手性核酸佐剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种CpG寡核苷酸及其用途。更具体地，本发明涉及CpG寡核苷酸的 立体异构体以及通过使用所述立体异构体活化树突状细胞，从而控制由免疫细胞引起的疾 病的治疗剂。
【背景技术】
[0002]日本公开公报特表第2002 - 513763号（专利文献1)、日本特表2002 - 514397 号公报（专利文献2)、日本公开公报特表第2002 - 521489号（专利文献3)中公开了 CpG 寡核苷酸及其制造方法。
[0003] 日本公开公报特表第2010 - 504750号公报（专利文献4)中，公开了在CpG基序 的外侧含有亲油性取代核苷酸类似物的寡核苷酸使干扰素一 a (IFN- a)产生的内容。
[0004] 下述非专利文献1中，公开了作为三聚物的CpG寡核苷酸的S型立体异构体促进 MAPK信号的内容。应予说明，本说明书通过引用将其全部内容并入说明书中。
[0005] 在下述非专利文献1中，公开了序列PF-3512676(序列号128)，所述序列的所有部 分为硫代磷酸酯修饰的并为S型立体异构体。天然的寡核酸在生物体内容易分解。然而将 寡核酸的磷酸酯键（P-0键）替换为硫代磷酸酯键（P-S键）的P-S修饰体具有在生物体内 难以被分解的特点。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1:日本公开公报特表第2002 - 513763号
[0009] 专利文献2:日本公开公报特表第2002 - 514397号
[0010] 专利文献3:日本公开公报特表第2002 - 521489号
[0011] 专利文献4:日本公开公报特表第2010 - 504750号
[0012] 非专利文献
[0013] 非专利文献 l:Authur M. Krieg et al. OLIGONUCLROTIDESI3 :pp.的1 - 4"(2〇〇3)
[0014]非专利文献 2:Clin Cancer Res. 2008Jul 15;14(14) :4532-42.
【发明内容】
[0015] 发明所要解决的课题
[0016] 例如，非专利文献2中公开的CpG寡核苷酸的全部序列为硫代磷酸酯修饰的。因 此，在非专利文献2中公开的CpG寡核苷酸有时会有引发炎症、诱发毒性反应的问题。另一 方面，如果除去非专利文献2中公开的CpG寡核苷酸的硫代磷酸酯骨架修饰，则存在核苷酸 的稳定性降低的问题。
[0017] 因此，本发明的目的在于提供稳定性优异的新型CpG寡核苷酸的立体异构体。
[0018] 本发明的另一目的在于提供具有干扰素-a (IFN a)产生能力的CpG寡核苷酸的 立体异构体。
[0019] 本发明的另一目的在于提供使用CpG寡核苷酸活化树突状细胞来治疗特定疾病 的治疗剂。
[0020] 本发明的另一目的在于提供细胞毒性小的CpG寡核苷酸的立体异构体。
[0021] 用于解决课题的手段
[0022] 本发明基本上基于如下新发现：通过控制寡核酸的立体结构，提高寡核酸在生物 体内的稳定性，由此即使不在全部的序列中导入P-S键，也能够提供在生物体内稳定的寡 核苷酸。因为不是全部的序列都进行了 P-S键修饰，所以本发明的寡核苷酸含有优异的生 物体相容性。
[0023] 至少一个上述目的通过以下发明得到了解决。即，本发明的第一个方面涉及包含 2~4个均由5' 一 XiX2CpGX3X4 - 3'（式（I))构成的序列以及14~32个核苷酸长的寡核 苷酸。
[0024] 式（I)中，CpG表示不含有磷酸骨架修饰的非甲基化CpG。
[0025] XJ2是可以含有磷酸骨架修饰的AA、AT、GA或GT中的任一种。可以含有磷酸骨架 修饰的AA、AT、GA或GT是指AA、AT、GA、GT中的任一个可以含有1或2个磷酸骨架修饰。 以下同样。
[0026] X3X4是可以含有磷酸骨架修饰的TT、AT、AC、TA、TC或CG。
[0027] 所述寡核苷酸可以在5' 一 XiX2CpGX3X4 - 3'之外的位点含有磷酸骨架修饰。艮口， 所述寡核苷酸可以在由5' 一 XiX2CpGX3X4 - 3'构成的CpG基序之外的部分含有磷酸骨架修 饰。然而，优选地，所述寡核苷酸在CpG基序之外的部分中含有至少1个磷酸骨架修饰。
[0028] 所述寡核苷酸优选X:X2是可以含有磷酸骨架修饰的AT、GA或GT中的任一个，X 3X4 是可以含有磷酸骨架修饰的TT、AT、AC、TA、TC或CG。
[0029] 所述寡核苷酸优选XJ2是不含有磷酸骨架修饰的AA、AT、GA或GT中的任一个，X 3X4 是不含有磷酸骨架修饰的TT、AT、AC、TC或CG。
[0030] 5' 一 XiX2CpGX3X4 - 3'以外的含有至少一个磷酸骨架修饰位点的位点优选为S型 的立体异构体。
[0031] 本发明的寡核苷酸优选为包含以下序列中的任一个或由以下的任一个序列构成 的寡核苷酸。
[0032] 式 1
[0033]
【主权项】
1. 一种寡核苷酸，是包含2~4个均由5' 一 X J2CpGX3X4- 3'构成的序列以及14~ 32核苷酸长的寡核苷酸，其特征在于， 所述CpG是不含有磷酸骨架修饰的非甲基化CpG， 所述X1X2是可以含有磷酸骨架修饰的AA、AT、GA或GT中的任一个， 所述X3X4是可以含有磷酸骨架修饰的TT、AT、AC、TA、TC或CG， 所述寡核苷酸在所述5' 一 X1X2CpGX3X4 - 3'之外的位点含有至少一个磷酸骨架修饰。
2. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中， 所述X1X2是可以含有磷酸骨架修饰的AT、GA或GT中的任一个， 所述X3X4是可以含有磷酸骨架修饰的TT、AT、AC、TA、TC或CG。
3. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中， 所述X1X2是不含有磷酸骨架修饰的AA、AT、GA或GT中的任一个， 所述X3X4是不含有磷酸骨架修饰的TT、AT、AC、TC或CG。
4. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中， 所述5' 一 X1X2CpGX3X4 - 3'之外的位点中的含有至少一个磷酸骨架修饰的位点为S型 的立体异构体。
5. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中， 包含以下序列中的任一个：
上述式中*表示基于磷酸骨架修饰的立体异构体，上述各式中的至少一个*是S型的 立体异构体， 上述式中对应于5' 一 X1X2CpGX3X4 - 3'的位点中的CG指不含有磷酸骨架修饰的非甲 基化CpG。
6. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中， 所述X1X2是GA， 所述X3X4是TT或AC。
7. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中， 所述5' 一 X1X2CpGX3X4 - 3'之外的位点中的至少一个磷酸骨架修饰包含硫代磷酸酯。
8. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中， 以所述由5' 一 X1X2CpGX3X4 - 3'构成的序列部分为CpG基序时，在所述CpG基序5'末 端侧或3'末端侧的位置含有由一（G)m- (m为2~10的整数）构成的序列部分。
9. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中， 以所述由5' 一 X1X2CpGX3X4 - 3'构成的序列部分为CpG基序时，在所述CpG基序3'末 端侧的位置含有由一（G)m- (m为1~6的整数）构成的序列部分。
10. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中， 以所述由5' 一 X1X2CpGX3X4 - 3'构成的序列部分为CpG基序时，在所述CpG基序5'末 端侧的位置含有TC、TA、TG、CC或由CC构成的序列部分。
11. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中， 以所述由5' 一 X1X2CpGX3X4 - 3'构成的序列部分为CpG基序时，至少含有第一 CpG基 序和第二CpG基序， 第一 CpG基序和第二CpG基序直接结合，或 在第一 CpG基序和第二CpG基序之间含有由一（T) η- (η为1~3的整数）、TA或TC 构成的序列部分。
12. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，由下述的任一序列或从任一序列中取代、 插入、缺失或添加1、2或3个碱基而得的序列构成， 序列号13 : tSpcSpgacgttSptSptSpgacgtt SptSptSpgacggg, 序列号18 : tSpcSpgacgtSptSpgacgt SptSpgacggg，以及 序列号44 : Sp Sp , , Sp Sp Sp Sp Sp g yg ygacgacgtcgtcg yg yg yg yg 序列中"eg"表示含有磷酸骨架修饰的非甲基化CpG， "SP"表示在相邻的核苷酸间导入S型的硫代磷酸酯骨架修饰。
13. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，由下述序列构成： 序列号13 : tSpcSpgacgttSptSptSpgacgtt SptSptSpgacggg, 序列号18 : , Sp Sp , Sp , Sp , Sp , Sp t c gacgt t gacgt t gacggg?^c 序列号44 : Sp Sp , , Sp Sp Sp Sp Sp g pg pgacgacgtcgtcg pg pg pg pg pg? 序列中"eg"表示含有磷酸骨架修饰的非甲基化CpG， "Sp"表示在相邻的核苷酸间导入S型的硫代磷酸酯骨架修饰。
14. 一种包含根据权利要求1所述的寡核苷酸的组合物。
15. -种包含根据权利要求1所述的寡核苷酸的疫苗佐剂。
16. -种包含根据权利要求1所述的寡核苷酸，从树突状细胞中诱生干扰素-a (IFN - α )的诱生剂。
17. -种包含有效量的根据权利要求1所述的作为有效成分的寡核苷酸的治疗剂，其 中所述治疗剂可用于治疗感染性疾病、癌症、呼吸系统疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病 或创伤。
【专利摘要】本发明的目的在于提供稳定性优异的新型CpG寡核苷酸的立体异构体以及具有干扰素-α(IFNα)产生能力的CpG寡核苷酸。本发明涉及包含2～4个均由5'－X1X2CpGX3X4－3'(式(I))构成的序列以及14～32个核苷酸长的寡核苷酸。式(I)中，CpG表示含有磷酸骨架修饰的非甲基化CpG。X1X2是AA、AT、GA或GT中的任一个。X3X4是TT、AT、AC或CG中的任一个。寡核苷酸在CpG之外的位点含有至少一个S型立体异构体的磷酸骨架修饰。
【IPC分类】A61P43-00, A61K39-39, A61P37-00, A61P31-00, A61P11-00, C12N15-00, C07H21-04, A61P35-00, A61P17-02
【公开号】CN104684923
【申请号】CN201380047250
【发明人】玄番岳践
【申请人】株式会社新日本科学, 日本微物生命科学公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年7月12日
【公告号】CA2879066A1, EP2873674A1, US20150166999, WO2014010718A1