、共刺激分子如⑶86、⑶80的表达均很低，符合未成熟DCs的表 型特征。而感染Ad LacZ后并没有使这种细胞的表型特征发生变化，这表明Ad-LacZ不会 影响DCs的成熟。Ad-mTGF-β 1转染后DCs表面的MHC- II、⑶80表达均受到抑制，其中对 MHC-II的抑制作用最明显，尽管Ad sTGF-β 1也能抑制DCs的MHC-II的表达，但是抑制作 用不及前者。
[0129] 实施例5BMDCs感染AdiTGF- β 1后功能的鉴定
[0130] 未成熟DCs表面MHC分子以及CD86等共刺激分子表达水平很低，不能为T细胞提 供必需的活化信号，因此其激活T细胞、诱导免疫反应的能力很弱。未成熟DCs在LPS的刺 激下能够迅速成熟并分泌IL-12。因此为了观察观察BMDCs感染Ad-mTGF-β 1后功能的变 化，本实施例检测了转染不同腺病毒的BMDCs在LPS刺激下IL-12p70的分泌变化及其在混 合淋巴细胞反应中的作用，具体如下：
[0131] I) IL-12p70的ELISA检测：收集上述各组转染腺病毒24小时以及未转染腺病毒 的DCs,并以1 μ g/ml的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)刺激，并设相应的无刺激对照 组，每组3个复孔。继续培养24小时，收集培养上清，以双抗体夹心ELISA法检测IL-12p70 的浓度。
[0132] 2)混合淋巴细胞反应：取BALB/c(H-2Kd)小鼠脾脏，无菌制备小鼠的脾细胞悬液， 磁珠分选出⑶4+T细胞，调整⑶4+T细胞浓度为2X 106/ml，以每孔100 μ 1体积加入96孔 板。取上述转染腺病毒2411后来源于0578176〇1-21〇3)小鼠骨髓的各组0(^，加入5〇1^/1111 丝裂霉素 C，37°C水浴30分钟灭活后，PBS洗两遍，调整其浓度为2 X 105/ml，以DC: T=I: 10， 1:20,1:40加入96孔板，补足培养基使其终体积为200μ 1，每组均设三复孔。37°C孵育4 天后每孔加入20 μ I alamar Blue染料进行染色。继续孵育24小时后以535nm激发波长， 595nm发射波长，检测荧光强度。
[0133] 结果如图4所示所示：
[0134] 图4A表明：转染AdiTGF- β 1和Ad-sTGF- β 1后DCs分泌IL-12p70的水平较对 照组低，经LPS刺激后，未处理的Control DCs和LacZ DCs能迅速成熟，且分泌IL-12p70 的水平明显增高。而Ad-mTGF-β I-DCs和Ad-sTGF-β I-DCs的IL-12p70分泌水平提升幅 度较小，说明DCs转染Ad-m TGF- β 1和Ad S-TGF- β 1后对LPS等致成熟因子有抵抗作用， 但是前者作用要强于后者。
[0135] 图4Β表明：转染了 AdiTGF-β 1和Ad-sTGF-β 1后，DCs刺激T细胞增殖的能力 明显受到抑制。因此经Ad-mTGF- β 1转染的BMDCs具有未成熟DCs的功能特征。
[0136] 实施例6mTGF- β 1-EX0的表型鉴定
[0137] 分离mTGF-β 1-ΕΧ0,并通过透射电镜、Western Blot、流式细胞术对其表型进行了 分析，具体如下：
[0138] 6. 1外排体的电镜分析：外排体悬液用PBS洗两次，用固定液（2%多聚甲醒，0. 25% 戊二醛）4°C固定1小时，用PBS洗一次制成悬液滴片，1%锇酸固定，梯度酒精脱水，经超薄 切片铅铀染色后于投射电镜下观察摄片。
[0139] 结果如图5A所示，我们分离的外排体具有典型的脂质双分子层结构，并且均为直 径集中在50-100nm的小囊泡。
