一种具有免疫抑制功能的外排体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药学研发、细胞生物学、分子生物学领域，涉及跨膜型TGF-β 1基因修 饰的骨髓未成熟树突状细胞来源的外排体的制备及其在预防和治疗自身免疫性疾病中的 应用。
【背景技术】
[0002] 自身免疫性疾病是因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病，在人 群中有较高的发病率。多发性硬化（Multiple Sclerosis，MS)是常见的主要发生于年轻人 的中枢神经系统脱髓鞘疾病，目前认为，它是与环境以及遗传有关但详细病因不清楚。临床 上，治疗MS的药物主要有IFN-β，格拉默，米托蒽醌，但效果并不理想，且副作用巨大。
[0003] 树突状细胞（Dendritic cells, DCs)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞 (Antigen presenting cells, APCs),它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟 DCsQmmature DCs)具有较强的迁移能力，成熟DCs (mature DCs)能有效激活初始型T细 胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。
[0004] 人体内大部分DCs处于非成熟状态，表达低水平的共刺激因子和粘附因子，体外 激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低，但未成熟DCs具有极强的抗原吞噬能力，在 摄取抗原（包括体外加工）或受到某些因素刺激时即分化为成熟DCs，而成熟的DCs表达高 水平的共刺激因子和粘附因子。
[0005] DCs在成熟的过程中，由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官，与T细胞接 触并激发免疫应答。DCs可以高表达MHC- I类和MHC- II类分子，MHC分子与其捕获加工 的肿瘤抗原结合，形成肽-MHC分子复合物，并递呈给T细胞，从而启动MHC-I类限制性CTL 反应和MHC- II类限制性的⑶4+Thl反应。同时，DCs还通过其高表达的共刺激分子（⑶80/ B7-1、⑶86/B7-2、⑶40等）提供T细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答。
[0006] 鉴于成熟与未成熟的DCs在人体中作用各不相同，近年陆续开发了基于imDCs的 调节免疫反应的潜在药物。然而，由于无法克服MHC-II类分子的限制，这些基于imDCs的 潜在药物对人体均有着不同程度的毒性，且效果较差。
[0007] 因此，本领域迫切需要开发一种能够有效抑制自身免疫反应、调控免疫应答，且安 全、有效的治疗药物。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种来自未成熟树突状细胞的具有膜表达型TGF-βΙ且不受 MHC-II限制的外排体exosomes，能够诱导机体免疫耐受的重建，预防和治疗自身免疫性疾 病。
[0009] 本发明提供了一种跨膜型TGF-βΙ基因修饰的骨髓不成熟树突状细胞来源的 exosomes即mTGF-β 1-EX0,其表达膜型TGF-β 1。在体内外均有一定的免疫抑制作用且能 突破MHC-II的限制，对同种异基因的小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎也有治疗作用，有望 成为治疗自身免疫性疾病的普遍制剂。
[0010] 本发明第一方面，提供了一种外排体（exosomes)，所述外排体具有以下特征： [0011] (a)所述外排体是由未成熟树突状细胞（imDCs细胞）所分泌的囊泡状结构，所述 的未成熟的树突状细胞经外源的膜表达型细胞因子基因的修饰从而表达所述膜表达型细 胞因子；和
[0012] (b)所述外排体携带所述的膜表达型细胞因子。
[0013] 在另一优选例中，所述的外排体直径为50-100nm。
[0014] 在另一优选例中，所述的外排体的囊泡膜的外表面上具有并展示(至少一部分）所 述的膜表达型细胞因子。
[0015] 在另一优选例中，所述的外排体具有抑制MHC-II的活性。
[0016] 在另一优选例中，在所述的未成熟的树突状细胞中，共刺激分子CD80、CD86以及 MHC-II (major histocompatibility complex II)低表达。
[0017] 在另一优选例中，对所述的MHC-II表达的抑制，是由所述的膜表达型细胞因子造 成的或部分造成的。
[0018] 在另一优选例中，所述的外排体还具有以下一种或多种特征：
[0019] (d)所述外排体具有抑制免疫或抑制免疫系统的活性；
[0020] (e)所述外排体表达蛋白包括Hsp70、TsglOU或CD63 ;
[0021] (f)所述外排体不表达内质网分子伴侣蛋白Grp94。
[0022] 在另一优选例中，所述的膜表达型细胞因子包括免疫抑制类的细胞因子，较佳地 包括 TGF-β 1、IL-10、IL-4、FasL 或其组合。
[0023] 在另一优选例中，所述外排体具有以下一种或多种活性：
[0024] (i)诱导Treg细胞（调节性T细胞）生长；
[0025] (ii)抑制Thl细胞极化作用；
[0026] (iii)抑制Thl7细胞分化。
[0027] 本发明第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有安全有效量的本 发明第一方面所述的外排体作为活性成分；和药学上可接受的载体。
