2表达水平以及HER2、AKT的磷酸化水平基本不变，不仅如此，经荷瘤小鼠实验发现，经抗体给药处理，与普通的人乳腺癌细胞株BT-474相比，本发明公开的曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR在小鼠体内的生长速度更为稳定。本发明公开的曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR既保留了其亲本细胞株的HER2过表达特性，又对HER2靶向抗体药物曲妥珠单抗表现出很强的体外和体内耐药性，因此可直接用于新的抗肿瘤治疗药物的开发和研宄。
[0014]作为进一步的优选方案:所述步骤2先是每隔3-4天更换一次含有曲妥珠单抗浓度为10ug/ml的新鲜培养基，直至细胞生长至80%满度时，用浓度为0.25%胰酶消化传代，连续处理2个月后，再分2-4次逐步增加培养基中曲妥珠单抗的有效浓度。由于初期培养时，可见细胞的生长非常缓慢，因此先采用含同等浓度的曲妥珠单抗的培养基对细胞进行培养，这样有助于培养得到可在该浓度条件下稳定生长的细胞，进而为后序培养出目标细胞株提供保障。
[0015]优选的，所述步骤2是分3次逐步增加培养基中曲妥珠单抗的有效浓度:将曲妥珠单抗的有效浓度增加至20ug/ml，连续培养2个月；曲妥珠单抗的有效浓度增加至50ug/ml，连续培养2个月；曲妥珠单抗的有效浓度增加至100ug/ml，连续培养4个月，获得可稳定生长、传代、冻存和复苏的曲妥珠单抗耐药的BT474细胞，采用梯度增加曲妥珠单抗的有效浓度的方法来进行目标细胞株的构建，这样得到的曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR更加稳定。
[0016]更为具体的方案为，所述步骤1-4中所用的培养基为含有10%特级胎牛血清的RPMI 1640培养基。
[0017]本发明的第三个目的是提供一种上述曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR在构建体外及体内肿瘤耐药模型中的应用。
[0018]本发明的第四个目的是提供一种上述曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR在筛选抗肿瘤药物中的应用。
[0019]本发明的最后一个目的是提供一种上述曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR在开发肿瘤耐药逆转药物中的应用。
[0020]总体上来说，基于本发明公开的曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR对曲妥珠单抗在体外和体内都表现出很强的耐药性，因此其可以广泛应用于肿瘤耐药模型的构建、抗肿瘤药物的筛选以及肿瘤耐药逆转药物研宄开发，其具有较高的科研和生产应用价值。
【附图说明】
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[0021]图1是曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR和普通的人乳腺癌细胞株BT-474在显微镜下的细胞形态观察图；
[0022]图2是曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR和普通的人乳腺癌细胞株BT-474的体外增殖曲线；
[0023]图3是曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR和普通的人乳腺癌细胞株BT-474的HER2受体表达水平；
[0024]图4是曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR和普通的人乳腺癌细胞株BT-474的HER2受体和下游信号通路的活化检测结果；
[0025]图5是曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR和普通的人乳腺癌细胞株BT-474的体内肿瘤生长曲线；
[0026]图6是Her2人源化抗体药物HuA21对曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR的体外增殖抑制作用；
[0027]图7是Her2人源化抗体药物HuA21对曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR的体内肿瘤生长抑制作用。
【具体实施方式】
[0028]以下结合实施例1-8对本发明公开的技术方案作进一步的说明:
[0029]实施例1:曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR的构建
