时，将未发生甲基化的发夹DNA I剪切为单链DNA碎片；向在溶液中加入发夹DNA 11和探针DNA修饰的AuNPs，在37 ° C水浴中反应90分钟，DNA碎片中的reg1n I可与发夹DNA II杂交形成双链，DNA II进而与步骤(2)制备的AuNPs标记的两种探针DNA杂交，使得AuNPs被DNA II连接在一起，而取代出来的reg1n I继续与发夹DNAII杂交进入下一个链替换循环，如此循环，使得大量AuNPs发生聚集，溶液颜色由红色变浅甚至变成蓝色。具体过程如图1所示。
[0015]由图2可见，当溶液中没有发夹DNA II (曲线a和b)或者没有剪切酶HpaII (曲线c)时，AuNPs溶液都为红色且吸光度较大，表明AuNPs处于分散状态。当溶液中存在M.SssI时(曲线d)，甲基化了的DNA I不能被HpaII剪切，故AuNPs依然为分散状态，溶液为红色且吸光度较大。将溶液中的M.SssI失活处理(曲线e)或者溶液中不含M.SssI (曲线f)时，DNA I不能发生甲基化而被HpaII剪切为碎片，被剪切产物reg1nl与发夹DNA II杂交使其开环并形成reg1n I/DNA II双链结构，而后，reg1nl被DNAl/1’探针从reg1n I/DNAII双链结构中取代出来进入下一个循环，而AuNPs则通过DNA II与DNAl/Γ探针的杂交连接起来，使得AuNPs发生聚集而吸收光谱蓝移且吸光度降低。
[0016]采用TEM表征DNA链取代诱导AuNPs的聚集情况。由图3可见，制备的AuNPs的直径约为13nm。当溶液中存在M.SssI时，发夹DNA I发生甲基化而不能被HpaII剪切，所以AuNPs呈分散状态(图3A)。当溶液中不存在M.SssI时，发夹DNA I不能发生甲基化而被HpaII剪切成单链DNA碎片，剪切出来的reg1nl进而与发夹DNA II杂交使其开环而引发AuNPs 聚集(图 3B)。
[0017]实施例2
M.SssI活性检测
(I)DNA I 浓度、DNA 1: DNA I1、SAM 浓度、HpaII 浓度的优化
图4A为DNA I浓度对M.SssI活性检测的影响。由图可见，随着DNA I浓度的增加，无论有还是没有M.SssI时，AuNPs溶液的吸光度均呈现先减小再达到稳定的趋势。当DNA I浓度为40nM，吸光度差值(ΔΑ)达到最大。因此，选择DNA I的最佳浓度为40nM。图4B为DNA I与DNA II的比例对M.SssI活性检测的影响。本发明中，链取代放大效率在一定程度上依赖于 DNA I 与 DNA II 的比例(DNA 1: DNA II)。固定 DNA I 浓度为 40 nM JfDNA 1: DNAII从1:1逐渐增大到1:5，当DNA 1:DNA II为1:3时，有和没有M.SssI时的ΔΑ达到最大值。因此，选择DNA 1:DNA II为1: 3。图4C为SAM浓度对M.SssI活性检测的影响。由图可见，AuNPs溶液的吸光度随着SAM浓度的增加而增大，当SAM浓度超过80 μ M时，吸光度的变化趋于稳定。因此，选择SAM浓度80 μ M为最佳的甲基化反应浓度。图4D为HpaII浓度对Μ.SssI活性检测的影响。向DNA I+M.SssI+SAM+DNAII+DNAl/1’ -AuNPs溶液中加入不同浓度的Hpall，ΛΑ随着HpaII浓度的增加而增大，达到40 U/mL后基本稳定。因此，选择HpaII的最佳浓度为40 U/mL。
[0018](2)在最优实验条件下，采用DNA链取代循环放大技术和金胶聚集变色原理建立的比色传感方法对M.sssl的活性进行定量检测。由图5可见，吸光度随着M.sssl浓度的降低而下降，M.SssI浓度的对数1gC在0.1-50 U/mL范围内与A/A。呈良好的线性，检出限为 0.04 U/mL。
[0019](3)选择性是评价检测方法性能的一个重要指标。Dam甲基转移酶可以甲基化5’ -GATC-3’序列的对称四核苷酸上N6-腺嘌呤，所以，以Dam为干扰酶对本方法的选择性进行评价。由图6可见，经Dam甲基转移酶处理过的样品的吸光度值很低，这是因为Dam甲基转移酶不能甲基化CpG 二核苷酸位点HpaII的识别序列5’ -CCGG-3’，使得发夹DNA I被HpaII剪切而引发AuNPs聚集，与M.SssI浓度为O时所得结果相一致，表明本发明建立的比色传感方法对M.SssI活性检测具有良好的选择性。
【主权项】
