所定义之本发明活性成份，其单独或与本领域认可之已知 适于治疗特定适应症之化合物组合用于治疗疾病。因此，提供本发明活性成份之用途，其用 于制造用以治疗与异常免疫反应相关之疾病之药剂。
[0157] 此外，提供治疗与异常免疫反应相关之病况之方法，其包括向个体施用治疗有效 量之可使用如上文所述分析方法鉴别之配体。
[0158] 仅出于说明的目的，在以下实施例中进一步描述本发明。
[0159] 比较实施例1
[0160]EuCIV3之结合及生物学活性比BMA031降低
[0161] 已使用流式细胞术显示，EuCIV3在T细胞结合性方面劣于BMA031 (图1)。在此竞 争测定法中，在固定浓度之直接经藻红素标记之M〇IgG2b-BMA031(鼠类竞争剂）及增加浓 度之抗aTCR抗体存在下，在冰上温育T细胞。在20分钟温育后，洗涤细胞且藉由流式 细胞术检测结合表面之直接经藻红素标记之MoIgG2b-BMA031。BMA031HuIgGl嵌合抗体之 竞争力远比EuCIV3有效得多。
[0162] 为评估其在体内抑制T细胞活性之能力，在体外驯化（IVE)测定法中用不同浓度 (参见图2,x轴）之抗a0TCR抗体处理⑶8+T细胞且将其与用CMV肽495-503 (pp65)实 施脉冲处理之自体树突细胞〇)C)共培养7天。
[0163] 自HemaCare公司，VanNuys,CA获得来自HLA-A2+个体之正常供体之血液分离术 (aphaeresis)产物。藉由于Ficoll(GEHealthcare,Piscataway，NJ)上离心来分离PBMC。 使用磁珠（Invitrogen,Carlsbad,California)根据制造商说明书分离⑶8+T细胞。为产生 自体未成熟树突细胞，将PBMC重悬于RPMI1640/5 %人类AB血清（Sigma)中，平铺于三颈烧 瓶（tripleflask) (Corning)中且在37°C/5%C02下温育2小时以上。然后用PBS冲洗贴壁 (adherent)单核细胞且在补充有GM-CSF(Immunex,Seattle,WA)及IL-4 (PeproTech,Rocky Hill，NJ)之RPMI1640/5%人类AB血清中培养6天。在建立T细胞/DC共培养物之前，用肽 (10yg/ml)对DC实施4小时脉冲处理且随后使其成熟。藉由添加50ng/mlTNF-a、25ng/ mlIL_10、lOng/mlIL_6、500ng/mlPGE_2(PeproTech，RockyHill，NJ)产生成熟树突细 胞且将树突细胞再培养24小时。然后以10:1之T:DC比率将经肽脉冲处理之DC添加至先 前经分离之⑶8+T细胞中。立即用添加至培养物中之IL-2(100IU/ml)补料至培养物。在 第4天用IL-2(100IU/ml)补充培养物。在第7天于络释放测定法中分析本体培养物（bulk culture)之肽反应性。
[0164] 图2中之图形显示来自铬释放测定法之溶解数据，其中未经处理之T细胞经pp65 肽成功地驯化且能溶解>50%之特定靶物。BMA031抑制这些T细胞之驯化，此乃因其不能 以剂量依赖性方式溶解特定靶物。人源化抗体EuCIV3之效能低于BMA031且仅能以最高剂 量抑制驯化。
[0165] 实施例2
[0166] BMA031嵌合抗体之Fc工程改造
[0167] 体外概貌
[0168] 已在一组测定法中评估BMA031之体外概貌。表1显示BMA031之体外概貌。在这 些测定法中比较BMA031与0KT3。
[0169] 在PBMC增殖测定法中，将人类PBMC与增加浓度之治疗性抗体一起培养72小时， 添加3H-胸苷并在18小时后收获细胞。
[0170] 对于T细胞耗竭/细胞因子释放测定法而言，将人类PBMC与增加浓度之治疗性抗 体一起培养且每天分析细胞计数及活力（Vi-Cell,BeckmanCoulter)直至第7天。亦收获 细胞上清液，在_20°C储存且在8重细胞因子组（Bio-Rad)上分析。
[0171]BMA031不诱导：（i)PBMC增殖；（ii)T细胞耗竭；（iii)CD25表达；或（iv)细胞因 子释放。相比之下，0KT3会诱导全部上述效应。BMA031及0KT3能在体外驯化（IVE)测定 法中阻断针对肽之⑶8+细胞驯化且亦能阻断混合的淋巴细胞反应（MLR)。BMA031亦诱导 经活化T细胞之细胞凋亡（活化诱导性细胞死亡；AICD)。
[0172] 与BMA031不同，BMA031之具有野生型人类IgGl恒定区之嵌合形式（HuIgGl) 具有与OKT3相当之体外概貌（表1)。我们假定，FcyR之参与对于HuIgGlBMA031与 BMA031MoIgG2b相比体外概貌之此变化至关重要。因此，我们制备BMA031HuIgGl之 F(ab'）2片段且发现这些片段恢复BMA03IMoIgG2b之概貌。藉由Fc工程改造我们并 入了修饰，这些修饰在突变中去除FcyR结合（称为" 8ab"）（Armour等（1999)Eur. J.Immunol.，29:2613-2624)及产生HuIgG4 之非糖基化形式（N297Q)。HuIgGlSab及 HuIgG4agly抗a0TCR抗体具有与BMA031MoIgG2b相同之体外概貌（表1)。
[0173]
【主权项】
1. 一种对人类a 0TCR/CD3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变 区，该重链可变区包含SEQ ID NO: 7、12或13中所述的CDR及SEQ ID NO: 17中所述的人类 IG册-23框架，其中框架位置6是供体残基。
2. -种对人类a PTCR/CD3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变 区，该重链可变区包含SEQ ID NO: 7、12或13中所述的CDR及SEQ ID NO: 17中所述的人类 IG册-23框架，其中框架位置18是供体残基。
