sis，MS)发病机理和治疗方案的重 要的实验模型。
[0085] 研究表明，用M0G35_55免疫树突状细胞TGF- β受体信号失活小鼠，发现其中神经系 统有大量的T细胞浸润，外周有高水平的Thl和Thl7细胞因子，EAE症状不能缓解。与有 自身免疫倾向的MOG-TCR小鼠杂交后，表现出以早期大量活化的髓磷脂特异性T细胞、小胶 质细胞浸润，小鼠运动失调，过早死亡为特点的自发性的EAE症状。
[0086] 经鼻饲给予一定剂量的TGF-β 1能抑制延迟-复发型EAE，进一步研究表明这是通 过TGF-β 1抑制DCs产生一氧化氮来实现的，后者又可以诱导T细胞凋亡。TGF-β 1还可以 通过SmacM促进具有免疫调节作用的IL-10+IFN γ +的Thl细胞产生，后者通过分泌IL-10 来阻止Thl和Thl7等炎性细胞募集到中枢神经系统，从而缓解EAE症状。
[0087] 药物组合物
[0088] 本发明还提供了一种药物组合物。所述的药物组合物含有药学上可接受的载体 (包括稀释剂、赋形剂等）以及有效量的本发明外排体作为活性成分。本发明外排体的数量 通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
[0089] 如本文所用，术语"有效量"指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是 表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和 健康状况、病征的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。
[0090] 为了本发明目的，有效的剂量为给予个体约0. 01毫克/千克至50毫克/千克，较 佳地0. 05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明外排体。
[0091] 药物组合物还含有药学上可接受的载体。术语"药学上可接受的载体"指用于治 疗剂（例如外排体）给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接 受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域技术人员所 熟知的。
[0092] 治疗性药物组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。 另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。此外，免 疫组合物中还可以含有免疫佐剂。
[0093] 通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成注射前适 合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
[0094] -旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动 物，尤其是人。
[0095] 本发明的含外排体的治疗或预防性药物组合物，可以经口服、皮下、皮内、腔内、病 变部位、关节内、静脉注射托该方式应用，治疗剂量方案可以是单剂方案也可以是多剂方 案。
[0096] 本发明的有益效果：
[0097] 1.本发明外排体具有良好的免疫抑制的效果，从而治疗自身免疫性疾病。
[0098] 2.本发明外排体囊泡膜具有或展示有膜表达型TGF-β 1，能够有效抑制免疫细胞 增殖、分化，诱导Treg细胞分化，并治疗ΕΑΕ。
[0099] 3.本发明外排体能够抑制MHC-II的表达，从而不受MHC-II限制，充分发挥抑制免 疫的效果，安全、有效。
[0100] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0101] 实施例1含有膜表达型TGF-β 1基因的重组复制缺陷的腺病毒载体的构建，及重 组腺病毒Ad-mTGF- β 1的包装
[0102] 方法：
[0103] 通过PCR扩增的方法，以3LL细胞（由上海第二军医大学免疫所赠送）的cDNA 为模板，根据人TGF-β 1全长基因序列计引物，从卵巢癌细胞系Η08910细胞（由上海第二 军医大学免疫所赠送）中提取其总RNA，逆转录后cDNA为模板，用两条针对Cerb-B2基因 序列（Genbank 登录号：M11730.1 ;GI: 183986)中编码跨膜（Transmembrane，TM)区片段 (2041-2161位）的特异性引物（如SEQ ID NO. :7和8所示），PCR扩增TM片段；采用剪接 重叠延伸（Splicing Overlap Extension, S0E)法连接TGF-βΙ和TM两个基因片段；融合 基因 TM-TGF-β 1与克隆载体pDC315定向连接。
[0104] 测序正确后，将有目的基因 mTGF-β 1重组穿梭质粒和带病毒骨架的质粒共转染 包装细胞Hek293,通过同源重组获得重组腺病毒(见附图1)。具体如下：
[0105] 1)从3LL细胞中提取总RNA，用TGF-β 1弓丨物
[0106] Forward :5'-ATTGAATTCATGCCGCCCTCGGGGCTGCGGCTAC-3'（SEQ ID NO. :5);
[0107] Reverse :5,-GCTCTCTGCTCGGCGCTGCACTTGCAGGAGCGCA-3,（SEQ ID NO. :6)进行逆 转录；