[0028] 在另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗组合物。
[0029] 本发明第三方面，提供了本发明第一方面所述的外排体的用途，用于制备预防和/ 或治疗自身免疫性疾病的药物组合物。
[0030] 在另一优选例中，所述的自身免疫性疾病包括中枢神经脱髓鞘病变，较佳地，所述 的中枢神经脱髓鞘病变包括多发性硬化（Multiple Sclerosis MS)、实验性自身免疫性脑 脊髓炎（experimentalautoimmune encephalomyelitis, EAE)、急性播散性脑脊髓炎、弥漫 性脑硬化、视神经脊髓炎以及继发性脱髓鞘病。
[0031] 在另一优选例中，所述继发性脱髓鞘病主要由全身性疾病引起，如早产儿脑室周 围白质软化症等。
[0032] 本发明第四方面，提供了一种用于产生本发明第一方面所述的外排体的未成熟树 突状细胞（Immature Dendritic Cells, imDCs),所述的未成熟的树突状细胞经外源的膜 表达型细胞因子基因的修饰从而表达所述膜表达型细胞因子，并且所述的未成熟的树突状 细胞分泌权本发明第一方面所述的外排体，并且所述的外排体携带所述的膜表达型细胞因 子。
[0033] 在另一优选例中，所述膜表达型细胞因子包括免疫抑制类的细胞因子，较佳地包 括 TGF-β 1、IL-10、IL-4、FasL 等。
[0034] 在另一优选例中，所述的未成熟的树突状细胞MHC-II的表达是受抑制的。
[0035] 本发明第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述外排体的方法，包括步 骤：
[0036] (a)培养本发明第四方面所述的未成熟树突状细胞，从而获得所述未成熟树突状 细胞及其分泌的外排体的混合物；
[0037] (b)将（a)中所述分泌的外排体自所述混合物分离与纯化，从而获得本发明第一 方面所述的外排体。
[0038] 在另一优选例中，所述的分离包括标准四步离心法。
[0039] 本发明第六方面，提供了了一种表达载体，所述的表达载体含有膜表达型TGF-β 1 基因，所述膜表达型TGF-β 1基因包括与膜表达引导序列操作性连接的TGF-β 1基因。
[0040] 在另一优选例中，所述的I旲表达引导序列包括TM蛋白序列和GPI铺定蛋白序列。
[0041] 在另一优选例中，所述的TM蛋白序列包括来自于H08910细胞系的TM蛋白，其序 列如SEQ ID NO. : 1所示；或来自于胃癌细胞系MKN-7,所示胃癌细胞学MKN-7的核酸序列 Genbank登录号为X03363. 1，GI:31197, CDS为175-3939,其中，编码跨膜段蛋白的核苷酸 序列如SEQ ID NO. : 9所示，对应为胃癌细胞系MKN-7的654-678的蛋白，其序列如SEQ ID NO. : 10 所示。
[0042] 在另一优选例中，所述的表达载体为腺病毒载体。
[0043] 在另一优选例中，所述H08910细胞系跨膜段序列核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所 示；其编码的蛋白序列如SEQ ID NO. : 4所示。
[0044] 在另一优选例中，所述TGF-β 1基因序列Genbank登录号NM_011577GI: 6755774， 其序列如SEQ ID NO. : 2所示。
[0045] 本发明第七方面，提供了一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，向所需的 对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的外排体或本发明第二方面所述的药物组合 物。
[0046] 在另一优选例中，所述的对象为哺乳动物，更佳地，为人。
[0047] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0048] 图1显示了 Ad-mTGF-β 1测序峰图。
[0049] 图2显示了重组腺病毒构建策略。
[0050] 图3显示了 Ad-mTGF-β 1感染后BMDCs的表型，即腺病毒感染后用流式细胞术检 测BMDCs表面的蛋白标志物。
[0051] 图4显示了 Ad-mTGF-β 1感染后BMDCs的功能，图4A显示了腺病毒感染后DCs抵 抗LPS诱导IL-12P70分泌的能力；图4B显示了腺病毒感染后DCs的在混合淋巴细胞反应 中的作用。
[0052] 图5显示了 mTGF-β 1-EX0的表型，图5A显示了外排体在电镜下的形态，标尺=200 纳米；图5B显示了应用荧光抗体标记，流式分析外排体的表型；图5C显示了外排体特征性 蛋白的WB检测结果；图显示了流式检测外排体中TGF-β 1的表达情况；图5E显示了预 先吸附抗TGF-β 1单克隆抗体的乳胶颗粒捕捉外排体之后，流式检测乳胶颗粒上CD9的表 达水平。
[0053] 图6显示了 mTGF- β 1-ΕΧ0治疗能够减轻EAE的严重程度，图6Α显示了预防性给 药对EAE发病的影响；图6Β显示了治疗性给药对EAE发病的影响；图6C显示了 EAE小鼠脑 组织经Η&Ε染色观察炎性细胞浸润情况；勒克司坚牢蓝染色观察脱髓鞘情况，放大倍数为 400。
[0054] 图7显示了 mTGF-M-EXO抑制MOG引起的T细胞增殖和Thl极化，图7Α显示了 MOG肽体外刺激EAE小鼠来源的脾细胞或CD4+T淋巴细胞后，AlamarBlue方法检测细胞增 殖情况。图7B显示了 ELISA方法检测MOG肽刺激的脾或⑶4+T淋巴细胞上清中IFN- γ和 IL-10的水平。
[0055] 图8显示了 mTGF-β 1-EX0抑制Thl7的分化。图8A显示了流式检测不同处理组 小鼠血清中IL-17的变化；图8B