3. 根据权利要求1或2的对人类a P TCR/CD3复合物具有特异性的人源化单克隆抗 体，其中框架位置49和/或69是供体残基。
4. 一种对人类a PTCR/CD3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变 区，该重链可变区包含SEQ ID NO: 15或16中所述的CDR及SEQ ID NO: 18中所述的人类 IGHV1-3*01框架，其中框架位置38、44和/或48中的一或多者是供体残基。
5. -种对人类a PTCR/CD3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变 区，该重链可变区包含SEQ ID NO: 15或16中所述的CDR及SEQ ID NO: 18中所述的人类 IGHV1-3*01框架，其中框架位置44及48是供体残基。
6. -种对人类a PTCR/CD3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含轻链 可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO: 14中所述的CDR及SEQ ID NO: 19中所述的人类 IGKV3-11*01框架，其中框架位置70和/或71是供体残基。
7. 根据权利要求6的对人类a PTCR/CD3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其 中框架位置46是供体残基。
8. -种对人类a PTCR/CD3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可 变区和轻链可变区序列，所述重链可变区选自包含569 10側:7、569 10側:12及569 10 NO: 13中所述氨基酸序列的重链，所述轻链可变区序列包含SEQ ID NO: 14中所述氨基酸序 列。
9. 一种对人类a PTCR/CD3复合物具有特异性的人源化单克隆抗体，其包含重链可变 区和轻链可变区序列，所述重链可变区选自包含SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16中所述氨 基酸序列的重链，所述轻链可变区序列包含SEQ ID N014中所述氨基酸序列。
10. 根据任何前一项权利要求的人源化抗体，其进一步包含人类来源的恒定区。
11. 根据权利要求10的人源化抗体，其进一步包含减少化丫受体结合的化修饰。
12. 根据权利要求11的人源化抗体，其包含非糖基化化区或5油修饰。
13. 根据权利要求11的人源化抗体，其包含经修饰的糖基化模式。
14. 根据权利要求13的人源化抗体，其包含突变S298N、T299A及Y300S中的一或多者。
15. 根据权利要求14的人源化抗体，其包含突变N297Q、S298N、T299A及Y300S中的两 者或更多者。
16. 根据权利要求14的人源化抗体，其包含多重突变N297Q/S298N/Y300S、S298N/ T299A/Y300S 或 S298N/Y300S。
17. -种核酸，其至少编码根据权利要求1至16中任一项的人源化单克隆抗体的重链 可变区。
18. -种细胞，其表达根据权利要求17的核酸。
19. 根据权利要求1-16中任一项的人源化抗体，其用于抑制受试者中的T细胞介导的 反应。
20. 根据权利要求19的人源化抗体，其中该T细胞介导的反应参与选自W下的状况： 组织移植（tissue transplantation),包括实体器官移植及复合性组织移植，组织移植 (tissue grafting)、多发性硬化及1型糖尿病。
21. -种包含经修饰化的抗体，其中该经修饰化包含减少化丫受体结合的经修饰糖 基化模式，该抗体包含突变S298N、T299A及Y300S中的一或多者。
22. 根据权利要求21的抗体，其包含突变N297Q、S298N、T299A及Y300S中的两者或更 多者。
23. 根据权利要求14的抗体，其包含多重突变N297Q/S298N/Y300S、S298N/T299A/ Y300S 或 S298N/Y300S。
24. 根据权利要求21-23中任一项的抗体，其中该抗体是根据权利要求1至10中任一 项的人源化抗体。
25. -种多特异性抗体，其至少包含根据权利要求1至9中任一项的第一结合域的重链 和对肿瘤特异性抗原具有特异性的第二结合域。
26. 根据权利要求25的多特异性抗体，其至少包含根据权利要求4、5或9中任一项的 结合域的重链。
27. 根据权利要求25或权利要求26的多特异性抗体，其包含抗a PTCR/CD3scFv及抗 肿瘤scFv。
28. 根据权利要求25-27中任一项的多特异性抗体，其具有双特异性。
【专利摘要】本发明系关于包含鼠类抗体BMA031的CDR的人源化单克隆抗体，其结合αβTCR.CD3复合物且具有改良的生物学性质。
【IPC分类】C07K16-28
【公开号】CN104684930
【申请号】CN201280055556
【发明人】D.斯内尔, A.曼拉德, G.拉科西亚, S.尚卡拉, H.邱, C.潘, B.克布尔
【申请人】建新公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2012年9月12日
【公告号】CA2847949A1, EP2755999A2, US20150099861, WO2013037484A2, WO2013037484A3, WO2013037484A8