抗αβTCR抗体的制作方法
【专利说明】抗a (3 TCR抗体
[0001] 本发明涉及对af3T细胞受体（a0TCR)具有特异性之抗体。特定而言，本发明 涉及源自鼠类单克隆抗体BMA031的人源化抗a0TCR抗体及该人源化抗体在免疫抑制疗 法中之用途。
[0002] 介绍
[0003] 有大量文件证明免疫抑制剂在自身免疫疾病及器官移植疗法中之用途；然而该方 法远非最佳。毒性、伺机性感染、细胞因子风暴（cytokinestorm)及癌症风险增加在用这 些药剂治疗之患者中普遍存在。在此情形下使用生物制剂已一定程度地改良患者结果，但 这些副效应仍明显。
[0004] 就免疫抑制而言，使用针对淋巴细胞之多克隆抗血清是熟知的。然而，抗血清之产 生极为费力，其显示在不同批次间有所变化之性质，且可使用多克隆抗血清获得之特异性 是有限的。
[0005] 藉由杂交瘤技术产生单克隆抗体首先由Kdhler及Milstein(Natu re256:495-497 (1975))描述。与多克隆抗血清相比，单克隆抗体（mAb)之特异性更高，且具 有更一致性质。mAb已最频繁且成功地在临床器官移植中用于免疫抑制疗法。然而，用作治 疗自身免疫疾病之免疫抑制剂及用于移植患者之大多数mAb具有宽免疫抑制能力，因此不 合意地影响众多免疫细胞之功能，推测这些免疫细胞并非全部参与移植物排斥。
[0006] 针对T细胞表面受体抗原之小鼠单克隆抗体首先于1979年使用杂交瘤技术产生 (Kung等（1979)Science206:347_349)。在由Kung等发现之三种单克隆抗体中，一种抗体 命名为莫罗单抗（muromonab)-⑶3 (0KT3)，其对T细胞之⑶3受体具有经界定之特异性，与 95%以上外周成熟T细胞反应而不影响未成熟胸腺细胞。0KT3与CD3复合物之结合引起 CD3受体之内在化及从外周损失CD3阳性细胞。成功的0KT3治疗与CD3阳性T细胞自约 60 %迅速下降至小于5 %相关。
[0007] 0KT3已广泛地用于治疗在肾移植后经受急性同种异体移植物排斥之患者 (Russell,P.S.、Colvin,R.B.、Cosimi，A.B. (1984)Annu.Rev.Med. 35:63 及Cosimi，A.B.、 1?111'1:〇11，1?.(1、〇〇1￥；[11，1?.13.等（1981)1'四118卩1&11七&1:;[01132:535)。而且，使用01(丁3及兔补体 自供体骨髓清除成熟T细胞以在同种异体骨髓移植中预防急性移植物抗宿主疾病（GVHD) (Prentice,H.G.，Blacklock，H.A.，Janossy，G?等（1982)Lancetl: 700 及Blacklock，H.A.、 Prentice,H.G.、Gilmore,M.J?等（1983)Exp.Hematol. 11:37)。尽管 0KT3 治疗似乎在用 于急性白血病之同种异体骨髓移植中预防GVHD是有效的，但在对严重组合免疫缺陷的治 疗过程中，用0KT3进行组合体外/体内治疗无法预防GVHD(Hayward，A.R.等（1982)Clin. Lab.Observ. 100:665)。用0KT3处理T细胞诱发若干与免疫抑制不一致之反应，包括T细 胞活化、免疫介质之产生及T3调节。假定由⑶3-mAb(例如，0KT3)识别之T3抗原复合物在 T细胞活化期间起关键作用。a/0T淋巴细胞藉助统称为a0T细胞抗原受体（TCR) ?⑶3 复合物之多聚蛋白总体识别肽-MHC配体。此结构由结合抗原之可变a0TCR二聚物及3 个不变二聚物（⑶3ye、Se及G0构成，这些不变二聚物参与TCR?⑶3表面输送、稳 定及信号转导。a0T细胞受体（a0TCR)系在大多数（约95% )的T细胞上表达且经由 展示于MHC上之抗原的接合在T细胞活化中具有关键作用。其余5%细胞是yST细胞受 体（YSTCR)阳性。ySTCR阳性细胞群体在针对细菌、病毒及真菌来源之伺机性感染进 行防御之先天免疫反应中起重要作用。yST细胞在移植中之移植物排斥中不起作用。因 此，靶向a0TCR阳性细胞群体及节约YSTCR阳性群体应允许显著治疗效果，同时维持针 对伺机性感染之基线免疫保护。
