，COS细胞，例如COS-1 (ATCC登录号CRL-1650)及C0S-7(ATCC登录号 CRL-1651)、CH0(例如，ATCC登录号CRL-9096)、CH0DG44(Urlaub，G?及Chasin，L.A. (1980) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77(7) : 4216-4220)、293(ATCC登录号CRL-1573)、HeLa(ATCC登 录号CCL-2)、CVI(ATCC登录号CCL-70)、W0P(Dailey,L?等（1985)J.Virol.，54:739-749)、 3T3、293T(Pear,W.S?，等（1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. ,90:8392-8396)、NS0 细 胞、SP2/0细胞、HuT78细胞等等；或植物细胞（例如，烟草细胞、浮萍（lemna)(青萍 (duckweed))细胞及藻类细胞）。例如，参见Ausubel，F.M?等编CurrentProtocolsin MolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandJohnWiley&Sons公司（1993) 〇 在一些实施方案中，宿主细胞并非多细胞生物体（例如，植物或动物）之部分，例如，其系分 离的宿主细胞或系细胞培养物之一部分。
[0127] 可在旋转烧瓶、振荡烧瓶、滚瓶、波式反应器（例如，SystemlOOO,来自 wavebiotech.com)或中空纤维系统中培养宿主细胞，但对于大规模生产而言，优选尤其 对于悬浮培养而言使用搅拌槽反应器或袋反应器（例如，WaveBiotech,Somerset,New JerseyUSA)。搅拌槽反应器可适于使用（例如）喷布器、挡板或低剪切叶轮通气。对于鼓泡 塔及气升式反应器而言，可使用利用空气泡或氧气泡直接通气。倘在无血清培养基中培养 宿主细胞，则可用细胞保护剂，例如普流尼克F-68(pluronicF-68)补充培养基以帮助防止 细胞因通气过程而受到损害。依赖于宿主细胞特性，可使用微载体作为锚定依赖性细胞系 之生长基质，或这些细胞可适于悬浮培养。可利用多种操作模式来培养宿主细胞，尤其脊椎 动物宿主细胞，这些模式系（例如）分批、补料分批、重复分批处理（参见Drapeau等（1994) Cytotechnologyl5:103-109)、延长的分批过程或灌注培养。尽管可在含血清培养基（此等 培养基包含胎牛血清（FCS))中培养经重组转化的哺乳动物宿主细胞，但优选在无血清培 养基（例如Keen等（1995)Cytotechnologyl7:153_163中所揭示）或商业上可得到的培养 基，如ProCHO-CDM或UltraCHO?(CambrexNJ，USA)中培养此等宿主细胞，若需要，在这些无 血清培养基或商业上可得到的培养基中补充能源（例如葡萄糖）及合成生长因子（例如重 组胰岛素）。宿主细胞之无血清培养可能要求彼等细胞适于在无血清条件下生长。一种适应 方法系在含血清培养基中培养此等宿主细胞且重复地将80%培养基交换为无血清培养基， 以使宿主细胞学会适应无血清条件（例如，参见Scharfenberg，K.等（1995)AnimalCell Technology:DevelopmentsTowardsthe21stCentury(Beuvery，E.C?等编），第 619-623 页，KluwerAcademicpublishers)〇
[0128] 可使所述实施方案之抗体分泌至培养基中且使用多种技术自其回收并纯化以提 供适于期望用途之纯化程度。例如，当与包含治疗性抗体之培养基比较时，治疗性抗体用于 治疗人类患者之用途通常要求至少95%纯度（如藉由还原性SDS-PAGE所确定的），更通常 为98 %或99 %纯度。在第一情形下，可使用离心、之后上清液之澄清步骤使用（例如，微滤、 超滤和/或深层过滤）去除来自培养基之细胞碎片。或者，可藉由微滤、超滤或深层过滤收 获抗体而不预先离心。可利用多种其它技术，例如透析及凝胶电泳及层析技术，例如羟基磷 石灰（HA)、亲和层析（任选地涉及亲和标记系统，例如多组胺酸）和/或疏水相互作用层析 (HIC)(参见US5, 429, 746)。在一个实施方案中，在各种澄清步骤后，使用蛋白质A或G亲 和层析、之后其它层析步骤（例如离子交换和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、大小排阻 层析及硫酸铵