[0030](I)复苏普通的人乳腺癌细胞BT-474至T25培养瓶中，加入含10%特级胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，所述T25培养瓶置于37°C、5%的C02培养箱中，取对数生长期细胞，加入曲妥珠单抗(购自Roche公司，规格320mg/支)至有效浓度为10ug/ml，然后每隔3-4天更换含有同等浓度曲妥珠单抗的新鲜培养基，待细胞生长至80%满度时，用浓度为0.25%的胰酶消化，传代至新的T25培养基中培养，如此连续处理2个月；
[0031](2)分3次逐步增加培养基中曲妥珠单抗的有效浓度:将曲妥珠单抗的有效浓度增加至20ug/ml，连续培养2个月；曲妥珠单抗的有效浓度增加至50ug/ml，连续培养2个月；曲妥珠单抗的有效浓度增加至lOOug/ml，连续培养4个月，存活细胞可以在此浓度条件下稳定生长、传代、冻存和复苏，即获得通过体外诱导的曲妥珠单抗耐药的BT-474细胞；
[0032](3)复苏步骤2通过体外诱导得到的曲妥珠单抗耐药的BT-474细胞，扩增至T175培养瓶中，用浓度为0.25%的胰酶消化后，加入含10%特级胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞数为每10ul含5X 16个，加入等体积的Matrigel (购自Sigma公司)混勾，注射到预先埋有0.36mg雌激素片的裸鼠第二乳房垫部位，待肿瘤平均体积达到150-200mm3后，给予裸鼠尾静脉注射10mg/kg剂量的曲妥珠单抗，每周一次，连续给药I个月，选取其中肿瘤生长迅速的裸鼠，C02处死裸鼠，剥离肿瘤组织，切成直径约0.5mm的小块，加入含有Img/ml的胶原酶(购自上海生工公司)，置于37°C、5% C02的培养箱中I温育消化h，用150目筛网过滤，将过滤得到的原代肿瘤细胞悬液置于T25培养瓶，加入含有lOOug/ml曲妥珠单抗的培养基，连续培养和传代I个月；
[0033](4)将步骤3培养得到的细胞再次注射到裸鼠体内，重复步骤3给予裸鼠的曲妥珠单抗处理、以及原代肿瘤细胞的分离和培养，直至获得稳定生长、传代、冻存和复苏的细胞，即为曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/HR。
[0034]实施例2:细胞株的形态学观察
[0035]样品组曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞BT-474/HR和对照组普通的人乳腺癌细胞BT-474经0.25%胰酶消化后，分别接种于6孔细胞培养板，每孔含有5 X 105个细胞，加入含10%特级胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37°C、5% C02的培养箱中培养24h，取对数生长期细胞，更换含有10ug/ml曲妥珠单抗的培养基，继续在37°C、5% C02的培养箱中培养72h后，在倒置相差显微镜下拍照，观察活细胞的形态，结果如图1所示，在未加曲妥珠单抗条件下，曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞BT-474/HR(以下简称细胞BT-474/HR)和普通的人乳腺癌细胞BT-474 (以下简称细胞BT-474)的形态基本相似，细胞较为伸展，细胞边缘较规则，加入曲妥珠单抗处理后，细胞BT-474/HR的形态变化不明显，而细胞BT-474缩小成圆形细胞团，其贴壁和伸展受到严重影响，由此可见，与对照细胞BT-474相比，本发明公开的细胞BT-474/HR对曲妥珠单抗具有很强的体外耐药性。
[0036]实施例3:细胞株的体外增殖、以及其对曲妥珠单抗的敏感性测定
[0037]样品组细胞BT-474/HR和对照组细胞BT-474经0.25%胰酶消化后，分别接种于7块96孔细胞培养板中，其中1-7号培养板分别用于培养加曲妥珠单抗处理第1、2、3、4、5、6和7天时的上述两种细胞，每种细胞各接种12个孔，每孔含有I万个细胞，加入100 μ L含有10%特级胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37°C、5% C02的培养箱中培养24h后，更换新鲜培养基(其中6个接种细胞BT-474/HR和BT-474的培养板的新鲜培养基中加有10ug/ml的曲妥珠单抗)，并将此时时间记为0，置于37°C、5% C02的培养箱中培养24h后，按照CCK-8试剂盒(购自上海东仁化学公司)的说明方法将显色液加入到I号培养板培养细胞的孔中，在培养箱中继续培养2h后，用酶标仪测定490nm吸光度值，采用同样的方法测量2、3、4、5、6和7号培养板的490nm吸光度值，以曲妥珠单抗处理时间为横坐标，490nm吸光度值为纵坐标，绘制细胞增殖曲线，结果如图2所示:从图中可以看出，细胞BT-474/HR和BT-474的倍增时间分别为70h、66h，两者的倍增时间无明显差异，加入