[0008]小鼠IgG2b单克隆抗体BMA031(Borst等（1990 年 11H)Hum. Immunol. 29 (3) : 175-88 ;EP0403156)对TCRa/ 0 /CD3 复合物上之共同决定簇具有 特异性，且不结合Y-STCR。BMA031具有高度免疫抑制性且能经由活化诱导性细 胞死亡（AI⑶）机制诱导经活化T细胞之细胞凋亡（Wesselborg等（1993年5月） J.Immunol. 150(10) :4338-4345)。其在体外抑制混合淋巴细胞反应且其已在诸多实体器官 移植情形中之移植物排斥之预防中以及急性移植物抗宿主疾病（aGVHD)之治疗中显示初 步临床效果（Kurrle等（I989 年 2 月）TransplantProc. 21 (1) : 1017_1019)。BMA〇3l不接 合大多数人类群体中之人类FcY受体（FcyR)(约10 %的人具有结合小鼠IgG2b同种型之 FeyR)。由此，该抗体不会经由T细胞受体交联引起T细胞活化且因此，其不诱导T细胞活 化或相关细胞因子释放。就此而言，其概貌（profile)相对于0KT3之概貌是高度优选的。 然而，BMA031系鼠类抗体，且由此鉴于其在人类受试者中所引发之人类抗小鼠抗体（HAMA) 反应而不适于重复在人类受试者中剂量给药。
[0009] 已描述BMA031之若干人源化形式（参见，EP0403156 ;亦参见Shearman等，（1991) J.Immunol. 147:4366-4373)。如EP0403156中所述，仅有CDR移植并不能成功地保持抗原 结合。一种具有显著框架修饰之克隆EUCIV3成功地结合T细胞；然而，如EP0403156中所 述，与a0TCR之结合不如亲代BMA031抗体有效，如藉由流式细胞术竞争测定法所确定的。 我们还显示，EuCIV3抑制体外免疫反应之能力与BMA031相比显著降低（参见图2)。此外， EuCIV3最初在仍保持FcyR结合之野生型人类IgGl或IgG4骨架上产生。因此，这些人源 化抗体允许T细胞活化、增殖及伴随之细胞因子释放且由此显著不同于BMA031之原有性 质。
[0010] 抗体糖基化的修饰是本领域已知的。例如，已知非糖基化抗体可具有经广泛修 饰之功能；参见Boyd等（1996)Mol.Immunol. 32:1311-1318。然而，先前尚未描述人源化 BMA031之非糖基化形式或具有经修饰糖基化模式之衍生物。
[0011] 因此，本领域需要抗a0TCR人源化抗体，其改良EUCIV3之结合性质且有利地保 持BMA031之免疫抑制性及非T细胞活化性质。
【发明内容】
[0012] 在第一方面中，提供人源化单克隆抗体，其包含BMA031之⑶R且保持BMA031对其 同源抗原之结合亲和力。在第一实施方案中，该人源化抗体包含重链可变区，该重链可变区 包含3￡0 10勵:7、12或13中所述之〇)1?及5￡010勵：17中所述之人类16113-23框架，其 中框架位置6是供体残基；在替代实施方案中，框架位置18是供体残基。视情况，框架位置 49和/或69是供体残基。
[0013] 在第二实施方案中，人源化单克隆抗体包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ 10勵：15或16中所述之〇?及5￡0 10勵：18中所述之人类16狀1-3*01框架，其中框架位 置38、44和/或48中之一或多者是供体残基；在替代实施方案中，框架位置44及48是供 体残基。