[0140] 6. 2Western blot分析：外排体经BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，于沸水 中煮5min,于12%SDS-PAGE电泳分离，每孔加入20 μ g外排体，电转移至硝酸纤维素膜上， 5%脱脂牛奶封闭后,分别加入小鼠抗小鼠 Hsp70、抗小鼠 Grp94,羊抗小鼠 TsglOl、兔抗小鼠 TGF-β 1多克隆抗体，在4°C下结合过夜小时，PBST充分洗涤，加入相应的二抗结合1.5小 时，按增强化学发光试剂盒说明书进行显影。
[0141] 结果如图5-C所示，其中Lac-Z-EXO与sTGF-β 1-EX0指从分别感染了 Ad-LacZ和 Ad-sTGF-β 1的BMDCs上清中分离纯化出外排体。
[0142] 结果表明，各组外排体均表达外排体相关蛋白Hsp70和TsglOl，⑶63,不表达内质 网分子伴侣 Grp94,且仅有 mTGF- β 1-EX0 和 sTGF- β 1-EX0 表达 TGF- β 1。
[0143] 6. 3外排体表型的FACS鉴定：外排体以饱和的量加入5X10V100 μ 1乳胶颗粒， 室温孵育30min后，加入PBS至终体积为lml，37°C摇床过夜。接着将吸附外排体的乳胶颗 粒均分，分别加入荧光标记抗体：TGF-β UMHC-II、⑶80、⑶86、⑶40以及⑶11c，终浓度为 5 μ g/ml，常温下孵育20min，以PBS洗两遍后，用流式细胞仪进行检测，CellQuest软件分 析。
[0144] 结果如图5B所示：各组外排体均表达小鼠 DCs表面特征性标志分子⑶11c， MHC-II在mTGF-β 1-EX0几乎不表达，⑶80与对照组比也有所下调。这也说明外排体能反 映其所来源的DCs的特性，具有一定的免疫调节作用。
[0145] 6. 4验证TGF-β 1在外排体上的表达形式：在mTGF-β 1-EX0而不是sTGF-β 1-EX0 上检测到TGF-β 1的表达（图OT)。为了进一步验证TGF-β 1在外排体上的表达形式，将5 微升乳胶颗粒与50微克anti-TGF-β 1的单克隆抗体在常温下孵育lh，然后离心，用FCS 封闭，anti-TGF-β ImAb包被的乳胶颗粒与20 μ g的外排体于4°C摇床过夜。PBS洗涤后， 标记PE-anti-⑶9抗体，FACS检测⑶9的表达情况。
[0146] 结果如图5E所示：mTGF-β 1-EX0能被anti-TGF-β ImAb包被的乳胶颗粒捕获， FACS检测CD9表达阳性，而表达分泌型TGF- β 1的sTGF- β 1-EX0则不表达CD9,这更加说 明mTGF-β 1-ΕΧ0中TGF-β 1是膜表达的。
[0147] 实施例7mTGF_ β 1-ΕΧ0预防和治疗能够减轻EAE效果的评价
[0148] 采用小鼠的EAE模型，并应用mTGF-β 1-ΕΧ0对其进行预防和治疗性干预，对其效 果进行了评价。具体如下：
[0149] I) EAE诱导及病情进展评估
[0150] 将M0G35-55(购自上海生工）或PLP18ch199(购自上海生工）与结核菌素与等体积完 全弗氏佐剂混合，反复抽打制成稳定的油包水型抗原乳剂。每只C57BL/6小鼠三点皮下注 射200 μ g的M0G35_55和200 μ g结核菌素，每只Balb/c小鼠三点皮下注射300 μ g的PLP18ch199 和200 μ g结核菌素，并于免疫后第0及48h尾静脉注射200ng肉毒素。