1.基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，其特征在于包括以下步骤: (1)制备AuNPs ； (2)制备AuNPs标记的探针DNA； (3)比色传感方法:将20μ L的I XNEBuffer2缓冲溶液、80 μ MS-腺苷甲硫氨酸、40ηΜ发夹DNA I以及不同浓度的M.SssI混合，在37 ° C水浴中反应5小时，使得发夹DNAI部分发生甲基化；将混合物在65。C水浴中加热20分钟使Μ.SssI失活，再加入Hpall，在37 ° C恒温水浴中反应2小时，将未发生甲基化的发夹DNA I剪切为单链DNA碎片；向溶液中加入发夹DNA 11和探针DNA修饰的AuNPs，在37 ° C水浴中反应90分钟，DNA碎片中的reg1n I可与发夹DNA II杂交形成双链，DNA II进而与步骤(2)制备的AuNPs标记的两种探针DNA杂交，使得AuNPs被DNA II连接在一起，而取代出来的reg1n I继续与发夹DNA II杂交进入下一个链替换循环，如此循环，使得大量AuNPs发生聚集，溶液颜色由红色变浅甚至变成蓝色；用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液将反应液稀释到350 yL测定紫外吸收光谱； (4)M.SssI活性检测:根据吸光度与M.SssI浓度的对数的线性关系判断M.SssI浓度。
2.根据权利要求1所述的基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，其特征在于，AuNPs制备方法为:在圆底烧瓶中加入49 mL超纯水和ImL质量百分浓度为2%的HAuCl4.3Η20溶液，加热使之沸腾后，加入ImL质量百分浓度为5%的柠檬酸三钠溶液，持续搅拌并保持沸腾5分钟后，搅拌下使溶液自然冷却至室温，即制备成粒径13 nm且浓度为12 ηΜ的AuNPs，在4°C保存备用。
3.根据权利要求2所述的基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，其特征在于，AuNPs标记的探针DNA的制备过程为:将5.5 ηΜ活化后的探针DNA加入到3 mL步骤(I)制备的AuNPs溶液中，室温下在摇床上震荡12小时，加入磷酸调节溶液中磷酸根的终浓度为9 mM，30分钟后，加入磷酸盐缓冲溶液，在随后的两天内分六次继续加入磷酸盐缓冲溶液，使NaCl的最终浓度为0.3 mM,陈化过夜；在转速15000 rpm下离心15 min，去除上清液，将沉淀分散在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中离心并清洗3次，去除未与Au NPs反应的探针DNA。
4.将修饰好了的DNA-AuNPs分散在2mL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中，在4 0C冰箱中保存备用 根据权利要求3所述的基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，其特征在于步骤(2)中，所述的磷酸盐缓冲溶液均为浓度10 mM、pH 7.0、含2MNaCl0
5.根据权利要求3所述的基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，其特征在于步骤(2)和步骤(3)中，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液均为浓度为10 mM、pH为7.4，含50 mMNaCl。
6.根据权利要求1所述的基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，其特征在于步骤(3)中，lXNEBuffer2缓冲溶液的组成为10 mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、50 mMNaCl、10 mM MgCl2U mM 二硫苏糖醇，pH为7.9。
7.根据权利要求1所述的基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，其特征在于步骤(3)中，所有的发夹DNA在使用前均在90 ° C水浴中加热10分钟再冷却到室温，进行退火杂交。
【专利摘要】本发明公开了一种基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，设计能被CpG甲基转移酶M.SssI和HpaII限制性内切酶识别的颈部含有5'-CCGG-3'序列的发夹DNA I。根据发夹DNA I发生甲基化与否进而能否被HpaII剪切而导致AuNPs发生聚集变色的程度来判断是否存在M.SssI，通过比色法可实现M.SssI的灵敏检测。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-48, G01N21-78
【公开号】CN104694655
【申请号】CN201510120513
【发明人】邱建丁, 钟兆花, 李志美, 梁汝萍
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月19日