[0014] 在第三实施方案中，人源化单克隆抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ 10勵：14中所述之^1?及5￡〇10勵：19中所述之人类161^3-11*01框架，其中框架位置 70和/或71是供体残基。视情况，位置46是供体残基。
[0015] 根据第一实施方案之抗体之实例包括包含重链可变区和轻链可变区序列的抗体， 所述重链可变区选自包含3￡〇10勵 :7、5￡〇10勵：12及5￡〇10勵：13中所述之序列的重 链，所述轻链可变区序列包含SEQIDNO: 14中所述之序列。
[0016] 第二实施方案之抗体之实施例包括包含重链可变区和轻链可变区序列的抗体，所 述重链可变区选自包含SEQIDNO: 15及SEQIDNO: 16中所述之序列之重链，所述轻链可 变区序列包含SEQIDNO: 14中所述之序列。根据所述实施方案之人源化抗体是BMA031之 人源化形式。其一级结构与人源化抗体EuCIV3之一级结构不同，EuCIV3与BMA031相比与 a0TCR之结合有所减少。
[0017] 在序列表中，藉助注释或加下划线来指示CDR。框架系在CDR以外之所有序列，其 系根据"Kabat"编号系统定义且在适用时藉由使用"MGT"⑶R定义来扩展。若不指示改变 框架残基来匹配供体序列，则通常应将该残基理解为受体残基。
[0018] 人源化抗体可包含恒定区。在一个实施方案中，恒定区是人类来源的。
[0019] 本发明的人源化抗体可进一步藉由Fc工程改造来修饰。免疫球蛋白易于使FcY 受体交联，此可导致抗T细胞抗体之组成型T细胞活化。为避免Fey交联，可（例如藉由 产生Fab或Fv片段来）修饰抗体以去除Fc区；然而，经截短的免疫球蛋白缺乏有益效应子 功能且展现较短血清半衰期。因此，人源化抗体之Fc区可经修饰以防止Fey交联。例示 性技术包括（例如通过由N297Q突变修饰Fc区来）产生非糖基化免疫球蛋白。无法结合 Fey之免疫球蛋白亦由Armour等（1999)Eur.J.Immunol. 29:2613-2624 描述。实现IgGl 之修饰称为八&15修饰，且由八3突变（其中1§6残基系于位置327、330及331处取代，且 IgG2残基系于位置233-236处取代）与Ab突变（其中缺失残基236)之组合组成。在另 一实施方案中，根据本发明的抗体之糖基化模式可经修饰。
[0020] 在一个实施方案中，抗体包含突变S298N、T299A及Y300S中之一或多者。
[0021] 在实施方案中，抗体包含突变N297Q、S298N、T299A及Y300S中之两者或更多者。 例如，提供包含多重突变N297Q/S298N/Y300S、S298N/T299A/Y300S或S298N/Y300S之人源 化抗体。
[0022] 在第二方面中，提供包含BMA031之⑶R且保持BMA031之T细胞抑制性质之人源 化单克隆抗体。该人源化抗体优选包含具有SEQIDNO: 12、13、15或16中所述之氨基酸序 列之重链可变区及包含SEQIDNO: 14中所述之氨基酸序列之轻链可变区。
[0023] 在第三方面中，提供至少编码根据所述实施方案的前述方面的人源化单克隆抗体 的重链可变区的核酸。该核酸可编码人源化抗体的可变区及恒定区。可在不同核酸上或在 相同核酸分子上编码重链及轻链。
[0024] 根据第四方面，提供表达根据前述方面之核酸之细胞。细胞是（例如）培养中适 于表达抗体分子之细胞。核酸可包括信号序列和/或其它序列或修饰，这些其它序列或修 饰系抗体分子在细胞中之表达和/或抗体分子自细胞之分泌所必需，或对其进行调节。