[0151] 采用双盲法对小鼠进行评估，连续观察36天，按下列标准进行神经功能评分：0 分，无异常；1分，尾张力下降低；2分，后肢轻瘫，步态不稳和/或摇摆；3分，后肢不完全瘫 痪；4分，后肢完全瘫痪；5分，为濒死状态，后肢伴前肢瘫痪。我们发现第10天小鼠开始发 病，在第14-16天EAE小鼠发病达到高峰，严重者临床表现为后肢瘫痪，甚至死亡。
[0152] 2) EAE小鼠预防及治疗
[0153] 6-8周的雌性C57BL/6平均分为五组，每组10只，分组如下：
[0154] mTGF-β 1-EX0
[0155] sTGF-β 1-EX0
[0156] LacZ-EXO
[0157] Control-EXO
[0158] No treatment
[0159] 分别在建模前8天、前5天和前2天经尾静脉注射10 μ g/只的各组外排体，在第 〇天诱导EAE，记录评分，观察和比较mTGF- β 1-EX0、sTGF- β 1-EX0对EAE的预防作用。进 一步检测mTGF-β 1-ΕΧ0、sTGF-β 1-ΕΧ0对EAE的治疗作用，在处于发病高峰期的14天、17 天以及21天尾静脉注射与预防组相同剂量的各组外排体，观察评分。
[0160] 结果如图6Α与6Β所示：mTGF- β 1-ΕΧ0和sTGF- β 1-ΕΧ0的预防性干预能明显降 低EAE的评分，但是前者比后者作用更加明显（图6Α)。而EAE建模之后，在第14, 17以及 21天给予mTGF-β 1-ΕΧ0治疗，能够显著改善EAE症状，临床评分与其他治疗组外排体相比 有所降低，部分小鼠甚至能够完全缓解（图6-Β)。
[0161] 3) EAE小鼠组织病理学检测
[0162] 于治疗两周后，4%多聚甲醛心脏灌注，迅速分离脑组织，4%中性甲醛固定液固定， 石蜡包埋后制成6微米厚切片，常规苏木素-伊红（HE)染色及焦油紫染色（Luxol fast blue，LFB)，并在光镜下观察炎性细胞浸润及脱髓鞘改变情况。
[0163] 结果如图6C所示：mTGF- β 1-EX0明显降低EAE小鼠侧脑室炎症细胞浸润以及脱 髓鞘情况，而经sTGF- β 1-ΕΧ0治疗组则无此作用。
[0164] 结论：以上结果表明mTGF-β 1-ΕΧ0具有强有力的免疫抑制能力，能够有效地预防 和抑制C57BL/6小鼠的EAE的发生发展。
[0165] 实施例8mTGF- β 1-ΕΧ0抑制MOG引起的T细胞增殖和Thl极化效果的评价
[0166] 自体反应性T细胞和Thl细胞与EAE的进展密切相关，因此本实施例观察了 mTGF-β 1-ΕΧ0对MOG引起的T细胞增殖和Thl极化效果的影响。
[0167] 方法：
[0168] Exosomes治疗两周后，分离各治疗组小鼠脾脏细胞和⑶4+Τ细胞，2Χ IO5/孔铺 于96孔板，并加入10 μ g/ml的M0G35_55，在CD4+T细胞组，以1 :10的比例每孔加入2Χ IO4 个丝裂霉素 C灭活的DCs细胞，每组设三个复孔，培养48小时后加入20 μ I alamarBlue， DTX880multimode detector(Beckman Coulter, PaloAlto, CA)检测其突光强度。在相同 的培养条件下培养72小时后收集各组上清，ELISA检测各组上清中IL-10、IL-6、IL-17和 IFN-γ的表达量。
[0169] 结果表明：当用10 μ g/ml MOG肽体外刺激3天之后，可以观察到mTGF-β 1-EX0治 疗的EAE小鼠来源的脾脏及CD4+T淋巴细胞增殖，与其它治疗组小鼠相比，明显被抑制（图 7A)。此外，mTGF- β 1-EX0治疗还能够抑制MOG肽体外刺激的EAE小鼠来源的脾脏及CD4+T 淋巴细胞IF