[0108] 从H08910细胞中提取总RNA，用TM引物进行逆转录
[0109] Forward :5'-TGCGCTCCTGCAAGTGCAGCGCCGAGCAGAGAGC-3'（SEQ ID NO. :7);
[0110] Reverse :5'-CGTGTCGACCGTGTACTTCCGGATCTTCTGCTGC-3'（SEQ ID NO. :8)。
[0111] TGF-β 1 片段 PCR 反应条件为：95°C 5min ;94°C 30s，60°C 30s，72°C 80s，扩增 35 个循环；72°C 10min。
[0112] TM片段PCR 反应条件为：95°C 5min ;94°C 30s，63°C 30s，72°C 11s，扩增 35 个循环； 72°C 10min。PCR完毕后，切取相应条带，凝胶回收。
[0113] 2)测凝胶回收后的TGF-β 1和TM的浓度，按等摩尔比加入二者，以TGF-β 1的前 链和TM段的后链为引物，进行搭桥PCR，构建融合基因 mTGF-β 1。
[0114] PCR 反应条件为 95°C 5min ;80°C 3min ;94°C 30s，55°C 40s，72°C 90s，扩增 35 个循 环；72°C lOmin。
[0115] 3)凝胶回收目的条带，用内切酶ECOR I和SaL I酶切pDC315质粒和TGF- β I-Tm 后，16°C连接过夜，YC转化法转化后随机挑选6个菌落作PCR鉴定，对应菌落摇菌。16h后 提取PCR鉴定阳性的细菌的质粒，做酶切鉴定，阳性者送公司进行双向测序，结果见图2。
[0116] 4)转染前24h Hek293以4X 105个/孔铺板，待细胞融合度大于80%后换无血清 DMEM培养基lml，同时按说明书加入脂质体10微升，3μ g pBHGloxAEl、3y gCre(由上海 第二军医大学免疫所赠送），2 μ g的含有TGF- β I-Tm基因片段的pDC315, 6小时后补完全 DMEM培养基lml。观察细胞变化，及时补液。10天后，收集细胞及上清，进行PCR鉴定和流 式鉴定。
[0117] 实施例2 =BMDCs的诱导、扩增及腺病毒感染
[0118] 培养BMDCs，用Ad-mTGF- β 1感染24小时后，将残余腺病毒用PBS洗净，BMDCs继 续培养48小时，收集上清，用于提取mTGF- β 1-ΕΧ0。具体操作如下：
[0119] I) BMDCs的培养：树突状细胞来源于正常的六周雌性C57BL/6(H-2Kb)小鼠，无菌 取出小鼠股骨和胫骨，用无血清RPMI1640冲出骨髓细胞，经Tris-MMCl破除红细胞后，于 含 10% 胎牛血清 RPMI1640 中培养，加 20ng/ml 的 GM-CSF，lng/ml 的 IL-4 于 37°C，5%C02 中 培养48小时后，用预温的培养基洗去非贴壁细胞，贴壁细胞用DC培养基继续培养48小时， 轻轻吹打收获第五天的DCs即为未成熟DCs。
[0120] 2)Ad-mTGF- β 1感染BMDCs :培养第五天的DCs准确计数，然后用Ad-sTGF- β 1 (分 泌型 TGF-β 1)和 Ad-mTGF-β 1 (跨膜型 TGF-β 1)或 Ad-Lac Z 以 MOI (multiplicity of infection, MOI) =100转染细胞，并设不转病毒的空白对照组。
[0121] 转染过程如下：1X l〇Vml DCs以无血清培养基重悬于2ml的eppendorf管中，加 入相应的病毒液，于37°C恒温摇床以60转每分钟摇2小时。2小时后以2X 106/ml补足完 全培养基，置37°C培养箱继续培养18h后离心去除培养基，并用PBS洗两次以洗去残留的病 毒。之后细胞在DC培养基继续培养，培养基中所含胎牛血清事先经100, OOOgX Ih超速离 心去除了血清来源外排体。48小时后，收集细胞用于表型和功能的分析，并保存细胞培养上 清用于细胞因子的检测及外排体的制备。
[0122] 实施例3 :mTGF_ β 1-EX0的分离与纯化
[0123] 将前述保留的细胞培养上清采用标准四步离心法制备外排体。具体如下：
[0124] 4°C下，高速离心 300gX10min、1200gX20min、10000gX20min，去除细胞碎片以 及其它凝集物质；然后超速离心1000 OOgX60min，所获沉淀以大量PBS重悬再次超速离心 100000gX60min以除去残余培养基，所得沉淀即为较纯的外排体。外排体以少量PBS重 悬，采用BCA法测定其蛋白含量。分离得到的外排体经分装后置于-80°C保存。
[0125] 实施例4BMDCs感染Ad-mTGF- β 1后表型的鉴定
[0126] 用流式细胞术检测了转染不同腺病毒并继续培养24小时后的DCs的表面分子的 表达，操作如下：收集不同处理组的DCs，IX IO6的DCs细胞重悬于100 μ I PBS中，按照说 明书要求加入相应剂量的荧光标记抗体：MHC-II、⑶80、⑶86、⑶40以及⑶11c，冰上孵育 30min，然后用PBS洗三遍后，用流式细胞仪进行检测，CellQuest软件分析。
[0127] 结果如图3所示：其中，Ad-sTGF- β 1和Ad-LacZ分别表示用含有分泌型TGF- β 1 和LacZ序列的腺病毒感染的对照组，Control为无腺病毒感染组。
[0128] 结果表明，各组均表达小鼠 DCs表面标志分子⑶lie,未转染腺病毒的Control组 DCs其表面MHC- II类分子